核桃肽對幼年小鼠學習記憶能力的影響

杜倩 烏蘭 劉睿 樊蕊 陳啟賀 任金威 李勇

嬰幼兒時期是人類生長發育的黃金時期，而神經系統的發育主要集中在這一時期，大腦的重量可發育達到成人期的75%，3周歲時腦發育基本完成[1-2]。神經系統的發育不僅影響著嬰幼兒生理和心理的整體發展，還影響著成年后的智力水平和身心健康。因此，對促進幼年時期神經發育的功能物質的探索與研究成為熱點。

核桃(juglans regia L.)，又名胡桃，在我國廣泛栽培，年產量居世界首位[3]。核桃富含不飽和脂肪酸、蛋白質、維生素及礦物質，其蛋白質中含有的氨基酸構成合理，具有極高的營養價值。核桃肽(walnut peptides，WP)是通過生物酶解技術從核桃中獲得具有顯著活性的小分子物質，不經消化即可被人體吸收，吸收效率比單一氨基酸更高[4]。核桃及其加工產品因其促進認知及學習記憶能力的功效，被奉為傳統的補腦佳品。目前實驗證明，核桃飼養可提高發育期小鼠的腦發育，增強其學習記憶能力[5]。也有研究證實從核桃中提取的以瓜氨酸為主要成分的多種氨基酸混合物對小鼠的學習記憶能力有改善作用[6]。但對于生物效價極高的WP對幼年小鼠學習記憶的影響尚無研究報道，因此，本實驗對幼年小鼠采用不同劑量的WP進行干預，探討WP對學習記憶功能的影響，為WP在嬰幼兒功能食品中的應用提供實驗依據。

材料和方法

一、材料

1.核桃肽(WP)：淡黃色固體粉末，主要成分為分子量小于1 000的小分子低聚肽，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、亮氨酸含量較多，由北京天肽生物科技有限公司提供。

2.實驗動物：初斷乳SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重10～12 g，由北京大學醫學部實驗動物科學部提供(實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2011-0012)，于屏障級動物室飼養，溫度范圍(22±2)℃，相對濕度50%～60%，晝∶夜=12h∶12h。

3.主要儀器：Morris水迷宮系統(中國醫學科學院藥物研究所)，小鼠電刺激跳臺儀(中國科學院上海藥物研究所)，程控小鼠穿梭箱(中國醫學科學院藥物研究所)。

二、方法

1.動物分組和飼養：小鼠適應性喂養1周，按照體重隨機分為4組，空白對照組給予普通飲水，WP干預組分別給予低、中、高濃度WP(濃度依次為110 mg/kg·bw、220 mg/kg·bw和440 mg/kg·bw)，均隨飲水攝入。所有動物均自由飲水進食，并記錄每日飲水量、進食量及體重增長，干預30 d后進行行為學實驗。

2.開闊場實驗(Open-field Test)：采用木制箱，規格為45 cm×45 cm×45 cm，內襯黑色墊紙，底部為白色，并畫有5×5正方格。實驗時將小鼠輕輕放入中央格中，記錄5 min內小鼠的跨格次數、站立次數、進入中央格的次數、中央格停留時間和外周格停留時間等。

3. Morris水迷宮實驗(Morris Water Maze)：實驗時將平臺置于第一象限中央，加水至高于平臺1～1.5 cm，水溫保持在(21±1)℃，為避免小鼠看到平臺，在水中加入二氧化鈦。整個實驗過程分為定位航行實驗(place navigation test)和空間探索實驗(spatial probe test)兩部分。

(1)定位航行實驗：用于測量小鼠在水迷宮中的學習和記憶能力，實驗歷時6 d。測試時，每天小鼠分別從東、西、南、北4個象限面向池壁輕輕放入水中，每次測試間隔5 min，記錄小鼠從入水到找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)、游泳路程和游泳速度，4次成績的平均值作為當日最終成績進入最后統計分析。如果小鼠在60 s內未找到平臺，則由實驗者將其引導至平臺并在平臺上停留10 s，逃避潛伏期記為60 s。

(2)空間探索實驗：用于測量小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力，第7天撤去平臺，將小鼠從第三象限的任選一點放入水中，記錄60 s內小鼠在目標象限(定位航行實驗中平臺所在象限)的停留時間及準確穿越平臺所在位置的次數。

4.跳臺實驗(Step-down Test)：跳臺測試儀有5個測試室，室底銅柵可通電，每個測試室右后角放置一個高5 cm、直徑5 cm的橡皮平臺作為動物回避電擊的安全區。實驗時先將小鼠放入反應箱內(平臺上、平臺下)適應環境3 min，然后將其放在銅柵上，通以32 V的交流電，觀察小鼠受到電擊跳回平臺以及再次跳至銅柵上的情況。如此訓練5 min，記錄每只小鼠受電擊的次數或稱錯誤次數(EN1)，以此作為學習成績。24 h后進行重復測驗，將小鼠置于平臺上，記錄各鼠第一次跳下平臺的時間，即停留潛伏期(step-down latency，SDL)和各鼠5min內的錯誤次數(EN2)，以此作為記憶成績。若5 min內小鼠未跳下平臺，潛伏期按5 min計算。停止實驗5 d后再進行一次重復實驗，記錄上述指標，作為記憶消退階段的成績。

5.穿梭箱實驗(Shuttle Test)：實驗時將小鼠放入穿梭箱內任何一側適應3 min，進行10 s聲光刺激，如動物不逃至另一端，聲光刺激后給予電刺激(0.2 mA，50 Hz，AC)，持續10 s，小鼠在遭電擊后即跑到對側，此為被動回避反應(passive avoidance reaction，PAR)。在每次電擊前給予條件刺激，反復強化后，聲音刺激后小鼠即能完成穿梭動作為主動回避反應(active avoidance reaction，AAR)，不能逃避的即為失敗(fail)。連續訓練4 d，每天10次，每次間隔15 s。記錄主動回避次數及被動回避次數。

6.抗氧化性檢測：行為學檢測結束后，摘除小鼠眼球采血，3 000 rpm/10 min分離血清。測定血清中總的超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量。

7.統計學處理：應用SPSS統計軟件進行分析，實驗結果采用均數±標準差表示。水迷宮實驗逃避潛伏期、穿梭箱實驗主動回避與電擊次數采用重復測量方差分析(one-way repeated measures ANOVA)，其他數據如果具有方差齊性，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；若方差不齊，采用非參數檢驗；兩組間比較采用最小顯著差異法(LSD)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、WP對小鼠飲水量、進食量、體重、腦重的影響

在實驗干預過程中，各組小鼠的飲水量、進食量組間差異無統計學意義。各組小鼠干預前體重、干預結束后體重、腦重和腦體比差異均無統計學意義，見表1。

二、開闊場實驗

在開闊場實驗中，各組小鼠站立次數和跨格次數、進入中央格次數及停留時間差異均無統計學意義，見表2。

表1 WP對幼鼠飲水量、進食量、體重、腦重和腦體比的影響

表2 WP對幼鼠自主活動能力和情緒反應的影響

三、Morris水迷宮實驗

定位航行實驗結果見圖1，隨著時間的延長，各組小鼠的逃避潛伏期均表現出降低的趨勢(F=11.128，P<0.001)；不同組別的逃避潛伏期差異有統計學意義(F=3.018，P=0.025)，WP高劑量組逃避潛伏期較空白對照組短，差異有統計學意義。

空間探索實驗如表3所示，第7天小鼠在目標象限的停留時間差異有統計學意義(F=2.708，P=0.039)，WP中劑量組小鼠的目標象限停留時間高于空白對照組；各組小鼠的穿臺次數差異有統計學意義(χ2=11.298，P=0.023)，與空白對照組相比，WP中、高劑量組小鼠的穿臺次數增加。

圖1 各組小鼠逃避潛伏期隨時間的變化趨勢

組別目標象限停留時間(s)穿臺次數空白對照組18 08±12 371 30±1 50WP低劑量組20 60±8 461 60±1 80WP中劑量組32 36±13 53?3 70±3 30?WP高劑量組27 16±11 184 80±3 60?

注：與空白對照組比較，*P<0.05

四、跳臺實驗

跳臺實驗結果如圖2所示，在24 h測試時，各組小鼠錯誤次數差異有統計學意義(F=2.870，P=0.031)，WP低、高劑量組錯誤次數低于空白對照組；各組停留潛伏期差異有統計學意義(F=4.952，P=0.002)，與空白對照組相比，三個干預組停留潛伏期均較長。實驗結束5 d后重復測試，各組小鼠錯誤次數(χ2=14.05，P=0.007)和停留潛伏期(χ2=15.071，P=0.005)差異均有統計學意義，其中WP中劑量組的錯誤次數比空白對照組少，同時停留潛伏期較長。

注：與空白對照組比較，*P<0.05圖2 WP對幼鼠跳臺實驗的影響

五、穿梭箱實驗

穿梭箱實驗結果如圖3所示，隨著時間的延長，各組小鼠的主動逃避次數均逐漸增加(F=24.647，P<0.001)，各組的電擊次數同樣逐漸減少(F=14.570，P<0.001)；不同組別主動回避次數(F=4.886，P=0.002)和電擊次數(F=4.641，P=0.003)差異有統計學意義，三個干預組組小鼠的主動回避次數高于空白對照組，電擊次數低于空白對照組，組間差異有統計學意義。

圖3 各組小鼠的主動回避次數和電擊次數的變化趨勢

六、抗氧化性檢測

對小鼠血清抗氧化指標分析結果顯示，WP低、中、高劑量組血清T-SOD與GSH-Px活性相比空白對照組升高，差異有統計學意義。對小鼠血清中氧化產物分析結果顯示，WP低、中、高劑量組血清丙二醛濃度均低于空白對照組，差異有統計學意義，見表4。

表4 WP對幼鼠血清抗氧化指標的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05

討 論

嬰幼兒時期的腦發育基本完成，因此，促進腦部發育，改善幼年學習記憶的發生發展十分重要，許多對學習記憶有促進功能的食品成為研究熱點。

核桃自古被中醫奉為健腦佳品，近年來才有研究證實核桃具有改善學習記憶的功效。張清安等針對核桃中健腦的功能成分展開研究，證實核桃油中的多不飽和脂肪酸有顯著的益腦功效[7]。大量研究證實多不飽和脂肪酸如α-亞麻酸、二十二碳六烯酸(DHA)等可以促進神經發育、改善學習記憶[8-10]。同時樊永波等[11]對脫脂的核桃餅粕進行研究，對其學習記憶的促進作用也得到肯定的結果，發現精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量較高的核桃蛋白也是增強學習記憶功能的有效成分。研究表明，谷氨酸、天冬氨酸是哺乳動物體內不可缺少的興奮性神經遞質，與學習和記憶的形成密切相關[12-13]。

Morris水迷宮定位航行實驗用于測量小鼠在水迷宮中的學習和記憶能力，空間探索實驗用于測量小鼠對平臺空間位置的記憶保持能力。本研究中，消除由于小鼠自主活動能力和情緒反應不同而影響行為學實驗結果的可能，WP的干預可使小鼠的逃避潛伏期低于空白對照組，而WP中、高劑量組目標象限停留時間、穿臺次數均增加，以上結果可以說明WP干預幼年小鼠可以增強小鼠學習和空間記憶能力，同時，也可以延緩小鼠空間記憶的衰退，干預效果有一定的劑量反應關系。跳臺實驗中，小鼠受到電擊，應逐漸學會跳回平臺以避免傷害性刺激。訓練后24 h測試WP低、高劑量組錯誤次數降低、停留潛伏期延長，5 d后再次測試，WP中劑量組對電擊的記憶消退較慢。穿梭箱實驗過程中，隨著時間的推移，各組小鼠的逃避反應增加，證明學習效果在不斷增強；與空白對照組相比，三個劑量的WP干預后，小鼠的主動回避次數增多，受到電擊次數減少，有一定的劑量反應關系，提示WP的干預增強了小鼠對電刺激的記憶。以上行為學實驗結果均為陽性，證明WP可以提升小鼠的空間學習記憶能力、主動和被動回避能力，這與對核桃及其提取物的研究結果相同[5-6]。

腦組織中的主要成分之一不飽和脂肪酸含量豐富，極易受到脂質過氧化的損傷，影響腦發育和腦功能[14]。SOD與GSH-Px都可催化體內清除自由基過程，保護細胞膜正常功能進行，而MDA是脂質過氧化的最終產物。本研究血清抗氧化性測定顯示，WP的干預使抗氧化物質T-SOD及GSH-Px與空白對照組相比活性升高，同時氧化產物MDA水平降低，表明WP可顯著提高組織抗氧化性，增強清除氧自由基的能力，進而推斷WP可能通過減少不飽和脂肪酸的氧化損傷，促進腦發育，提高學習記憶能力，但其分子機制需要進一步證實。林海生等研究發現，體內抗氧化指標與學習記憶行為學指標存在著緊密的相關性，提示牡蠣蛋白肽可能通過其抗氧化活性而改善學習記憶功能[15]。

目前，許多研究提示一些生物活性肽具有改善學習記憶的功能，林海生等[15]發現牡蠣蛋白肽能夠增強正常小鼠的空間學習和記憶能力；裴新榮等[16]發現海洋膠原肽可預防快速老化小鼠學習記憶功能的下降；徐琳琳等[17]進行一系列行為學實驗發現乳源性活性肽能夠改善學習記憶能力。本研究中WP有類似的功能，能夠促進幼年小鼠的學習記憶能力。該研究結果為嬰幼兒奶粉中添加WP或開發WP嬰幼兒食品、輔食提供實驗依據。WP影響學習記憶能力的機制，可能與其抗氧化性有關，還可能存在其他機制，均有待進一步研究。

1 季成葉.兒童少年衛生學.第7版.北京:人民衛生出版社,2012.

2 桂永浩，薛辛東.兒科學.第3版.北京:人民衛生出版社,2015.

3 鄧金龍.我國核桃生產現狀及發展策略.林產工業,2016,43:56-58.

4 李勇，蔡木易.肽營養學.北京:北京大學醫學出版社,2007.

5 虞立霞，姚奎章，夏君霞，等.核桃對發育期小鼠認知功能的改善作用.營養學報,2015,37:185-188.

6 趙海峰，李學敏，肖榮.核桃提取物對改善小鼠學習和記憶作用的實驗研究.山西醫科大學學報,2004，35:20-22.

7 張清安，李建科，范學輝.核桃油對小鼠學習記憶能力的影響.陜西師范大學學報(自然科學版),2006，34:89-91.

8 田楓，齊曉旭，鄭振輝.α-亞麻酸對大鼠學習記憶功能和海馬神經元的影響.中國老年學雜志,2009，29:664-666.

9 Zicker SC,Jewell DE,Yamka RM,et al.Evaluation of cognitive learning,memory,psychomotor,immunologic,and retinal functions in healthy puppies fed foods fortified with docosahexaenoic acid-rich fish oil from 8 to 52 weeks of age.J Am Vet Med Assoc,2012,241:583-594.

10 李紅娟，劉德華.發育期補充DHA對大鼠學習記憶的影響.中國公共衛生,2001，17:32-33.

11 樊永波，陶興無，馬琳，等.核桃餅粕對大鼠學習、記憶和抗氧化功能的影響.食品科學,2013，34:323-326.

12 Kant D,Tripathi S,Qureshi MF,et al.The effect of glial glutamine synthetase inhibition on recognition and temporal memories in the rat.Neurosci Lett,2014,560:98-102.

13 Topo E,Soricelli A,Di Maio A,et al.Evidence for the involvement of d-aspartic acid in learning and memory of rat.Amino Acids,2010,38:1561-1569.

14 曹錫清.脂質過氧化對細胞與機體的作用.生物化學與生物物理進展,1986,2:17-23.

15 林海生，曹文紅，盧虹玉，等.牡蠣蛋白酶解物改善小鼠學習記憶能力及其體內抗氧化活性的研究.食品科技,2013，38:37-41.

16 裴新榮，楊睿悅，趙海峰，等.海洋膠原肽預防SAMP8小鼠學習記憶功能下降的實驗研究.食品與發酵工業,2009，35:1-5.

17 徐琳琳，馬奕，許雅君，等.乳清蛋白肽改善C57BL/6J小鼠學習記憶功能研究.現代預防醫學,2011，38:1090-1092.