R11介導的DAB2IP功能片段P10對宮頸癌細胞系Siha放療增敏效應的研究

張婷婷 謝秀英

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于乳腺癌，嚴重威脅著女性的健康[1]。放射治療作為宮頸癌的主要治療方法，適用于各期宮頸癌。目前，約80%的宮頸癌患者把放療作為單純治療或綜合治療的手段之一，其療效也得到國際上的一致認可[2-3]。但在接受放射治療的宮頸癌患者中，仍有約13%的患者出現了局部復發[2]。而放療增敏是解決上述問題的重要策略之一。然而,目前包括物理增敏(如加溫、超短微波等)和化學增敏(如metronidazon化學增敏劑)等在內的增敏手段均因缺乏腫瘤靶向性而難以達到最佳療效[4-6]。因此，發展安全、高效的新型靶向基因治療藥物以增強放療敏感性，降低放療劑量，減少其副作用成為改善宮頸癌后的重要治療策略之一。

細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)作為一種新型的藥物遞送工具也備受關注。CPPs是一類不多于30個氨基酸殘基組成的小分子多肽，具有跨膜轉運能力，能夠攜帶外源性大分子進入細胞，且在一定濃度范圍內對宿主細胞無毒害作用[7]。本實驗前期研究發現,腫瘤靶向性穿膜肽R11作為藥物遞送載體，在腫瘤細胞中起到轉運多肽片段的效果。目前，已證實細胞穿膜肽R11作為一種新型靶向藥物遞送系統，可攜帶多肽片段靶向進入腫瘤細胞并發揮生物學作用[8]。

DAB2IP(DOC-2/DAB2interactive protein)是最近發現的Ras-鳥苷三磷酸酶激活蛋白(Ras GTPase activating protein，Ras-GAP)家族的新成員，作為一種新型抑癌基因,在多種腫瘤細胞中表達缺失[9-12]。DAB2IP表達主要受表觀遺傳調節,被證實具有調節細胞凋亡、抑制血管生成、抑制腫瘤侵襲轉移等復雜功能[9,13-14]。近年來研究發現，DAB2IP不僅和腫瘤發生發展密切相關，同時也在腫瘤放療耐受中發揮著重要的作用[15-18]。PR結構域是DAB2IP的重要潛在結構域之一，參與包括ASK1-JNK信號通路、PI3K-AKT信號通路及NF-kB途徑等細胞內信號通路的調節[19-21]。最近有研究表明，該區域含有一個10個脯氨酸重復序列(P10，aa796-805)，能夠與含有SH3的結構域結合[19]。DAB2IP的PR結構域可通過P10多肽片段直接參與細胞內通路調節，從而在腫瘤細胞調控中發揮重要作用[19]。因此，研究P10多肽片段在宮頸癌放療增敏過程中的作用及其機制具有重大科學意義和應用價值。本實驗旨在利用R11攜帶P10多肽片段進入宮頸癌細胞并發揮生物學作用。

材料和方法

1.細胞培養：人宮頸癌細胞株Siha購自ATCC公司，Siha細胞培養于 DMEM 培養液( Dulbecco′s Modified Eagle Medium,High Glucose,GlutaMAXTM，廠家：GIbco,貨號：10566016)中加入 5%的小牛血清(Newborn Calf Serum,Heat Inactivated,New Zealand Origin,廠家：GIbco,貨號：2601006)，置于37°C、5%CO2培養箱中。

2.多肽的制備：細胞穿膜肽R11-P10(RRRRRRRRRRR-PPPPPPPPPP),R11-Control(RRRRRRRRRRR-NPRSAKRPPN)利用多肽合成儀(貨號：10135201；規格：25 mL Reaction Vessel；公司Advanced Automated Peptide Protein Technologies)合成、HPLC純化及鑒定。多肽由西安交通大學材料學院郭翔教授幫助合成并饋贈。

3.多肽在細胞內攝取檢測：將細胞以1×105的密度鋪在帶有玻片的12孔板中培養24 h；同時，將用羧基熒光素FAM標記的多肽FAM-P10、R11-P10-FAM(R11-P10)和R11-Control-FAM(R11-Control)分別5 uM添加到細胞中孵育2 h，接著將轉染后細胞置于無血清培養基DMEM中清洗3遍。為了獲得更精確的定量結果，使用流式細胞術檢測宮頸癌細胞內的FAM表達水平。

4.克隆形成實驗測定細胞存活率：取對數生長期Siha細胞，胰酶消化后按1 000、5 000、10 000、20 000個/孔將細胞種植于6 cm培養皿中。每種密度設置3個對照孔。將細胞置于CO2培養箱中，將細胞給予DMSO、R11-Control(10 μM)、R11-P10(10 μM)孵育4 h后給予不同劑量UV照射。處理后細胞置于培養箱中培養14 d后福爾馬林固定，結晶紫染色，統計細胞集落數(通常將>50個以上細胞克隆記為一個細胞集落)。細胞存活率(Survival fraction,SF)公式為SF(%)=(S/S0)×100%,其中S為UV照射細胞克隆形成率，S0為對照細胞克隆形成率。

5.流式細胞儀檢測細胞周期：取對數生長期的Siha細胞，DMSO及5 uM的多肽片段FAM-P10、R11-P10-FAM和R11-Control-FAM處理Siha細胞2 h后，用PBS洗滌三次，胰酶消化后制成5×106/L細胞懸液，用75%冰冷的乙醇重懸細胞,4℃固定24 h。將固定后細胞離心后棄上清，用 PBS 清洗細胞3次，棄上清后加入200 μl RNase A，37℃孵育30 min，冰浴10 min,中止 RNA 酶的催化反應。用 PBS 清洗細胞 2 次,洗去 RNA 酶。加入 500 μl 碘化丙啶(PI)染色液染色(50 μg/ml)重懸細胞，混勻后 4℃ 避光染色 30 min。上機進行流式細胞儀分析

6.Westernblot：收集細胞樣本，用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。4℃離心機離心棄去沉淀，收集蛋白后BCA法定量分析蛋白濃度。

制備10% SDS-PAGE膠，上樣于泳道后100 V恒壓分離后轉PVDF膜，接著在PBS/Tween-20中用5%脫脂牛奶封閉2 h，加鼠抗人單克隆FAM抗體(Cell Signaling Technology，USA) ,羊抗人單克隆p-AKT,AKT抗體(Cell Signaling Technology，USA)和鼠抗人β-actin 單克隆抗體( sc-130756，Santa Cruz) 4℃過夜。加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、兔抗羊抗體(sc-130656,Santa Cruz) ，室溫孵育1 h 洗膜后顯影。用BandScan圖像分析系統掃描圖像的光密度，以各組目的蛋白條帶光密度值與內參蛋白( β-actin) 光密度值計算相對比值。

7.統計學處理：采用 SPSS16.0 軟件，兩組數據比較采用 Student＇s t 檢驗，多組間資料比較采用 One-way ANOVA 單因素方差分析( LSD 法) 。P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1.多肽片段的細胞內攝取情況：首先，為檢測多肽在宮頸癌細胞中是否存在腫瘤靶向性，合成FAM標記P10后，在流式細胞儀下觀察P10在宮頸癌細胞內的攝取情況。如圖1所示，相較于DMSO對照組，R11-Control組及R11-P10組在細胞內熒光強度存在顯著差異，差異有統計學意義。

注：FAM標記的多肽片段5 uM作用于Siha細胞2 h后PBS漂洗3遍，流式細胞儀記錄細胞內多肽片段熒光強度(左側)，同時柱狀圖定量熒光強度(右側)圖1 多肽片段的細胞內攝入

2.在宮頸癌細胞中的放療增敏作用：為檢測R11-P10顆粒是否能在宮頸癌細胞中發揮放療增敏作用，利用克隆生存實驗檢測Siha細胞中的放療增敏情況，如圖2所示，相較于DMSO對照組及R11-Control組，R11-P10多肽對宮頸癌Siha細胞放療敏感性存在顯著差異，差異有統計學意義。

3.R11-P10對宮頸癌細胞Siha細胞周期的影響：R11-P10對細胞周期的影響見圖3，與對照組R11-DMSO、R11-Control組相比，Siha細胞G2期由 23.1%上升至 48.8%，差異具有統計學意義，而對照組變化不顯著。

圖2 細胞生存曲線檢測多肽對Siha細胞的放療增敏作用

圖3 流式細胞儀檢測不同各濃度(0μM、1μM、5μM、10μM)多肽預處理Siha細胞后對細胞周期的影響

4.R11-P10對可抑制p-AKT蛋白表達影響：如圖4所示，R11可攜帶FAM標記的多肽進入Siha細胞。相較于對照組R11-DMSO、R11-Control組，R11-P10處理后的Siha細胞株接受放療后，p-Akt蛋白水平與對照組相比差異存在統計學意義，而總AKT及p-ERK變化不顯著(圖4)。

討論

宮頸癌是嚴重威脅女性健康的一種疾病，基因治療為人類治療多種惡性腫瘤奠定了基礎。近年來，CPPs作為基因治療中非病毒載體在研究領域備受矚目。理想的基因治療載體是使目的基因可靶向、高效、可控的表達。R11細胞穿膜肽可靶向介導外源性分子，包括蛋白、多肽片段、microRNA等進行腫瘤細胞跨膜轉運，盡管目前其可能機制尚不清楚，但該轉運體系已越來越多的應用于腫瘤細胞的體內外靶向藥物研究中。本研究在前期研究中曾構建R11攜帶P53功能片段在膀胱癌中發揮靶向抗腫瘤作用，但在宮頸癌細胞中是否存在高攝取仍未有相關研究。本研究實驗中利用生物素FAM標記多肽片段后流式細胞儀監測細胞內生物素水平，用來評價細胞內多肽攝入水平。如圖1所示，相較于對照組，R11可有效攜帶多肽進入Siha 細胞。但多肽攝取直接證據仍待進一步研究。

圖4 Western-Blot 檢測多肽及其對照多肽+/-IR處理后p-AKT、AKT、ERK、蛋白表達變化

提高宮頸癌放療敏感性是提高腫瘤療效，改善宮頸癌預后的關鍵問題之一。近年來研究發現，DAB2IP在腫瘤放療耐受中發揮著重要的作用。如，在前列腺癌中，DAB2IP下調可導致腫瘤放化療耐受，過表達DAB2IP可增強腫瘤放療敏感性[16,22]；KONG等證實DAB2IP缺失可能通過增強DSB的修復、G2-M期檢查和抵抗凋亡引發前列腺癌細胞耐受放療的能力增強[15]；在膀胱癌中，ATM(ataxia-telangiectasia mutated)抑制劑可通過抑制ATM磷酸化，抑制腫瘤細胞內DNA損傷修復，增強DAB2IP缺失腫瘤細胞對放療的敏感性[18]。這些結果都提示DAB2IP是治療腫瘤放療耐受的有效靶點。然而DAB2IP調控腫瘤放療敏感性的具體機制尚不清楚。PR結構域作為DAB2IP的重要功能片段調控包括AKT通路在內的多種信號通路的調控，有可能在腫瘤放療中發揮重要作用。本研究發現與單放組、及放療聯合對照多肽組相比，放療聯合R11-P10組形成克隆的能力明顯下降，說明R11-P10有顯著放療增敏作用。本研究中P10相較于對照組，R11-P10作用組細胞周期顯示出明顯的G2/M期阻滯。現已有大量研究證明，對放射最敏感的是 M 期細胞，G2 期細胞也較敏感,G1早期細胞相對敏感，隨著 G1逐步向 S 期發展,放射敏感性隨之降低，至 G1 后期已呈現出相對抗性，S 期細胞對放射呈明顯的抗性。故G2期細胞阻滯可使腫瘤細胞對放療敏感性增加[23]。

AKT及其下游信號通路與多種腫瘤細胞生物學作用相關。活化的AKT即p-AKT可以通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，進而調節細胞的功能。Akt還能通過激活 mTOR或FOXO1等信號通路調節細胞凋亡，從而促進腫瘤細胞的生長、增殖，增加腫瘤對化療和放療的抵抗[24]。本實驗western-blot結果顯示，相比對照組，P10聯合放射組可相對抑制p-Akt的表達，說明P10可能是通過對AKT通路的抑制進一步誘導凋亡發揮對Siha細胞的放射增敏作用。

綜上所述，R11作為新型的非病毒載體可攜帶P10進入宮頸癌Siha細胞并發揮腫瘤增敏作用。P10能顯著降低該細胞中p-AKT蛋白的表達水平,改變該細胞的周期分布，出現G2/M期阻滯，這可能是P10基因放射增敏作用的機制。

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