孕前耳聾基因芯片檢測結果判讀及生育風險分析

查樹偉 封婕 周定杰 黃麗麗 許豪勤

國家“十三五”規劃綱要要求將耳聾等遺傳性疾病列入出生缺陷綜合防控方案，并建立涵蓋孕前、孕期和新生兒各階段的出生缺陷防治免費服務制度[1]。目前耳聾基因篩查研究的報告人群主要集中在耳聾患者、正常孕期人群和新生兒，孕前耳聾基因篩查檢測中國人遺傳性耳聾常見基因突變熱點是實現這一目標的關鍵所在[2-3]。篩查方法多采用耳聾基因芯片檢測與先天性耳聾、藥物性耳聾和大前庭導水管綜合征相關的4個耳聾基因中的9個位點，有的研究還涉及了其他一些基因和位點以及擴增技術，如wolframin基因(WFS1)、G蛋白偶聯受體相關分選蛋白2(GPRASP2)、線粒體tRNASer(UCN)等基因研究以及多重置換擴增(MDA)和單核苷酸多態分型(SNPscan)等技術研究[4-10]。本文僅對耳聾基因芯片檢測結果判讀和生育風險等問題進行探討。

一、芯片檢測結果判讀

1.檢測基因和位點：孕前耳聾基因篩查采用遺傳性耳聾基因檢測芯片，檢測4個常見耳聾基因中的9個位點，包括GJB2基因c.35 del G、c.176 del 16、c.235 del C、c.299 del AT，GJB3基因c.538 C>T，SLC26A4基因c.2168 A>G、IVS7-2 A>G和線粒體12S rRNA基因1494 C>T、1555 A>G。

2.芯片探針和排列：芯片采用多重等位基因特異性PCR結合通用芯片的技術進行高通量平行檢測，芯片的微量點樣技術是將各位點檢測探針與各種質控探針固定在經過化學修飾的基片上，檢測探針各重復5個點，質控探針各重復5、10或15個點，形成11行×15列的微陣列，每張芯片上有4個同樣的微陣列，每一個微陣列可以檢測一份樣本。每張芯片能測4份樣本，見圖1。對于每份樣本，芯片設置了QC(表面化學質控探針)、PC(雜交陽性對照探針)、BC(空白對照探針)、NC(陰性對照探針)、IC(各基因擴增內部質控探針)以及9個檢測位點的W(野生型)和M(突變型)探針。這9個位點為(1)35 del G(芯片示意圖中為“35”)；(2)l76 del 16(芯片示意圖中為“176”)；(3)235 del C(芯片示意圖中為“35”)；(4)299 del AT(芯片示意圖中為“299”)；(5)538 C>T(芯片示意圖中為“538”)；(6)2168 A>G(芯片示意圖中為“2168”)；(7)IVS7-2 A>G(芯片示意圖中為“IVS”)；(8)1494 C>T(芯片示意圖中為“1494”)；(9)1555 A>G(芯片示意圖中為“1555”)[11]。

耳聾基因芯片檢測過程包括核酸提取、多重PCR擴增、雜交、洗滌和掃描等操作流程，最后獲得檢測結果報告[12-13]。

3.結果顯示和判讀：遺傳性耳聾基因檢測芯片判別系統自動判讀掃描結果，位點檢測探針W陽性，判讀該位點為野生型(兩條等位基因上該位點均未發生突變)，探針M陽性，該位點為純合突變型(該位點兩條等位基因均發生突變)；若探針W和M均陽性，則為雜合突變型(該位點有一條等位基因發生突變)。對于線粒體12S rRNA基因突變位點，若M陽性為均質突變型，表示線粒體12S rRNA基因上該位點均發生突變；M和W兩者同為陽性，則為異質突變，該位點部分發生了突變。以235 del C位點檢測結果為例，可能出現3種情況，即235 del C野生型、235 del C純合突變型和235 del C雜合突變型，見圖2[13-14]。

二、基因解讀提示

1.GJB2基因：GJB2定位于13q11-12，DNA全長4804bp，含兩個外顯子，其編碼區位于第二外顯子，長678bp，編碼含226個氨基酸的連接蛋白(Connexin26，Cx26)，這種蛋白負責細胞間信號傳導和離子傳遞，在人類的耳蝸毛細胞中高度表達，突變的GJB2產生異常的蛋白，干擾細胞間信息傳遞功能[15]。GJB2基因與DFNB1的表型相關，以輕度至極重度的語前感音神經性聽力損失為多見，亦可表現進行性聽力損害[16]。近幾年的研究證明，GJB2在柯替氏器的發育中很重要。GJB2的缺失可導致內耳柯替氏器的發育缺陷，并引起外耳毛細胞的畸形退化[17-18]。GJB2敲減較早的小鼠出現柯替氏器的畸形，而敲減較晚的小鼠柯替氏器發育正常，說明內耳柯替氏器的發育缺陷發生在聽力發生之前[19]。GJB2缺失可能削弱了耳蝸主動性放大而導致了晚發型聽力損失[20]。耳聾基因芯片檢測結果是GJB2 雜合突變型，為遺傳性耳聾GJB2基因突變攜帶者，如果是GJB2純合突變型或復合雜合突變型，則提示為遺傳性耳聾患者，這些檢測結果的被檢者親屬需要進行基因檢測，以確認其是否為遺傳性耳聾患者或GJB2基因突變攜帶者。

圖1 芯片設計示意圖

圖2 235 del C 位點檢測結果圖

2.GJB3基因：GJB3定位于人類染色體1p33-35，編碼有270個氨基酸的連接蛋白31，DNA全長3617bP。GJB2基因編碼的間隙連接蛋白31(Connexin31，Cx31)，是間隙連接蛋白家族中的一員[15]。Cx31突變可以導致常染色體顯性或隱性聽力下降、周圍神經疾病伴聽力喪失，以及變性紅皮膚病角化病，導致不同疾病的機理一直是研究的重點。通過突變體研究分別證實Cx31的兩個顯性變性紅皮膚病角化病(EKV)突變(G12R和G12D)能夠表達至細胞質膜并形成間隙連接通道。另有研究證實4個EKV突變(G12R，G12D，R42P和C86S)不能運輸至細胞質膜，因而不能形成間隙連接通道。還有研究發現Cx31的隱性EKV突變L34P表達的蛋白質不能運輸至細胞表面形成間隙連接通道，從而導致L34P蛋白積累在細胞質內[21]。其后通過GJB3基因結構特征及生物信息學分析顯示，Cx31的保守性低于Cx26，突變對Cx31的影響小于Cx26，這是GJB2突變致聾人群遠多于GJB3突變的原因之一[22]。耳聾基因芯片檢測結果是GJB3雜合突變型，為遺傳性耳聾GJB3基因突變攜帶者，應該注意后天高頻聽力損失。

3.SLC26A4基因：又稱為PDS基因，定位于人類染色體7q31，其mRNA全長4930bp，含21個外顯子，編碼含有780個氨基酸的蛋白質Pendrin，SLC26A4的突變幾乎分布于所有的外顯子和側翼序列[15]。SLC26A4基因與DFNB4表型相關，呈進行性或波動性癥狀，一般可以發展至極重度聽力損失，累及所有頻率[12]。SLC26A4基因編碼的Pendrin蛋白主要由疏水性氨基酸組成，能夠介導細胞碳酸氫鈉離子、氯離子和碘離子等的交換。研究表明，Pendrin蛋白表達于內淋巴管和內淋巴囊上皮細胞及橢圓囊和球囊邊緣的神經細胞中，發生異常時可影響細胞內外陰離子的轉運，從而影響聲音傳遞導致聽力損失。內耳的Pendrin蛋白表達缺失會引起一些繼發性病變[23-25]。甲狀腺病變與耳聾具有相關性[26]。耳聾基因芯片檢測結果是SLC26A4雜合突變型，為遺傳性耳聾SLC26A4基因突變攜帶者，應建議被檢者親屬進行基因檢測。檢測結果是SLC26A4純合突變型或復合雜合突變型，提示為遺傳性耳聾患者，建議進行影像學檢查，以便確診是否為大前庭導水管綜合征，還要避免頭部外傷和注意甲狀腺情況。

4.線粒體12S rRNA基因：線粒體DNA(mtDNA)是人細胞質中唯一的DNA分子，是獨立于細胞核染色體外的基因組，具有自我復制、轉錄和編碼的功能，但同時受到核DNA的調控。線粒體遺傳屬于母系遺傳，DNA突變與氨基糖苷類藥物致聾和非綜合征性耳聾有關[15]。mtDNA 12S rRNA基因上常見的兩個突變位點1555 A>G和1494 C>T是導致聽力損失的一個主要原因，而核修飾基因、線粒體單體群和氨基糖苷類藥物等其他修飾因子調節1555 A>G和1494 C>T突變的表現型[27]。耳聾基因芯片檢測結果是12S rRNA均質或異質突變型，提示為藥物耳聾敏感性個體，建議被檢者及母系家族成員終生禁用耳毒性藥物。

三、生育風險分析

孕前耳聾基因檢測可以在分子水平明確病因預防耳聾發生，從基因角度向被檢者進行耳聾原因分析，介紹預防和治療遺傳性耳聾的方法，評估家族和下一代發生遺傳性耳聾的風險。孕前檢查需要對各種不同的人群作出生育風險分析。(1)夫婦雙方聽力正常，無家族遺傳史。(2)夫婦中一人患有耳聾，伴有家族遺傳史。(3)夫婦雙方均患有耳聾，伴有家族遺傳史。(4)夫婦雙方聽力正常，但其中一方伴有家族遺傳史。(5)夫婦雙方聽力正常，無家族遺傳史，但生育過耳聾子女[28]。其中(1)為孕前耳聾基因篩查一般人群，(2)～(5)為孕前耳聾基因篩查高危人群[2]。

1.孕前耳聾基因篩查一般人群：耳聾基因芯片檢測結果均是野生型，提示9個遺傳性耳聾基因位點無突變，發生遺傳性耳聾的概率較小。

2.正常夫婦后代患耳聾的生育風險分析：(1)通過耳聾基因檢測，如果夫婦一方是線粒體DNA A1555G突變攜帶者，而另外一方耳聾基因檢測是野生型，那么當男方是線粒體DNA A1555G突變攜帶者時，由于線粒體疾病遵循母系遺傳方式，所以男方的突變是不會傳給子女，子女與其他正常夫婦的后代耳聾的概率是相同的。如果女方為基因突變攜帶者，子女將不分性別，都會是基因突變的攜帶者，子女只要終生避免接觸氨基糖苷類抗生素藥物就可以預防耳聾的發生。(2)夫婦一方為GJB2或SLC26A4基因突變攜帶者，而另一方為相同基因突變的攜帶者，就是夫婦同為GJB2或SLC26A4基因突變的攜帶者，子女將有25%的耳聾風險。這樣的夫婦可以在生育前進行產前診斷來判斷胎兒的基因型，防止聾兒出生。(3)男方是GJB2基因突變攜帶者，而女方是SLC26A4基因突變攜帶者，夫婦兩人所攜帶的突變基因型不一樣，子女將有50%的概率成為GJB2或(和)SLC26A4基因突變攜帶者，但不會發生GJB2或SLC26A4基因突變耳聾。

3.夫婦中有一人耳聾的生育風險分析：(1)常染色體顯性遺傳致聾，在患者中所占比例較低(15%～24%)，因純合子罕見，子代約有1/2的概率為患者，表現型(發病時間和耳聾程度)因不同致病基因有所差異。(2)常染色體隱性遺傳致聾，為最普遍的遺傳性耳聾遺傳形式，在患者中所占比例高(75%～85%)，子女全部為表現型正常的攜帶者。(3)X連鎖遺傳致聾，在患者中比例低(1%～2%)，隱性遺傳患者為女方時，兒子發病幾率高，女兒為表現型正常的攜帶者；患者為男方時，兒子正常，女兒為表現型正常的攜帶者。(4)Y連鎖遺傳致聾，少見，兒子發病機率高[28]。

4.耳聾夫婦的生育風險分析：(1)夫婦雙方均為環境因素致聾時，子女患耳聾的概率比較低，與正常夫婦后代患耳聾的概率相同。(2)夫婦一方為環境因素致聾，另一方為遺傳因素致聾時，子女患耳聾的概率為2%～3%、較正常夫婦后代患耳聾高50～100倍，子女100%為突變基因攜帶者。(3)夫婦雙方均為GJB2突變致聾時，子女患耳聾的幾率為100%。(4)夫婦雙方均為SLC26A4突變致聾時，子女患耳聾的幾率為100%。(5)夫婦一方為GJB2突變致聾，另一方為SLC26A4突變致聾時，子女耳聾發病率較低，約2%～3%，子女均為GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者。

5.已生育聾兒家庭(家族)的生育風險分析：(1)聾兒檢測到SLC26A4或GJB2兩個基因突變，且兩個突變分別來自父親和母親，則該聾兒的父母再生育時會有25%的幾率生育聾兒，在懷孕12～26周行產前基因診斷，可以預測胎兒的聽力狀況。該聾兒今后的配偶也應進行SLC26A4或GJB2基因突變檢測，避免生育耳聾后代。此外，與該聾兒父母有血緣關系的所有親屬均有可能攜帶SLC26A4或GJB2基因突變，有生育耳聾后代的風險，對與該聾兒的父母有血緣關系的親屬本人及其配偶進行SLC26A4或GJB2基因檢測和遺傳咨詢指導，有助于盡早發現危險因素，避免生育耳聾后代[29]。(2)聾兒經過耳聾基因檢測，發現是線粒體DNA A1555G突變者，其發病與使用耳毒性(氨基糖苷類)藥物密切相關，此遺傳性耳聾遵循母系遺傳方式，所以母親及其所有后代和母系家庭成員均為線粒體DNA A1555G突變攜帶者，都應該終生禁止使用氨基糖苷類藥物，以防止耳聾的發生[13]。

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