Tip30基因過表達對人胃癌細胞生長的影響及分子機制

程智勇 楊雁鴻 楊麗莉 李高巖 門曉彥

Tip30基因過表達對人胃癌細胞生長的影響及分子機制

程智勇1楊雁鴻2楊麗莉3李高巖1門曉彥4★

目的探討Tip30基因過表達對人胃癌AGS細胞增殖、凋亡的影響及相關分子機制。方法人胃癌AGS細胞中Tip30基因過表達采用腺病毒轉染法，使用實時定量PCR和Western blotting驗證Tip30過表達的效果，分別采用MTT法、劃痕試驗檢測細胞增殖、遷移情況，流式細胞術分析細胞凋亡，Western blotting分析p53、Bax、Bcl?2蛋白表達。結果過表達組AGS細胞Tip30基因mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05）。與對照組比較，Tip30過表達后，細胞增殖、體外遷移能力均顯著減弱（P＜0.05）；Tip30過表達后AGS細胞凋亡率相比對照組顯著增大，Tip30過表達促進AGS細胞凋亡與上調p53、Bax蛋白表達，下調Bcl?2蛋白表達水平相關。結論Tip30基因過表達可抑制人胃癌AGS細胞增殖活性、體外遷移能力，且促進胃癌細胞凋亡。

人胃癌細胞；Tip30基因；細胞增殖；凋亡；遷移

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人胃癌細胞株AGS購自中國科學院上海細胞庫；反轉錄試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白標準購自美國Thermo Fisher Scientific；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，real?time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；新生胎牛血清、RPMI?1640培養基購自美國Gibico公司；MTT、DMSO、EDTA購自美國Sigma公司；Tip30基因過表達腺病毒購自漢恒生物科技（上海）公司；鼠抗人Tip30抗體為美國Imgenex公司；p53、Bax、Bcl?2抗體購自美國Abcam公司；PBS溶液、胰蛋白酶、細胞裂解液、青霉素、鏈霉素購自江蘇凱基生物技術公司；GAPDH抗體、羊抗鼠或羊抗兔二抗購自北京博奧森生物技術公司；Annexin V?FITC、碘化丙啶（PI）購自美國BD公司；引物合成委托Invitrogen公司。流式細胞儀（BD，US），熒光顯微鏡（Olympus，日本），凝膠成像分析系統、Real?time PCR檢測儀（Bio?Rad，US），酶標儀（Bio?Tek，美國）。

1.2 細胞培養

AGS細胞復蘇后，采用含10%胎牛血清的RP?MI?1640培養基，在37℃、20%CO2細胞培養箱中恒溫培養，每天觀察細胞生長狀態并及時更換新鮮培養液，當細胞生長密度達到80%左右時，用胰蛋白酶消化后傳代，分成3～4個細胞培養瓶繼續培養，取生長狀態良好的對數生長期細胞用于后續轉染及分析檢測實驗。

1.3 細胞轉染

過表達組為轉染Tip30過表達腺病毒的AGS細胞，對照組為AGS細胞，不做其它處理。取對數生長期人胃癌AGS細胞于轉染前12 h種植6孔板，當細胞匯合度達到40%左右時，更換不含胎牛血清的RPMI?1640培養基饑餓培養3 h，之后按照感染復數MOI等于100的濃度添加Tip30過表達腺病毒，轉染時長為4 h，轉染完成后更換含10%胎牛血清的新鮮培養基，繼續培養至后續各項指標檢測所需的時長。

1.4 Real?time PCR檢測mRNA水平

2.2.1 患者感染和微生物學檢查情況 在136例用藥患者中，12例肺部感染，3例高熱，2例真菌感染，2例腹腔感染，6例皮膚真菌感染，5例足趾真菌感染，5例灰指甲。103例送微生物學檢查，送檢率為 75.74%，其中 35 例（1，3）-β-葡聚糖實驗（G 實驗）陽性，1例可疑陽性；7例白色念珠菌陽性，1例光滑念珠菌陽性，3例真菌陽性 （無具體菌屬），56例G試驗陰性、作預防感染用藥。

Tip30過表達腺病毒轉染后48 h收集兩組細胞，每孔添加適量Trizol和氯仿，移液器吹打裂解細胞，提取總RNA，去基因組后檢測RNA純度，純度合格且無蛋白質污染，進行逆轉錄。據Tip30基因片段設計引物，上游引物為5′?GTCTTTATTTT?GGGCGCCAG?3′，下游引物為5′?CCCAGC TTTCCCTCTGGTGG?3′。內參β?actin上游引物為5′?GCCTCCGGCAGGACCACCGG?3′，下游引物為5′?CGGTGAGATCGCGGCCCGCC?3′。按照逆轉錄試劑盒說明書具體步驟進行逆轉錄操作。逆轉錄成cDNA后，進行定量分析，以每個樣本中的β?actin作為內參，反應條件為95℃預變性2 min，然后94℃變性30 s，目的基因Tip30 60℃退火30 s，內參β?actin 55℃退火30 s，72℃延伸1 min，總共40個循環。PCR產物進行瓊脂糖濃度為1.5%的凝膠電泳，凝膠成像系統中使用紫外燈觀察DNA條帶，拍照并保存。每個樣品實驗重復3次，基因相對表達量計算分析使用2?△△Ct方法。

1.5 MTT法檢測細胞增殖

MTT法檢測細胞增殖使用96孔板，分別在過表達腺病毒轉染后繼續培養12、24、36、48、60、72 h，每個時間點均設置4個復孔，培養結束后每孔添加20 μL MTT溶液繼續培養4 h，用移液器移棄MTT，加DMSO后用酶標儀測定波長在490 nm處的吸光度值（OD490nm），未接種細胞的孔加入RPMI?1640培養基作為調零孔。細胞相對生長率等于每組細胞各個時間點的吸光值與第12 h吸光值的比值。

1.6 流式細胞術分析細胞凋亡

細胞轉染后48 h收集包括上清及貼壁的全部細胞，PBS懸浮漂洗2次，每個樣品加入5 μL Annexin V?FITC按照試劑盒說明書操作進行染色，避光反應0.5 h，加入10 μL PI后1 h內完成流式細胞儀上機檢測。

1.7 Western blotting分析蛋白表達

Tip30基因過表達腺病毒轉染后48 h收集每組AGS細胞，加細胞裂解液裂解完全，收集上清，測定樣品蛋白濃度，加上樣緩沖液后高溫變性，樣品行SDS?PAGE電泳后電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后孵育一抗，4℃搖床孵育過夜，其中Tip30、Bax、Bcl?2抗體稀釋比例為1∶1 000，GAPDH稀釋比例為1∶2 000，一抗孵育完成后進行二抗常溫孵育2 h，二抗稀釋比例為1∶4 000；二抗孵育完成后暗房顯影、定影，膠片掃描后蛋白條帶用Image J軟件進行灰度檢測與半定量分析。

1.8 劃痕試驗考察癌細胞遷移能力

人胃癌細胞AGS過表達腺病毒轉染后12 h，移棄RPMI?1640培養基，用無菌移液器槍頭在細胞培養6孔板底部劃出1條痕跡，用PBS清洗2次，去除漂浮細胞后添加含10%血清的RPMI?1640培養基，在CO2細胞孵育箱中繼續培養24 h，顯微鏡下計數同一視野中裂痕上的細胞個數，每個視野計數3次，求平均值。

1.9 統計分析

統計分析采用SPSS 20.0軟件，數據以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，檢驗水準為0.05。

2 結果

2.1 Tip30過表達效果

與對照組比較，過表達組AGS細胞轉染后48 h，Tip30 mRNA水平顯著升高（P＜0.05）（圖1），過表達組Tip30蛋白表達也相應明顯增多，見圖2。

2.2 Tip30基因表達對細胞增殖的影響

結果如圖3所示，與對照組比較，過表達組AGS細胞轉染60 h、72 h后，細胞數目顯著減少（P＜0.05），其它時間點兩組間細胞數量比較差異不具有統計學意義。

圖1 RT?PCR分析AGS細胞中Tip30 mRNA的表達水平Figure 1 The analysis of Tip30 mRNA expression level in AGS cells by RT?PCR

圖2 Western blotting檢測AGS細胞中Tip30蛋白表達Figure 2 The protein expression level of Tip30 in AGS cells was examined by western blotting

2.3 Tip30基因表達對胃癌細胞AGS凋亡的作用及相關分子機制

過表達組AGS細胞轉染后48 h細胞凋亡率為（14.28±3.16）%，明顯大于對照組細胞凋亡率（2.04±0.37）%，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

Western blotting檢測凋亡相關蛋白結果顯示，與對照組比較，過表達組AGS細胞中促進細胞凋亡分子p53、Bax蛋白表達水平顯著上升（P＜0.05），抗凋亡分子Bcl?2蛋白表達水平則明顯下降（P＜0.05），見圖5。

圖3 Tip30過表達對AGS細胞生長的影響Figure 3 The influence of Tip30 overexpression on cell growth of AGS

圖4 Tip30基因過表達對胃癌AGS細胞凋亡率的影響Figure 4 The effects of Tip30 gene overexpression on cell apoptosis rate in gastric cancer AGS cells

2.4 Tip30基因表達對胃癌細胞AGS遷移性能的影響

過表達組在24 h裂痕上遷移的細胞數目為（91±13）個，對照組遷移的細胞數目為（178±29）個，兩組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05），說明過表達組細胞遷移能力弱于對照組。

3 討論

腫瘤抑制基因Tip30與多種腫瘤的發生及轉移具有一定的關系，如肝癌、食管鱗狀上皮癌、肺癌及喉鱗狀細胞癌瘤等［2?3，7］。Tip30在胰腺導管腺癌組織中表達缺失率為49.1%，正常組織中的缺失率為0%［4］。血清Tip30水平可作為卵巢癌、膽囊癌預后和診斷的分子標記［8?9］。Tip30低水平表達與胰腺癌患者不良預后關系密切［5］。Tip30基因缺失可通過激活胞質和胞核內EGFR信號通路促進動物體內肺腺癌的生長［10］。此外，Tip30還與化療藥物敏感性增強有關［11］，如二甲雙胍通過上調肝癌細胞Tip30基因表達抑制索拉非尼的促肝癌細胞轉移的作用［12］。

本研究結果顯示，人胃癌細胞AGS中Tip30基因過表達可顯著抑制細胞增殖，轉染后60 h細胞數目明顯減少，Tip30基因過表達促進胃癌細胞凋亡，還使體外遷移的細胞數目明顯減少，抑制腫瘤細胞的遷移能力。多項研究報道Tip30基因表達與腫瘤細胞增殖、轉移等關系密切。Tip30基因過表達可抑制膠質瘤細胞的生長和體外侵襲能力［13］。microRNA?10b通過抑制非小細胞肺癌和胰腺癌細胞Tip30基因表達增強腫瘤細胞的增殖和侵襲性能［14?15］。TGF?β1可通過沉默食管癌細胞Tip30基因表達促進腫瘤細胞的轉移［16］。過表達Tip30基因的HepG2肝癌細胞明顯降低了基質金屬蛋白酶?2/ 9mRNA表達和蛋白的翻譯，肝癌細胞的增殖、錨定非依賴性生長及肝癌細胞遷移能力均明顯受到抑制［17］。抑制胰腺癌細胞系Capan?2細胞內源性Tip30表達可增強腫瘤細胞增殖克隆形成和成瘤能力，使另一胰腺癌細胞系PANC?1細胞中Tip30過表達，則抑制腫瘤細胞增殖克隆形成和成瘤能力［4］。上述結果為本研究結論提供一定支持。

Tip30基因表達可促進腫瘤細胞凋亡、延遲腫瘤細胞周期進展及抑制細胞轉移能力［18］。研究表明，Tip30可通過誘導抑癌基因p53、促凋亡因子Bax表達，抑制Bcl?x1表達促進腫瘤細胞的凋亡［19］。若Tip30發生基因缺失或突變，將下調p53基因的表達，抑癌效應減弱，腫瘤細胞增殖活性相應增強，生長速度加快［18］。本研究結果表明，Tip30過表達抑制胃癌細胞生長，促進其凋亡，與上調p53、Bax表達，下調Bcl?2蛋白表達相關，與以上文獻報道結果一致。腺病毒載體表達Tip30基因可通過p53基因依賴性或非依賴性途徑抑制胃癌細胞株和骨肉瘤細胞株的增殖生長，是一種潛在的腫瘤生物治療手段［20］。綜上所述，人胃癌細胞AGS中Tip30基因過表達可顯著抑制腫瘤細胞的增殖活性及體外遷移能力，并促進凋亡，作用機制與上調p53基因表達有關。

圖5 Tip30基因過表達對胃癌AGS細胞中相關凋亡蛋白表達的作用Figure 5 The effects of Tip30 gene overexpression on relevant apoptotic protein expression levels in gastric cancer AGS cells

［1］Yu X，Li Z，Wu WK.TIP30：A Novel Tumor?Sup?pressor Gene［J］.Oncol Res，2015，22（5?6）：339?348.

［2］Zhu M，Yin F，Fan X，et al.Decreased TIP30 pro?motes Snail?mediated epithelial?mesenchymal transi?tion and tumor?initiating properties in hepatocellular carcinoma［J］.Oncogene，2015，34（11）：1420?1431.

［3］Chen J，Zhu C，Zhu M，et al.Clinicopathologic sig?nificance and survival of TIP30 expression in laryngeal squamous cell carcinoma［J］.Int J Clin Exp Med， 2015，8（4）：6024?6031.

［4］郭世偉，李先鵬，吳義峰，等.TIP30在胰腺中的表達及對胰腺癌細胞生物學特性的影響［J］.現代生物醫學進展，2013，13（9）：1705?1709.

［5］Guo S，Jing W，Hu X，et al.Decreased TIP30 expres?sion predicts poor prognosis in pancreatic cancer pa?tients［J］.Int J Cancer，2014，134（6）：1369?1378.

［6］程智勇，楊雁鴻，李桃，等.Tip30和p53蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義［J］.疑難病雜志，2016，15（8）：813?816.

［7］Dong W，Shen R，Cheng S.Reduction of TIP30 in esophageal squamous cell carcinoma cells involves pro?moter methylation and microRNA?10b［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，453（4）：772?777.

［8］Kumtepe Y，Halici Z，Sengul O，et al.High serum HTATIP2/TIP30 level in serous ovarian cancer as prog?nostic or diagnostic marker［J］.Eur J Med Res，2013，18：18.

［9］Liu Z，Yang Z，Jiang S，et al.MCM2 and TIP30 are prognostic markers in squamous cell/adenosquamous carcinoma and adenocarcinoma of the gallbladder［J］. Mol Med Rep，2016，14（5）：4581?4592.

［10］Li A，Zhang C，Gao S，et al.TIP30 loss enhances cy?toplasmic and nuclear EGFR signaling and promotes lung adenocarcinogenesis in mice［J］.Oncogene，2013，32（18）：2273?2281.

［11］Zhu M，Yin F，Yang L，et al.Contribution of TIP30 to chemoresistance in laryngeal carcinoma［J］.Cell Death Dis，2014，5：e1468.

［12］Guo Z，Cao M，You A，et al.Metformin inhibits the prometastatic effect of sorafenib in hepatocellular carci?noma by upregulating the expression of TIP30［J］. Cancer Sci，2016，107（4）：507?513.

［13］Hu Y，Chen F，Liu F，et al.Overexpression of TIP30 inhibits the growth and invasion of glioma cells［J］. Mol Med Rep，2016，13（1）：605?612.

［14］Liu Y，Li M，Zhang G，et al.MicroRNA?10b overex?pression promotes non?small cell lung cancer cell pro?liferation and invasion［J］.Eur J Med Res，2013，18：41.

［15］Ouyang H，Gore J，Deitz S，et al.microRNA?10b en?hances pancreatic cancer cell invasion by suppressing TIP30 expression and promoting EGF and TGF?β ac?tions［J］.Oncogene，2014，33（38）：4664?4674.

［16］Bu F，Liu X，Li J，et al.TGF?beta1 induces epigene?tic silence of TIP30 to promote tumor metastasis in esophageal carcinoma［J］.Oncotarget，2015，6（4）：2120?2133.

［17］李浩，吳金術，蔣波，等.Tip30基因表達對肝癌細胞侵襲轉移能力的影響［J］.中南大學學報（醫學版），2014，39（8）：775?783.

［18］陳錦章，黃維，阮健，等.TIP30基因表達對吉非替尼體外抑瘤作用的影響研究［J］.河北醫學，2014，20（3）：358?361.

［19］朱逸慜.骨橋蛋白和TIP30與胃癌關系研究進展［J］.中華實用診斷與治療雜志，2013，27（5）：423?425.

［20］張霞，趙健，李曉冬，等.TIP30基因腺病毒載體的構建及體內外抑癌作用［J］.中華腫瘤雜志，2004，26（2）：85?88.

The effect and molecular mechanism of Tip30 gene overexpression on cell growth in human gastric cancer cells

CHENG Zhiyong1,YANG Yanhong2,YANG Lili3,LI Gaoyan1,MEN Xiaoyan4★
(1.The first department of general surgery,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China, 066000;2.The second department of tumor,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China, 066000;3.Information section,the first hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Hebei,China,066000; 4.The endocrinology department,Haigang hospital of Qinhuangdao city,Qinhuangdao,Qinhuangdao,Hebei, China 066000)

ObjectiveTo investigate the effect and underlying molecular mechanism of Tip30 gene overexpression on cell proliferation and apoptosis in human gastric cancer AGS cells.MethodsAdenovirus transfection was used to overexpress the Tip30 gene in human gastric cancer AGS cells.Tip30 overexpression was verified by real?time PCR and western blot.Cell proliferation was analyzed with the MTT method,a wound scratch assay was used to monitor cell migration activity,and the cell apoptosis rate was detected with flow cytometry.The expression level of p53,Bax and Bcl?2 was detected with western blot.ResultsThe mRNA and protein levels of Tip30 in human gastric cancer AGS cells were significantly higher in the overexpression group compared with the control group(P＜0.05).The proliferation and migratory ability of AGS cells in vitro were decreased when Tip30 was overexpressed(P＜0.05).The cell apoptosis rate was significantly increased in Tip30 overexpressing cells,and a corresponding up?regulation of p53 and Bax anddown?regulation of Bcl?2 was also observed.ConclusionOverexpression of Tip30 in human gastric cancer AGS cells inhibits both cell proliferation and migration in vitro,and enhances the AGS cell apoptosis.

Human gastric cancer;Tip30 gene;Cell proliferation;Apoptosis;Migration

秦皇島市科學技術研究與發展計劃項目(2012023A130)

1.河北省秦皇島市第一醫院普外一科，河北，秦皇島066000 2.河北省秦皇島市第一醫院腫瘤二科，河北，秦皇島066000 3.河北省秦皇島市第一醫院信息科，河北，秦皇島066000 4.秦皇島市海港醫院內分泌科，河北，秦皇島066000

★通訊作者：門曉彥，E?mail:mfcx55@163.com