IFN-γ基因+874位點單核苷酸多態性與宮頸癌的關系

陳 健，孫志強，李玉權，武廣恒

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021)

*通訊作者

IFN-γ基因+874位點單核苷酸多態性與宮頸癌的關系

陳 健1，孫志強1，李玉權1，武廣恒2*

(1.吉林省腫瘤醫院，吉林 長春130012；2.吉林大學基礎醫學院，吉林 長春130021)

人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發生的重要危險因素[1]，但僅有一定數量的HPV 感染者最終罹患宮頸癌，說明遺傳易感性在個體之間存在著差異，其作用可能在特定條件下被激發，并在腫瘤發生中起到重要作用。干擾素(IFN)是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的十分重要的細胞因子,具有拮抗腫瘤、廣譜抗病毒以及免疫調節等廣泛的生物活性。研究顯示[2]，在IFN-γ基因中存在6個多態性位點，其中第一內含子+874位點A/T單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)，可以通過改變轉錄因子的結合位點的方式進而影響到相關基因的表達數量[3]。本實驗中運用單核苷酸多態性基因分型方法,比較宮頸癌病例組和對照組IFN-γ基因+874位點單核苷酸多態性基因型頻數和等位基因頻數差異,進而探討IFN-γ基因與宮頸癌發生的相關性。

1 材料與方法

1.1 檢測對象 實驗組：69例，漢族，其中鱗癌62例、腺癌7例,上述病例為吉林省腫瘤醫院住院病人，就診時間為2013年6月-2015年8月。經病理切片確切診斷為宮頸癌，同時排除其他類型癌癥，年齡44.6±10.7歲；對照組：69例，漢族，為同一醫院同時期體檢正常的女性，無既往腫瘤病史，年齡45.2±9.4歲。

1.2 樣本的收集和處理 用真空采血管(5 ml，含有抗凝劑肝素鈉)收集靜脈血，采用TE飽和重蒸酚、氯仿/異戊醇混合液抽提法提取檢測對象外周血基因組DNA，-20℃保存。

1.3 引物 GenBank 檢索IFN-γ序列(NC-000012)，Primer 5.0設計引物，南京金斯瑞生物科技有限公司合成。F1(上游引物)：5′-cgcgcaacacaaaatcaaatca-3′，F2(上游引物)：5′-cgcgcaacacaaaatcaaatct-3′，R(下游通用引物)：5′-gctacatctgaatgacctgc-3′，PCR擴增，片段長度527 bp。

1.4 檢測基因型 采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法。PCR 總的反應體系為50 μl，PCR反應條件：94℃ 1 min 、58℃ 50 s、72℃ 45 s，31個循環，72℃延伸10 min。PCR產物8 μl，1.0%瓊脂糖凝膠電泳電壓95V，35 min，凝膠成像系統分析并保存圖像。

1.5 統計分析 首先檢驗基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律的要求，基因型和等位基因頻數的分布差異采用χ2檢驗方法，采用SPSS13.5 統計分析軟件進行數據處理及統計分析。用比值比(OR)和95%參數置信區間來評估相對風險程度。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 定律檢驗χ2檢驗結果表明，實驗組、對照組基因型頻數分布均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律要求(P>0.05)。

2.2 基因型、等位基因分布狀況 IFN-γ基因通過PCR擴增后，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，根據單核苷酸多態性可分為AA、AT和TT等三種基因型，詳見表1和圖1。同一樣本用F1、R引物及F2、R兩對引物分別擴增，如結果均出現527 bp長度片段，稱為AT基因型，如只有其中一對引物可以擴增出527 bp長度片段，稱為AA或者TT基因型。經檢驗，AA、AT和TT三種基因型實驗組中的頻數分布與對照組比較具有顯著性差異(χ2=4.830，P=0.028)；AA基因型頻數分布與對照組相比較差異具有顯著性(χ2=4.182，P=0.042)；實驗組和對照組的基因型頻數的相對危險度分析后發現，AA / TT：OR=2.02，95%CI:1.03-3.97，AA基因型患卵巢癌的風險是TT基因型的2.02倍；實驗組和對照組中A與T兩個等位基因之間頻數分布比較具有顯著性差異(χ2=6.059，P=0.014)，相對危險度分析結果，A / T ：OR=1.91，95%CI:1.14-3.20,A等位基因患卵巢癌的風險度是T等位基因的1.91倍。

2.3 病例組中鱗癌與腺癌之間，基因型頻數和等位基因頻數相比較，差異均無顯著性，見表2。

M:Marker(DL-2000);1-2:AA基因型;3-4:AT基因型;5-6:TT基因型;PCR 產物長度均為527 bp

圖1 PCR產物電泳后AA、AT和TT三種基因型的電泳圖譜

表1 宮頸癌病例組、正常對照組基因型頻數和等位基因頻數分布狀況

表2 宮頸癌實驗組病理類型中基因型頻數分布狀況

3 討論

目前，細胞因子與宮頸癌遺傳易感性關系的研究不斷取得進展，研究提示[4]，IL-12A rs568408 和IL-12B rs3212227 多態性可能單獨或聯合作用影響江蘇地區女性的宮頸癌發病風險；Tamandani 等[5]研究揭示，HPV18 或 HPV18 合并16型感染患者中 IL-1RA AB 基因型患宮頸鱗癌和腺癌風險降低。IFN-γ的合成量受基因調控，存在著較大的個體差異，究其原因可能是基因調節區的多態性，或者說等位基因的多態性直接控制著IFN-γ的合成[6]。IFN-γ基因+ 874位點存在于IFN-γ基因第一個內含子區域，包括 AA、AT、TT 3種基因型，轉錄因子NF-kappaB的結合位點剛好與+ 874 位點處于同一位置，此位置出現的SNP可直接影響到與轉錄因子的結合能力，從而影響IFN-γ的轉錄[7]。據報道，IFN-γ基因第一內含子+874位點多態性與腫瘤在內的一些疾病具有相關性[8]。Kordi Tamandani等[9]經過研究發現，IFN-γ基因+874位點的AT和AA+AT基因型在印度北部人群中與宮頸癌發生風險升高有關，帶有等位基因A的個體產生IFN-γ的能力較低，提示+874位點單核苷酸多態性在決定個體HPV遺傳易感性方面可能承擔著十分重要的作用。

本文結果顯示，AA基因型、A等位基因可能是該群體宮頸癌發生的危險因素。除此之外，該群體宮頸鱗癌和腺癌之間基因型頻率以及等位基因頻率相比較，均未見顯著性差異，表明本群體該位點SNP在宮頸癌病程中不存在組織學類型的特異性。

[1]趙方輝,喬友林.宮頸癌病因學研究進展[J].癌癥進展雜志,2004,2(1):39.

[2]Chevillard C,Henri S,Stefani F,et al.Two new polymer phisms in the human interferon gamma ( IFN-gamma) promoter[J].Eur J Immunogenet,2002,29 (1) :53.

[3]Lopez- Maderuelo D,Arnalich F,Serantes R,et al.Interferon-gamma and interleukin-10 gene polymor phisms in pulmonary tuberculosis[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167:970.

[4]陳小軍,錢年鳳,胡志斌等.IL-12A和IL-12B基因多態性與江蘇人群宮頸癌遺傳易感性相關[J].南京醫科大學學報,2009,29(8):1148.

[5]Tamandani DM，Sobti RC，Shekari M et al．Impact of polymorphism in IL-1RA gene on the risk of cervical cancer[J]．Arch Gynecol Obstet,2008,277(6)：527.

[6]BEN-ARI Z,MOR E,PAPO O,et al.Cytokine gene polymorphisms in patients infected with hepatit is B virus[J].Am J Gustroenterol,2003,98:144.

[7]Pravica V,Perrey C,Stevens A,et al.A single nucleotide polyorphism in the first intron of the human IFN-γ gene:absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-γ gene [J].Hum Immunol,2000,61(9):863.

[8]Kamali-Sarvestani E,Merat A,Talei AR.Polymorphism in the genes of alpha and beta tumor necrosis factors(TNF-alpha and TNF-beta) and gamma interferon (IFN-gamma) among Iranian women with breast cancer[J].Cancer Lett，2005，223:113.

[9]Kordi Tamandani MK,Sobti RC,Shekari M,et al.Expression and polmiorphism of IFN-gamma gene in patients with cervical cancer [J].Exp Oncol,2008,30(3):224.

1007-4287(2017)03-0498-02

2016-05-17)