草地早熟禾熒光定量PCR分析中內參基因的篩選

張蘭，檀鵬輝，滕珂，閆蒙舉，何春燕，甘露，尹淑霞

(北京林業大學林學院草坪研究所，北京 100083)

草地早熟禾熒光定量PCR分析中內參基因的篩選

張蘭，檀鵬輝，滕珂，閆蒙舉，何春燕，甘露，尹淑霞*

(北京林業大學林學院草坪研究所，北京 100083)

為篩選出草地早熟禾實時熒光定量中的最適內參基因，利用實時熒光定量PCR技術，分析檢測6個傳統內參基因ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α、18srRNA和β-tublin在草地早熟禾不同組織器官、葉片不同發育期、非生物脅迫和不同激素誘導下mRNA的表達差異情況。利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件綜合評價6個候選內參基因的表達穩定性。結果表明，在不同組織、葉片不同發育期、激素誘導和非生物脅迫下，候選內參基因的表達穩定性存在差異。GAPDH在草地早熟禾不同組織器官中表達最為穩定；EF-1α在非生物脅迫下表達最為穩定；不同激素下首選β-tublin；在葉片不同發育期ACT表達最為穩定。綜上所述，通過篩選出不同條件下適宜的內參基因不僅有助于提高草地早熟禾基因表達分析的準確性，也為早熟禾屬植物其他內參基因的開發提供了理論參考。

草地早熟禾；實時熒光定量PCR；內參基因；穩定性評價

實時熒光定量PCR是一種高效的生物技術之一，是在mRNA水平上對基因表達進行的定量分析，為避免樣品之間和樣品內部的差異，必須引入拷貝數高、穩定表達的內參基因對目標基因的表達量進行校正[1]。但越來越多的研究表明，沒有絕對穩定表達的基因存在，任何一種內參基因的所謂穩定表達都只是在特定試驗因素的作用下恒定。目前，研究較多的內參基因都是參與植物基礎新陳代謝過程中的基因[2]，如肌動蛋白(actin,ACT)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、多聚泛素酶(ubiquitin，UBQ)、翻譯延伸因子(translation elongation factor 1A，EF-1α)、18s核糖體RNA(18s ribosomal RNA，18srRNA)、微管蛋白中的α、β家族(α/β-tublin)等。

目前在植物研究領域關于候選內參基因篩選的報道很多，且選擇哪種合適的內參基因取決于植物品種、組織器官、處理因素及不同實驗條件等[3]。如在二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)中，多聚泛素連接酶基因4(BdUBi4)和多聚泛素連接酶基因10(BdUBi10)在不同組織器官和激素處理的樣品中表達最為穩定，而S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(s-adenosyl methionine decarboxylase，BdSAMDC)在逆境脅迫條件下的表達穩定性最好[4]；在珍珠粟(Pennisetumglaucum)中EF-1α和翻譯起始因子4A(eukaryotic translation initiation factors 4A，PgEIF4A)表達最為穩定；PgEIF4A和蘋果酸脫氫酶基因(malate dehydrogenase，PgMDH)在不同非生物脅迫下表達穩定性最高；MDH和酰基載體蛋白基因(acylcarrier protein，PgACP)適用于不同品種珍珠粟基因的表達分析[5]。在與草地早熟禾(Poapratensis)親緣關系較近的小麥(Triticumaestivum)中，傳統內參基因EF-1α表達最為穩定，適于做不同非生物脅迫下基因的表達分析[6]。肌動蛋白基因(ACTIN)和翻譯控制腫瘤蛋白酶基因(translationally controlled tumor protein，TCTP)最適合作鴨茅(Dactylisglomerata)根組織在非生物脅迫下的內參基因[7]。UBQ基因在蘋果(Malusdomestica)不同基因型、不同組織和果實不同發育期表達均比較穩定，是其理想內參基因[8]。對于柑橘(Citrussinensis)來說，因其在不同處理下，各候選內參基因穩定性差異較大，建議根據不同的試驗內容選擇不同的內參基因組合[9]等。由此可見，很有必要針對性地篩選不同條件下表達穩定的候選內參基因。

草地早熟禾是一種應用極為廣泛的冷季型草坪草，隨著其分子生物學研究的不斷深入，基因表達分析已經廣泛用于揭示草地早熟禾基因調控的機理中，因此篩選穩定的內參基因在基因表達分析中起著關鍵作用，但鮮見有關草地早熟禾內參基因篩選的研究報道。鑒于生長發育調控和抗逆性是目前草坪草分子生物學研究的熱點，本研究選擇了草地早熟禾在不同組織器官、葉片不同發育期、不同激素處理和非生物脅迫下的樣品，利用qRT-PCR方法分析了ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α、18srRNA和β-tublin這6個植物常用的傳統內參基因mRNA的表達差異情況，并運用geNorm[10]、NormFinder[11]和BestKeeper[12]軟件對檢測結果進行表達穩定性分析，以期通過對這些內參基因的檢測和選擇，提高草地早熟禾基因表達分析的準確性，以及為早熟禾屬植物其他內參基因的開發提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選用的是草地早熟禾品種巴潤(Baron)，種子購自北京正道生態科技有限公司。試驗于2016年5-11月，在北京林業大學草坪實驗室進行。先將種子播種于穴盤中，發芽4周后，將幼苗移至花盆中，在長日照[14 h(晝)/10 h(夜)，光照強度2500 lx]人工氣候箱中培養[培養溫度(23±2) ℃，濕度60%～80%]，土壤基質為草炭、珍珠巖和蛭石(1∶1∶1)，每周澆灌霍格蘭營養液。

組織器官處理：分別采集健康生長的草地早熟禾的根系、葉片、葉鞘和莖。葉片生長期處理：采集健康生長草地早熟禾的幼葉(種子萌發后的第一片真葉)、分蘗期葉片和開花結籽后趨于衰老的葉片，樣本采集后液氮速凍，-80 ℃貯存備用。激素處理：選取長勢一致的草地早熟禾樣品分別噴施10 μmol/L脫落酸(abscisic acid，ABA)、10 μmol/L茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)和10 μmol/L赤霉素(gibberellin，GA)，分別于噴施激素的第0、3、6和12 h剪取葉片，液氮中速凍后保存于-80 ℃。非生物脅迫處理：用錫箔紙包裹草地早熟禾地上部分，模擬黑暗脅迫；以用剪刀修剪后的草樣模擬物理損傷；以12.5%的PEG 6000澆灌草地早熟禾，模擬干旱脅迫；以200 mmol/L NaCl澆灌草地早熟禾，模擬鹽脅迫；分別于脅迫后的第0、3、6和12 h取樣，液氮中速凍后保存于-80 ℃。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取與cDNA合成 按Trizol(Invitrogen，TaKaRa)總RNA提取試劑盒說明書提取各樣品的總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其完整性、純度和濃度。以總RNA為模板，合成cDNA(全式金，AE301)，儲存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2.2 內參基因cDNA片段的克隆 根據本實驗室草地早熟禾的轉錄組數據，用Primer Premier 5.0軟件設計擴增6個內參基因部分片段的引物(表1)，以葉片cDNA為模板進行普通PCR擴增，反應條件如下：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃再延伸5 min；12 ℃保溫。所得的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化回收，連接到pMD-19T載體上，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，PCR檢測陽性克隆后送北京睿博生物科技有限公司測序。

表1 用于克隆內參基因 cDNA片段的引物

1.2.3 qRT-PCR引物設計及普通PCR擴增 參照qRT-PCR引物設計的一般原則，根據上述得到的6個內參基因的cDNA序列，用Primer Premier 5.0設計用于熒光定量PCR的引物(表2)。為驗證設計引物的準確性，先進行普通PCR擴增，反應條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 5 min。待PCR反應結束后，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 用于定量分析候選內參基因的引物序列

1.2.4 內參基因的熒光定量PCR分析 利用BIO-RAD CFX Connect 96孔熒光定量儀，以康為世紀SYBR Green為反應Mix進行實時熒光定量分析。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，40個循環。每個樣品進行3次生物學重復和4次技術重復。

1.3 數據分析

利用Excel 2010計算分析每個樣品的Ct值和ΔCt值(ΔCt=Ct-Cmin，式中:Cmin代表樣品中的最低值，Ct代表每個樣品的值)，然后將所得的數據分別用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件分析6個候選內參基因在草地早熟禾不同組織、生長期、激素處理和非生物脅迫下的表達穩定性，比較穩定值大小及適宜選定的內參基因數量。

2 結果與分析

2.1 內參基因cDNA片段的克隆

以草地早熟禾葉片的cDNA為模板，對6個內參基因的cDNA片段進行擴增(圖1)，陽性克隆檢測結果顯示擴增長度與預期相符，用DNAMAN軟件和NCBI Blast分析表明所得片段是目的基因。

2.2 內參基因的普通PCR擴增

以草地早熟禾葉片的cDNA為模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，各引物擴增目標片段清晰可辨(圖2)，表明各候選內參基因引物特異性較好，可用于后續的qRT-PCR研究分析。

圖1 6個內參基因cDNA片段的克隆Fig.1 Cloning of six reference genesM：Maker；1: βtublin；2: UBQ；3: ACT；4: GAPDH；5: EF1α；6: 18s rRNA.

圖2 內參基因片段的普通PCR擴增Fig.2 Normal PCR amplification of reference gene fragmentsM：Maker；1: EF1α；2: UBQ；3: 18s rRNA；4: GAPDH；5: ACT；6: βtublin.

2.3 內參基因表達穩定性分析

2.3.1 geNorm分析軟件 通過將熒光定量PCR得到的循環閾值(Ct)轉換為相對定量數據，利用geNorm軟件分析出某一基因與其他基因兩兩比值的對數轉換值的平均變異度M值，并繪制出M值折線圖。M值越小，該內參基因越穩定。geNorm軟件的計算方法不受基因間極端比值和表達豐度差別的影響，可通過該軟件篩選出2個以上穩定表達的內參基因[9]。由geNorm分析結果可知(圖3)，不同候選內參基因在不同條件下的表達穩定性有所差異。在草地早熟禾葉片不同生長期(圖3A)，β-tublin和ACT的M值最小，表達最為穩定；在非生物脅迫下(圖3B)，18srRNA和EF-1α表達最為穩定；在不同激素處理下(圖3C)，18srRNA和β-tublin表達最為穩定；而在草地早熟禾不同組織器官中(圖3D)，UBQ和GAPDH表達最為穩定。

2.3.2 NormFinder分析軟件 NormFinder是基于方差分析的結果，利用ΔCt法對內參基因的表達穩定性進行直接評價，與geNorm類似，也產生基因表達穩定值，然后根據穩定值大小排名，但該軟件只能篩選出1個穩定表達的內參基因[10]。分析結果(表3)顯示，在草地早熟禾不同組織和葉片不同發育期中，GAPDH基因適宜做內參基因；在不同激素條件下18srRNA基因更適合做內參基因進行基因表達分析；在非生物脅迫下，EF-1α最適宜做校正基因。

2.3.3 BestKeeper分析軟件 BestKeeper是通過標準偏差SD值對候選基因的穩定性進行評價和排序, SD值越小，該基因的穩定性越好；若SD>1，則認為該基因不穩定[11]。分析結果表明(表4)，草地早熟禾不同組織中候選內參基因的穩定性由高到低排序是：18srRNA>GAPDH>UBQ>ACT>β-tublin>EF-1α；不同生長期的順序是：ACT>GAPDH>UBQ>EF-1α>β-tublin>18srRNA；不同激素處理后穩定性由高到低的順序是：β-tublin>18srRNA>ACT>GAPDH>UBQ>EF-1α；而草地早熟禾在非生物脅迫下候選內參基因的穩定性為18srRNA>EF-1α>ACT>β-tublin>GAPDH>UBQ。

圖3 geNorm軟件分析候選內參基因的表達穩定值(M)Fig.3 Expression stability values (M) of candidate reference genes calculated by geNorm A：生長期Development stages；B：非生物脅迫Abiotic stress；C：激素處理Hormone treatment；D：組織器官Tissues and organs.

基因Genename組織Tissues穩定值Stablevalue排名Rankling生長期Developmentstages穩定值Stablevalue排名Rankling激素處理Hormonetreatment穩定值Stablevalue排名Rankling非生物脅迫Abioticstress穩定值Stablevalue排名RanklingGAPDH0．01410．00910．85241．7045β?tublin0．01720．01540．31021．429318srRNA0．03030．07160．20811．1312ACT0．03030．01330．43831．6254UBQ0．03550．01852．28361．7576EF?1α0．07460．01221．43450．7081

表4 BestKeeper數據分析的SD值及排名

SD:標準偏差Standard deviation.

從以上3個分析軟件對6個候選基因在草地早熟禾不同組織器官、生長期、激素和非生物脅迫下穩定性分析的結果中，可以看出：1)GAPDH最適合作草地早熟禾不同組織器官的內參基因，其他候選內參基因穩定性較差，不適合用于組織器官間的基因表達分析； 2)β-tublin和18srRNA最適合作草地早熟禾在不同激素誘導下的內參基因； 3)EF-1α最適合作草地早熟禾在非生物脅迫下的校正基因；4)ACT最適合作草地早熟禾葉片不同發育時期的內參基因，但其他5個基因NormFinder分析的M值均小于0.5(M值小于0.5可視為穩定性較好)，表達穩定，這說明6個候選內參基因在草地早熟禾葉片發育不同時期的基因表達分析中均可用作校正基因。

3 討論

目前，在多年生黑麥草(Loliumperenne)[13]、二穗短柄草[4]、小麥[6]和鴨茅[7]等禾本科植物中已經有了關于內參基因穩定性篩選的報道，結合本研究結果可以看出，不同內參基因在禾本科中的穩定性各不相同。由于發現新的內參基因技術要求較高，且步驟繁瑣、工作量大，因此，本研究選用6個傳統的基因作為候選內參基因，它們本身拷貝數高、保守性強，表達水平一致。其中，GAPDH參與糖酵解過程中第一個ATP的形成等[14]；β-tublin是細胞骨架微絲的基本構成單位；18srRNA參與編碼核糖體核基因[15]，并參與核糖體循環[16]。ACT因其保守性是研究和使用較多的看家基因，它參與細胞分裂等很多重要的細胞生理活動[17-18]，但并不是所有的物種都適合用ACT做內參基因；UBQ基因參與生物體內諸如基因轉錄、細胞死亡等生理活動[19]。植物延伸因子EF-1α在蛋白質合成延伸過程中起重要作用，是真核生物細胞內的第二大類蛋白[20]。

3種分析方法結果表明，在非生物脅迫下，草地早熟禾EF-1α基因的表達穩定性最好，可能是物種親緣關系相近，該結果與非生物脅迫下多年生黑麥草[13]和毒麥(Loliumtemulentum)[21]最適合內參基因的結果相一致；ACT作為內參基因曾廣泛應用于多種動植物的基因表達分析中，但越來越多的試驗證明，ACT在不同的條件下表達并不穩定，且更容易受外界因素的影響。在本研究中，從綜合分析結果來看，ACT僅在葉片同發育期表達最為穩定。即使GAPDH在木瓜(Caricapapaya)[22]、水稻(Oryzasativa)[23]和煙草(Nicotianatabacum)[24]等植物中不適合作不同組織器官的內參基因，但本研究結果表明，GAPDH在草地早熟禾不同組織器官中穩定性最好，是首選的內參基因。在本試驗中，18srRNA在不同條件下表達豐度最高，穩定性較好，但考慮到18srRNA易受不同樣本所提取的RNA質量、rRNA和mRNA不恒定比例、藥物及目標基因表達豐度與其相差太大等影響，不建議使用18srRNA作為內參基因，但若目標基因表達豐度較高，18srRNA也是不錯的選擇。而且根據試驗需要，也可以選擇兩個或兩個以上內參基因組合進行基因表達性分析。

本研究利用3個不同的軟件分析以上6個候選內參基因在草地早熟禾組織器官、葉片不同生長發育期、激素誘導和非生物脅迫下的表達穩定性，結果顯示在不同條件下，各候選內參基因的穩定性存在一定的差異，可能是由于組織樣品和脅迫環境的不同導致各個候選基因參與的細胞代謝不同所致[25]。當然，在分子生物技術突飛猛進的基因組時代，草地早熟禾后期內參基因的篩選肯定不再局限于幾個傳統的內參基因，可以通過利用模式植物對其進行全基因組搜索并通過實驗驗證來獲取可靠基因[26]；也可以對草地早熟禾進行全基因組測序來發現更多未知且恒定表達的內參基因。

4 結論

本研究對草地早熟禾6個內參基因(ACT、GAPDH、UBQ、EF-1α、18srRNA和β-tublin)進行熒光定量PCR表達穩定性分析，結果表明，在研究草地早熟禾不同組織器官的基因表達分析時，建議選擇GAPDH作為內參基因；研究葉片不同發育期的基因表達分析時首選ACT基因；雖然EF-1α表達豐度較其他5個候選內參較低，但因其在非生物脅迫下穩定性最好，因此，研究草地早熟禾非生物脅迫下基因的表達分析首選EF-1α；研究草地早熟禾在不同激素誘導下基因的表達分析時建議選擇β-tublin基因。本研究篩選出的不同條件下適宜的內參基因將有助于提高草地早熟禾基因表達分析的準確性，也為早熟禾屬植物其他內參基因的開發提供了理論依據和參考。

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Screening of reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR in Kentucky bluegrass

ZHANG Lan, TAN Peng-Hui, TENG Ke, YAN Meng-Ju, HE Chun-Yan, GAN Lu, YIN Shu-Xia*

InstituteofTurfgrassScience,CollegeofForestry,BeijingForestryUniversity,Beijing100083,China

To select the most stable reference genes of Kentucky bluegrass (Poapratensis) for real-time quantitative PCR, we assessed the mRNA expression in different tissues of six traditional candidate reference genes at various leaf development stages, under abiotic stress, or following various hormone applications. Genes assessed includedACT,GAPDH,UBQ,EF-1α, 18srRNAandβ-tubulin. The expression stabilities of these six reference genes were evaluated by geNorm, NormFinder and BestKeeper. It was found that mRNA expression of the candidate reference genes differed significantly between the tissue types, developmental stages, hormone applications or under abiotic stress. In Kentucky bluegrass leaves,GAPDHis recommended as the reference gene for analyzing the mRNA expression in different tissues;EF-1αwas the most stable gene under abiotic stress;β-tubulinwas most consistent with different hormones;ACTwas stably expressed in the different leaf development stages. In conclusion, use of the most appropriate reference genes under different conditions would enhance the accuracy analysis of gene expression in the Kentucky bluegrass. These findings may be applicable when selecting reference genes for analysis of mRNA expression in other members of thePoagenus.

Kentucky bluegrass; quantitative real time PCR; reference genes; expression stability evaluation

2016-08-17；改回日期：2016-12-06

國家自然基金項目(31302016)和深圳市科技計劃項目(JSGG20160229155434792)資助。

張蘭(1990-)，女，甘肅平涼人，在讀碩士。E-mail: zhangdalan@bjfu.edu.cn*通信作者Corresponding author. E-mail: yinsx369@bjfu.edu.cn

10.11686/cyxb2016297 http://cyxb.lzu.edu.cn

張蘭, 檀鵬輝, 滕珂, 閆蒙舉, 何春燕, 甘露, 尹淑霞. 草地早熟禾熒光定量PCR分析中內參基因的篩選. 草業學報, 2017, 26(3): 75-81.

ZHANG Lan, TAN Peng-Hui, TENG Ke, YAN Meng-Ju, HE Chun-Yan, GAN Lu, YIN Shu-Xia. Screening of reference genes for real-time fluorescence quantitative PCR in Kentucky bluegrass. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(3): 75-81.