牛血清白蛋白與槲皮素及花青素相互作用方式及其納米顆粒特征的比較

劉建壘，邢效娟，周 瑞，景 浩

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

牛血清白蛋白與槲皮素及花青素相互作用方式及其納米顆粒特征的比較

劉建壘，邢效娟，周 瑞，景 浩*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

實驗比較了牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與脂溶性小分子槲皮素（quercetin，QUE）和水溶性花青素（anthocyanin，ACN）相互作用方式及其納米顆粒的特征。QUE對BSA熒光猝滅作用為靜態猝滅方式（低濃度），但在較高濃度時為靜態與動態并存的復合猝滅方式，兩者的相互作用力為疏水作用力；ACN對BSA的熒光猝滅程度小于QUE對BSA的，為靜態猝滅方式，相互作用力為靜電作用力。BSA與QUE的結合常數大于BSA與ACN的結合常數。BSA與QUE或ACN相互作用可形成納米顆粒，其大小分別為42.5 nm和53.7 nm，ζ-電勢分別為－25.64 mV和－21.50 mV。1 mol BSA分子可分別與8 mol QUE和10 mol ACN結合。BSA與QUE形成的納米顆粒（BSA-QUE）粒徑較BSA與ACN（BSA-ACN）的小，且穩定性較高。BSA-QUE對DPPH自由基和ABTS＋·清除率均高于BSA-ACN。

牛血清白蛋白；槲皮素；花青素；相互作用；納米顆粒

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是牛血清中最主要的蛋白質，其來源豐富，價格便宜，在水中溶解性較好，容易純化，具有較好的小分子物質結合特性[1]。BSA是單鏈蛋白質，由583 個氨基酸殘基組成，含3 個結構相似的結構域（domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每個結構域包含2個亞結構域（ⅠA、ⅠB，ⅡA、ⅡB，ⅢA、ⅢB），它們聚集在一起形成了一個不對稱的心形結構，心形結構的內部集中了所有的疏水性氨基酸，構成了疏水性內核和親水性外殼，這使BSA與親水性和疏水性小分子物質均可發生相互作用[2-3]。

槲皮素（quercetin，QUE）和花青素（anthocyanin，ACN）廣泛存在于水果、蔬菜和谷物中。QUE又稱五羥基黃酮，在A、B和C 3 個芳香環骨架上的3、5、7、3’位和4’位上的氫原子被羥基取代（圖1A）。由于槲皮素為平面型分子，分子堆砌較緊密，分子間引力較大，不易被溶劑或溶質分散，所以槲皮素的水溶性較差，在水中的溶解度約1?μg/mL，在模擬胃液中的溶解度為5.5?μg/mL，在模擬腸液中的溶解度為28.9?μg/mL[4-5]；也不溶于乙醚、苯、氯仿、石油醚等；但可溶于冰醋酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶劑[6]。ACN屬于水溶性多酚類化合物，它的基本結構為2-苯基苯并吡喃陽離子，根據3’位及5’位的取代基不同，可將ACN分為6 種：錦葵素類、牽牛素類、芍藥素類、天竺葵素類、飛燕草素類和矢車菊素類[7]，其中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷最常見[8]（圖1B）。不同性質的小分子化合物與BSA的相互作用方式不同[9]。如，在10%二甲基亞砜溶液中脂溶性的QUE對BSA的熒光有較強的猝滅作用，猝滅方式為靜態與動態并存的復合方式，兩者的相互作用力為疏水作用力和氫鍵；而在10%二甲基亞砜溶液中水溶性的萊菔硫烷對BSA的熒光也有較強的猝滅作用，猝滅方式為靜態猝滅，兩者的相互作用力為氫鍵、范德華力和疏水作用力[10]。目前報道的BSA與小分子化合物相互作用的研究多為單一小分子或同性質的小分子進行比較；而對BSA與不同性質的小分子化合物相互作用的比較缺乏研究。因此，本研究以QUE（脂溶性）和ACN（水溶性）為代表，采用熒光光譜法，比較研究BSA與生物活性小分子相互作用方式；采用動態光散射法分析BSA與QUE及ACN納米顆粒的顆粒特性，并比較了相互作用后形成的納米顆粒的抗氧化活性。

圖 1 槲皮素（A）和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（B）結構圖Fig. 1 Chemical structures of quercetin (A) and cyanidin-3-glucoside (B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA（fraction V，純度≥98%，分子質量66.43 ku）美國Amresco公司；QUE（色譜級，純度≥95%，相對分子質量302.24） 美國Sigma公司；篤斯越橘花青素提取物（以多酚為主要成分，約占提取物的65%～66%，提取物還含有糖11.7%、水分12.2%、蛋白質3.2%、灰分0.9%及油脂0.6%） 大興安嶺華野生物工程有限公司。篤斯越橘花青素提取物進一步經過XAD-7樹脂柱分離純化，得到純化的ACN，其中80.94%為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS）二銨鹽（均為分析純）美國Sigma公司；去離子水（deionized water，dH2O）北京科豐正業有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司；F-7000型熒光分光光度計 日本Hitachi公司；Nano-ZS90型納米粒度儀 英國Malvern Instruments公司；XB 220A型電子天平 瑞士Precisa Gravimetrics AG公司；QL-901型旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C＋型酸度計 成都世紀方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BSA-QUE和BSA-ACN溶液的制備

用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4）配制濃度為1.5×10－4mol/L的BSA儲備液。用DMSO配制濃度為18×10－3mol/L的QUE母液，再用DMSO稀釋分別得到濃度為1.5×10－3、3.0×10－3、6.0×10－3、9.0×10－3、12.0×10－3、15.0×10－3mol/L的QUE儲備液。用dH2O配制濃度為18×10－3mol/L的ACN母液（此處為了計算方便，統一使用篤斯越橘中含量最高的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對分子質量449.2作為ACN的近似相對分子質量進行處理），用dH2O稀釋分別得到濃度為1.5×10－3、3.0×10－3、6.0×10－3、9.0×10－3、12.0×10－3、15.0×10－3mol/L的ACN儲備液。

BSA-QUE和BSA-ACN復合物溶液的制備：在15 mL離心管中先加入8.9 mL PBS（pH 7.4），其次加入1 mL BSA儲備溶液，用旋渦混合器混1 min，最后分別加入0.1 mL不同濃度的QUE或ACN儲備液，用旋渦混合器混5 min，室溫條件下靜置待測。其中BSA的終濃度為1.5× 10－5mol/L；QUE或ACN的終濃度分別為0.0、1.5×10－5、3.0×10－5、6.0×10－5、9.0×10－5、12.0×10－5、15.0×10－5、18.0×10－5mol/L；QUE或ACN與BSA濃度比分別為0、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1。

1.3.2 熒光光譜測定

按照1.3.1節方法分別配制BSA-QUE和BSA-ACN復合物溶液并測定其熒光光譜，其中BSA的終濃度是1.5× 10－5mol/L，QUE及ACN的終濃度分別為0.0、1.5×10－5、3.0×10－5、6.0×10－5、9.0×10－5、12.0×10－5、15.0×10－5、18.0×10－5mol/L。準確移取3.0 mL上述溶液于石英熒光池中（1 cm×1 cm），測定發射熒光光譜。激發波長為280 nm，發射波長為343 nm，狹縫分別為2 nm（激發）和5 nm（發射）；控制溶液溫度分別為25（298 K）、30（303 K）、35 ℃（308 K）。將熒光強度分別帶入Stern-Volmer方程（1）和對數方程（2）計算猝滅常數KSV、結合常數K和結合位點數n[11-12]。

式中：F0和F分別為QUE或ACN加入前后BSA的熒光強度；C為QUE或ACN的濃度/（mol/L）；KSV為動態猝滅常數/（L/mol）。

根據熱力學參數之間的關系式（3）和（4）計算BSA與QUE或ACN相互作用過程中的吉布斯自由能ΔG/（kJ/mol）、焓變ΔH/（kJ/mol）和熵變ΔS/（J/（mol·K））[13]。

式中：K1和K2分別為對應溫度條件下的結合常數/（L/mol）；T1和T2分別為不同溫度/K；R為理想氣體常數8.314 J/（mol?K）。

1.3.3 結合量的測定

BSA與QUE及ACN的結合量的測定采用Fang Ru等[14]的方法，通過鹽析法使體系中BSA納米顆粒沉淀析出，從而將結合在納米顆粒中的 QUE及ACN和未結合的 QUE及ACN分開。制備BSA與QUE及ACN復合物，使QUE及ACN與BSA濃度比為0、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1、22∶1、24∶1；BSA的終濃度為1.5×10－5mol/L；QUE及ACN的終濃度分別是0、3×10－5、6×10－5、9×10－5、12×10－5、15×10－5、18×10－5、21×10－5、24×10－5、27×10－5、30×10－5、33×10－5mol/L和36×10－5mol/L。在配制的納米顆粒溶液（10 mL）中，緩慢加入硫酸銨粉末并不斷攪拌，直至體系中有未溶解的硫酸銨；靜置20 min，然后取出上清液，4 ℃條件下，10 000×g離心30 min。取上清液，用紫外-可見分光光度法測定其吸光度，然后根據QUE及ACN的濃度與吸光度標準曲線計算出游離QUE及ACN的濃度。用總的QUE及ACN的濃度減去游離QUE及ACN的濃度可計算得到每摩爾BSA結合QUE或ACN的物質的量（mol QUE/mol BSA或mol ACN/mol BSA）。

1.3.4 粒徑及ζ-電勢測定

按照1.3.1節方法分別配制復合物BSA-QUE和BSAACN，其中BSA的終濃度是1.5×10－5mol/L，QUE及ACN的終濃度為1.5×10－4mol/L。測量溫度25 ℃，平衡時間120 s，散射角90°，每個樣品測3 次。實驗數據通過馬爾文儀器自帶軟件Zetasizer軟件進行分析，得到粒徑、多分散系數（polydispersity index，PdI）和ζ-電勢。

1.3.5 自由基清除率的測定

在BSA的濃度為1.5×10－5mol/L，QUE及ACN的濃度均為1.5×10－4mol/L條件下，比較BSA、QUE、ACN、BSA-QUE及BSA-ACN對DPPH自由基和ABTS＋·的清除率大小。

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的檢測參照Dong Xueyan等[15]的方法。配制2.5 mmol/L DPPH的無水乙醇儲備液，4 ℃避光保存備用。使用時再用無水乙醇稀釋，制備0.15 mmol/L的DPPH工作液。取96 孔測試板，每孔依次加入樣品溶液（15?μL）和0.05 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4，60?μL）以及DPPH工作液（150?μL）（Asample）。以PBS加DPPH工作液為空白對照（Ablank），同時用樣品加無水乙醇溶液作為樣品顏色參比（Acontrol）。振蕩混合均勻，避光室溫條件下放置30 min后，用酶標儀測定520 nm波長處的吸光度。依據公式（5）計算DPPH自由基清除率。1.3.5.2 ABTS＋·清除率的測定

ABTS＋·的檢測參照Dong Xueyan等[15]的方法。配制140 mmol/L ABTS儲存液，放在－20 ℃避光保存備用。使用時，再用dH2O稀釋，制備14 mmol/L的ABTS工作液。將ABTS工作液與4.9 mmol/L的過硫酸鉀溶液充分混勻，使ABTS和過硫酸鉀終濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L。避光室溫條件下放置13 h。然后將其用dH2O稀釋至吸光度（630 nm波長處）為0.50左右。取96 孔測試板，每孔依次加入樣品溶液（10?μL）和ABTS稀釋液（90?μL）（Asample）。以PBS加ABTS工作液為空白對照（Ablank），同時用樣品加dH2O作為樣品顏色參比（Acontrol）。振蕩混合均勻，室溫放置4 min后，用酶標儀測定630 nm波長處的吸光度。ABTS＋·清除率也按照公式（5）進行。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 BSA-QUE及BSA-ACN的熒光猝滅光譜

圖 2 BSA-QUE（A）和BSA-ACN（B）的熒光光譜Fig. 2 Effect of QUE (A) and ACN (B) on the fl uorescence emission spectrum of BSA

隨著QUE濃度的增加，復合物溶液熒光強度逐漸降低，且熒光峰從343 nm移動到340 nm（圖2A）。隨著ACN濃度的增加，BSA的熒光強度也逐漸降低，且熒光峰的位置（343 nm）沒有發生變化（圖2B）。當QUE和ACN與BSA濃度比為12∶1時，QUE可以幾乎完全猝滅復合物溶液的熒光，而ACN對復合物溶液的熒光猝滅程度小。復合物溶液熒光強度減少，表明QUE和ACN與BSA之間存在相互作用。BSA的熒光主要由其中的色氨酸和酪氨酸殘基產生，酪氨酸和色氨酸的最大熒光發射波長分別為304 nm和340 nm。因為在304 nm處未見熒光峰，只在343 nm處測定到熒光發射波峰，故此處的熒光變化主要反映BSA中色氨酸殘基的熒光變化[16]。Xiao Jianbo等[17]研究表明，小分子物質（槲皮素、槲皮苷、山柰酚、楊梅黃酮及高良姜素）對BSA熒光猝滅的程度越大，小分子越接近BSA的色氨酸殘基。QUE較ACN對復合物溶液的熒光猝滅的程度較大，表明QUE較ACN更接近于BSA的色氨酸殘基。

前期實驗中發現DMSO溶劑含量為10%時，對BSA的熒光峰沒有明顯影響[14]。本實驗所有樣品中DMSO的含量均為1%，對QUE與BSA相互作用的影響亦可以忽略。在激發波長為280 nm時，QUE和ACN在發射波長

290～420 nm范圍內的熒光強度幾乎為0[18-19]。因此，采用BSA的激發波長280 nm作為體系的熒光激發波長。

2.2 BSA與QUE及ACN相互作用的熒光猝滅機理與結合常數

圖 3 QUE（A）和ACN（B）對BSA的熒光猝滅曲線Fig. 3 Fluorescence quenching curves of BSA by QUE (A) and ACN (B) based on Stern-Volmer equation

表 1 不同溫度BSA-QUE和BSA-ACN的猝滅常數KSVTable 1 Quenching constants of BSA-QUE and BSA-ACN at different temperatures

根據QUE及ACN對BSA的熒光猝滅光譜，繪制猝滅曲線（圖3）。選取猝滅曲線中呈線性相關部分的QUE和ACN的濃度計算得出猝滅常數（KSV）（表1）。由圖3A可知，隨著QUE濃度的增加（0.0～9.0×10－5mol/L），F0/F逐漸變大，且呈線性關系；當QUE濃度繼續增加（9.0×10－5～18.0×10－5mol/L）時，F0/F增加速率變快，猝滅曲線逐漸向Y軸傾斜。由圖3B可知，隨著ACN濃度的增加（0.0～18.0×10－5mol/L），F0/F逐漸變大，且呈線性關系。當QUE和ACN的濃度分別為0.0～9.0×10－5mol/L和0.0～18.0×10－5mol/L時，猝滅常數KSV隨溫度的升高而減小，且BSA-QUE的猝滅常數大于BSA-ACN的猝滅常數。

靜態猝滅和動態猝滅是BSA和小分子相互作用常見的熒光猝滅方式。小分子導致BSA由激發態返回到基態，不發射光子，為動態猝滅過程。隨著體系溫度升高，動態猝滅效應增強[20]。小分子與BSA在基態時生成不發光的配合物，從而導致熒光強度降低的過程為靜態猝滅過程。猝滅常數KSV表示成雙分子猝滅和與單分子衰變的速率常數，其大小反映了猝滅劑對熒光分子的接觸程度和反應速率[21]。通過不同溫度條件下的猝滅常數變化，可以區分出動態和靜態猝滅方式。動態猝滅與擴散系數有關，隨著溫度升高擴散系數增大，熒光猝滅程度增大，猝滅常數增大。靜態猝滅源于相對穩定的復合物，溫度升高可能引起復合物的穩定性下降，使熒光猝滅程度降低，猝滅常數減小。結果表明，當QUE和ACN的濃度分別為0.0～9.0×10－5mol/L和0.0～18.0× 10－5mol/L時，QUE及ACN對BSA的熒光猝滅屬于靜態猝滅，即分別形成了BSA-QUE和BSA-ACN復合物，且隨著溫度的升高（298～308 K），BSA-QUE比BSA-ACN更穩定。當QUE的濃度大于9.0×10－5mol/L時，QUE對BSA的熒光猝滅方式是靜態和動態猝滅并存，而不是單一的靜態猝滅方式。總之，QUE與BSA相互作用在低濃度時主要是通過靜態猝滅的方式，而隨著濃度的增加，出現動態猝滅的方式；而ACN與BSA相互作用主要是通過靜態猝滅的方式，且不隨著ACN濃度的增加而改變。

表 2 不同溫度BSA-QUE和BSA-ACN的結合常數K及結合位點數nTable 2 Binding constants (K） and binding sites (n）of BSA-QUE and BSA-ACN at different temperatures

對于靜態猝滅方式，不同溫度條件下的結合常數K和結合位點數n都可以根據lg（（F0－F）/F）－lgC計算出來，結果見表2。在溫度為298、303 K和308 K時，BSA與QUE的結合常數分別為8.56×104、9.82×104L/mol和1.22×105L/mol，結合位點數均接近于1；BSA與ACN的結合常數分別為6.45×104，6.07×104L/mol和6.03× 104L/mol，結合位點數均接近于1。隨著溫度的升高，BSA與QUE的結合常數隨著溫度的升高而增大，而BSA與ACN的結合常數隨著溫度的升高而減小，且BSA與QUE之間的結合常數大于BSA-ACN之間的結合常數。BSA與QUE及ACN的結合位點數幾乎是不受溫度變化的影響。結果表明BSA和QUE及ACN之間有很強的結合力，形成了一個結合位點，且BSA與QUE之間的結合力大于BSA與ACN之間的結合力。Tang Lin等[18]報道，在Tris-HCl（pH 7.4）中，BSA和ACN相互作用的結合位點為BSA亞結構域ⅡA中的第一個結合位點。此外，由于結合常數及結合位點數只能在靜態猝滅的前提下計算，需要選取猝滅曲線中呈線性相關部分的QUE和ACN的濃度進行計算，所以采用的QUE和ACN的濃度比不一致。

2.3 BSA與QUE及ACN相互作用的熱力學參數和作用力

表 3 不同溫度BSA-QUE和BSA-ACN結合的熱力學參數Table 3 Thermodynamic constants of BSA-QUE and BSA-ACN at different temperatures

根據熱力學參數之間的關系式可以計算得到相互作用的焓變ΔH、熵變ΔS和吉布斯自由能變ΔG，結果見表3。BSA與QUE相互作用的ΔH＞0，而BSA與ACN的ΔH＜0。QUE和ACN與BSA相互作用，它們的熱力學參數均為ΔS＞0和ΔG＜0。蛋白質與小分子間的相互作用可能是通過范德華力、疏水力、靜電吸引力或氫鍵等[22]。根據ΔH和ΔS可以推斷出小分子與蛋白質之間相互作用的方式：當ΔS和ΔH都大于0時，為疏水作用力；當ΔS和ΔH都小于0時，為氫鍵和范德華力；當ΔS＞0，ΔH＜0時，主要為靜電作用[23]。由此可以推知，BSA與QUE間疏水作用力起主要作用力，而BSA與ACN間靜電作用力起主要作用。

BSA與小分子（QUE或ACN）的結合是一個自由能降低的自發過程（ΔG＜0）。ΔG絕對值越大，結合作用越強[24]，即BSA與QUE的結合作用強于BSA與ACN的結合作用，該結果與結合常數所得結論一致。前期研究報道，在10% DMSO溶液中，BSA與QUE的相互作用力為疏水作用力[25]；在0.1 mol/L的NaCl緩沖液（pH 7.4）中，BSA與ACN的相互作用力主要是靜電引力[26]，都與本實驗結果一致。但也有實驗表明，在dH2O、NaCl和PBS 3 種溶液中，BSA與ACN分子間的相互作用力為氫鍵和范德華力[27]。這與本實驗結果不一致，可能是由于熒光測定方法和計算不同所致。

2.4 BSA與QUE及ACN相互作用結合量

圖 4 BSA對QUE及ACN的結合量Fig. 4 Binding capacity of BSA with QUE or ACN

隨著QUE與BSA的濃度比由0增加到10∶1，與BSA結合的QUE也逐漸增加；當QUE與BSA的濃度比達到10∶1時，即體系中QUE的濃度達到1.5×10－4mol/L時，BSA對QUE的結合達到了飽和。1 mol BSA可結合8 mol QUE。隨著ACN與BSA的濃度比由0增加到20∶1，與BSA結合的ACN也逐漸增加；當ACN與BSA的濃度比達到20∶1時，即體系中ACN的濃度達到3.0×10－4mol/L時，BSA對ACN的結合達到了飽和。1 mol BSA可結合10 mol ACN（圖4）。BSA與ACN的結合量高于BSA與QUE的結合量。

董學艷[10]報道，在dH2O和10% DMSO中，當QUE與BSA的濃度比分別達到20∶1和14∶1時，即體系中QUE的濃度分別達到3.0×10－4mol/L和2.1×10－4mol/L時，BSA對QUE的結合達到了飽和。在dH2O體系中，1 mol BSA分子上結合的QUE量為17 mol；在10% DMSO體系中，1 mol BSA分子上結合的QUE量為6 mol。DMSO中的S＝O基團具有較強的氧化性，可能會破壞BSA的二級結構α-螺旋中的氫鍵，使得內部的疏水基團暴露，導致BSA分子疏水聚集，結果使得BSA結合QUE的面積減少、結合QUE的量相應減少。為了更直觀地比較BSA-QUE和BSA-ACN相互作用及形成納米顆粒的特征，在后面的實驗中QUE及ACN與BSA的濃度比設置為10∶1。

雖然通過計算得到的BSA與QUE及ACN的結合位點數均接近于1，但實際測得1 mol BSA可分別結合8 mol QUE或10 mol ACN。這是可能是由于通過模型計算，只能得到高親結合力的結合位點數[28]，因此有一定的局限性。理論計算得到的位點可能反映的只是主要結合區域，故可以有多個小分子聚集。

2.5 BSA-QUE和BSA-ACN粒徑和ζ-電勢的比較

表 4 BSA-QUE和BSA-ACN納米顆粒的粒徑、多分散系數和ζ-電勢Table 4 Particle sizes, polydispersity index and ζ-potential of BSA-QUE and BSA-ACN nanoparticles

由表4可知，BSA、BSA-QUE和BSA-ACN的平均粒徑分別為24.7、42.5 nm和53.7 nm。BSA、BSA-QUE和BSA-ACN的多分散系數（PdI）分別為0.174、0.107和0.185。粒徑大小不一可能是由于BSA和QUE及ACN的相互作用力大小不同，當溫度為25 ℃時，BSA和QUE的相互作用力大于和ACN的相互作用力，所以BSA-QUE粒徑較小。

在PBS（pH 7.4）中，BSA、BSA-QUE和BSA-ACN的ζ-電勢分別為－22.57、－25.64 mV和－21.50 mV。BSA-QUE較BSA的ζ-電勢減小，BSA-ACN較BSA的ζ-電勢變大。顆粒的ζ-電勢對于顆粒的穩定性非常重要，當顆粒的ζ-電勢絕對值大于30 mV時，表明顆粒很穩定，當顆粒的ζ-電勢絕對值小于20 mV時，表明顆粒更易聚集[29]。BSA-QUE的ζ-電勢比BSA-ACN的更接近于－30 mV，因此BSA-QUE納米顆粒更穩定，該結果和相互作用力及粒徑結果相一致。

2.6 BSA對QUE及ACN抗氧化活性的影響

表 5 BSA-QUE和BSA-ACN納米顆粒的DPPH自由基和ABTS＋·清除率Table 5 DPPH and ABTS radical scavenging rates of BSA-QUE and BSA-ACN nanoparticles%

當QUE的濃度為1.5×10－4mol/L時，QUE和BSAQUE的DPPH自由基清除率分別為45.8%和53.1%；ABTS＋·清除率分別為78.6%和85.0%。當ACN的濃度為1.5×10－4mol/L時，ACN和BSA-ACN的DPPH自由基的清除率分別為22.5%和25.0%，ABTS＋·的清除率分別為45.4%和58.5%（表5）。BSA-QUE及BSA-ACN的自由基清除率均小于單獨QUE及ACN的自由基清除率與BSA的自由基清除率的理論加和計算值，且QUE和BSA-QUE的自由基清除率均高于ACN和BSA-ACN的自由基清除率。

QUE和ACN均具有較好DPPH自由基和ABTS＋·清除作用。它們的抗氧化作用主要與其結構中的酚羥基有關。QUE的抗氧化作用主要來自其A環上的5-OH和7-OH以及B環上的3’-OH和5’-OH的貢獻；ACN的抗氧化作用主要來自其A環上的5-OH的貢獻[30-31]。早期研究表明，BSA可以與QUE的A環上5-OH形成分子間氫鍵[14]。BSA與QUE或ACN的酚羥基形成氫鍵，會導致抗氧化基團的屏蔽，從而不同程度減弱QUE及ACN的自由基清除能力。

3 結 論

QUE和ACN對BSA均有較強的熒光猝滅作用，但兩者的猝滅程度和猝滅方式有所不同。QUE對BSA的熒光猝滅程度大于ACN對BSA的。QUE對BSA的熒光猝滅在低濃度時為靜態猝滅方式，在高濃度時為靜態與動態并存的復合猝滅方式；而ACN對BSA的熒光猝滅為靜態猝滅方式。BSA與QUE的相互作用力為疏水作用力，而與ACN的相互作用力則為靜電作用力；且BSA與QUE的結合力大于BSA與ACN的；QUE與BSA的結合量小于ACN與BSA的。BSA與QUE形成的納米顆粒粒徑較BSA與ACN的小，且穩定性較高。BSA-QUE對DPPH自由基和ABTS＋·的清除率均高于BSA-ACN。

參考文獻：

[1] ELZOGHBY A O, SAMY W M, ELGINDY N A. Albumin-based nanoparticles as potential controlled release drug delivery systems[J]. Journal of Controlled Release, 2012, 157(2): 168-182. DOI:10.1016/ j.jconrel.2011.07.031.

[2] PETERS T. All about albumin: biochemistry, genetics, and medical applications[M]. San Diego: Academic Press, 1996: 9-34.

[3] CARTER D C, HO J X. Structure of serum albumin[J]. Advances in Protein Chemistry, 1994, 45: 153-203. DOI:10.1016/S0065-3233(08)60640-3.

[4] CAI X, FANG Z, DOU J, et al. Bioavailability of quercetin: problems and promises[J]. Current Medicinal Chemistry, 2013, 20(20): 2572-2582. DOI:10.2174/09298673113209990120.

[5] MANACH C, WILLIAMSON G, MORAND C, et al. Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. review of 97 bioavailability studies[J]. The American Journal of Clinical Nutrition, 2005, 81(Suppl 1): 230-242.

[6] 李素云, 李崢, 李敬來, 等. 槲皮素及其糖苷衍生物的研究進展[J]. 解放軍藥學學報, 2011, 27(6): 540-543. DOI:10.3969/ j.issn.1008-9926.2011.06.024.

[7] FENNEMA O R. Food chemistry[M]. 王璋, 許時嬰, 江波, 等譯. 3版.北京: 中國輕工業出版社, 2003: 569-570.

[8] ZHENG N, BUCHELI P, JING H. Effects of casein- and whey protein-dextran conjugates on the stability of bog bilberry anthocyanin extract[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2009, 44(7): 1452-1458. DOI:10.1111/j.1365-2621.2009.01979.x.

[9] PAPADOPOULOU A, GREEN R J, FRAZIER R A. Interaction of flavonoids with bovine serum albumin: a fluorescence quenching study[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(1): 158-163. DOI:10.1021/jf048693g.

[10] 董學艷. 牛血清白蛋白與槲皮素和萊菔硫烷相互作用模式及納米顆粒形成的比較研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2014: 56-57.

[11] van de WEERT M. Fluorescence quenching to study protein-ligand binding: common errors[J]. Journal of Fluorescence, 2010, 20(2): 625-629. DOI:10.1007/s10895-009-0572-x.

[12]?GONG?A,?ZHU?X,?HU?Y,?et?al.?A?f l uorescence?spectroscopic?study?of?the interaction between epristeride and bovin serum albumine and its analytical application[J]. Talanta, 2007, 73(4): 668-673. DOI:10.1016/ j.talanta.2007.04.041.

[13] YE J, FAN F, XU X, et al. Interactions of black and green tea polyphenols with whole milk[J]. Food Research International, 2013, 53(1): 449-455. DOI:10.1016/j.foodres.2013.05.033.

[14] FANG R, JING H, CHAI Z, et al. Design and characterization of protein-quercetin bioactive nanoparticles[J]. Journal of Nanobiotechnology, 2011, 9: 19. DOI:10.1186/1477-3155-9-19.

[15] DONG X, ZHOU R, JING H. Characterization and antioxidant activity of bovine serum albumin and sulforaphane complex in different solvent systems[J]. Journal of Luminescence, 2014, 146: 351-357. DOI:10.1016/j.jlumin.2013.09.078.

[16] 肖建波. 多酚類化合物與血清白蛋白相互作用的結構—結合力關系、理論模型和應用研究[D]. 長沙: 中南大學, 2009: 82.

[17] XIAO J, SUZUKI M, JIANG X, et al. Influence of B-ring hydroxylation on interactions of flavonols with bovine serum albumin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(7): 2350-2356. DOI:10.1021/jf7037295.

[18] TANG L, ZHANG D, XU S, et al. Different spectroscopic and molecular modeling studies on the interaction between cyanidin-3-O-glucoside and bovine serum albumin[J]. Luminescence, 2014, 29(2): 168-175. DOI:10.1002/bio.2524.

[19] PINTO M D C, DUQUE A L, MACíAS P. Fluorescence quenching study on the interaction between quercetin and lipoxygenase[J]. Journal of Fluorescence, 2011, 21(3): 1311-1318. DOI:10.1007/ s10895-010-0816-9.

[20] CHEN C, MA M, ZHANG J, et al. Spectroscopic investigation of the interaction of bovine serum albumin with a novel cardiac agent V-09[J]. Journal of Spectroscopy, 2008, 22(1): 43-50. DOI:10.3233/SPE-2008-0341.

[21] QIN K, LIU C. Investigation of the interaction between baicalin and human serum albumin by a spectroscopic method and molecular modeling[J]. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 2014, 6(7): 24-30.

[22] SHAHABADI N, MAGHSUDI M, ROUHANI S. Study on the interaction of food colourant quinoline yellow with bovine serum albumin by spectroscopic techniques[J]. Food Chemistry, 2012, 135(3): 1836-1841. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.06.095.

[23] ROSS P D, SUBRAMANIAN S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry, 1981, 20(11): 3096-3102. DOI:10.1021/bi00514a017.

[24] BOLEL P, MAHAPATRA N, HALDER M. Optical spectroscopic exploration of binding of cochineal red A with two homologous serum albumins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(14): 3727-3734. DOI:10.1021/jf205219w.

[25] FANG R, JING H, CHAI Z, et al. Study of the physicochemical properties of the BSA: flavonoid nanoparticle[J]. European Food Research and Technology, 2011, 233(2): 275-283. DOI:10.1007/ s00217-011-1522-9.

[26] 姚惠芳, 景浩. 篤斯越橘花青素與牛血清白蛋白的相互作用[J]. 食品科學, 2013, 34(23): 6-10. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201323002. [27] 周瑞, 董學艷, 景浩. 不同溶液中牛血清白蛋白與花青素相互作用特征及抗氧化性[J]. 食品科學, 2013, 34(15): 11-16. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201315003.

[28] 姚惠芳. 牛血清白蛋白與花青素相互作用機理及其自組裝形成納米顆粒的特性研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2013: 29.

[29] WU L, ZHANG J, WATANABE W. Physical and chemical stability of drug nanoparticles[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2011, 63(6): 456-469. DOI:10.1016/j.addr.2011.02.001.

[30] TSUDA T. Dietary anthocyanin-rich plants: biochemical basis and recent progress in health benefits studies[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2012, 56(1): 159-170. DOI:10.1002/mnfr.201100526.

[31] MUSIALIK M, KUZMICZ R, PAWLOWSKI T S, et al. Acidity of hydroxyl?groups:?an?overlooked?in fl uence?on?antiradical?properties?of?fl avonoids[J].?Journal?of?Organic?Chemistry,?2009,?74(7):?2699-2709.?DOI:10.1021/jo802716v.

Interaction Modes and Nanoparticle Characteristics of Bovine Serum Albumin with Quercetin and Anthocyanin

LIU Jianlei, XING Xiaojuan, ZHOU Rui, JING Hao*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China）

The interaction modes and nanoparticle characteristics of bovine serum albumin (BSA) with quercetin (QUE) and?anthocyanin?(ACN)?were?comparatively?investigated.?The?f l uorescence?of?BSA?was?greatly?quenched?by?QUE?in?both?static?(at?low?concentration)?and?dynamic?(at?high?concentration)?modes,?while?f l uorescence?quenching?of?BSA?by?ACN?was?just in a static mode. The binding constant of BSA with QUE was higher than that with ACN. BSA interacted with QUE and ACN by hydrophobic force and electrostatic force, respectively, to form BSA-QUE and BSA-ACN nanoparticles. The average?diameters?of?BSA-QUE?and?BSA-ACN?were?42.5?nm?and?53.7?nm,?respectively.?The?ζ-potentials of BSA-QUE and?BSA-ACN?were??25.64?and??21.50?mV,?respectively.?One?mole?of?BSA?could?combine?8?moles?of?QUE?or?10?moles?of?ACN. BSA-QUE nanoparticles were smaller and more stable than BSA-ACN nanoparticles. The DPPH and ABTS radical scavenging rates of BSA-QUE were higher than those of BSA-ACN.

bovine serum albumin (BSA); quercetin (QUE); anthocyanin (ACN); interaction; nanoparticle

10.7506/spkx1002-6630-201705002

TS201.4

A

1002-6630（2017）05-0007-07

劉建壘, 邢效娟, 周瑞, 等. 牛血清白蛋白與槲皮素及花青素相互作用方式及其納米顆粒特征的比較[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 7-13. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705002. http://www.spkx.net.cn

LIU Jianlei, XING Xiaojuan, ZHOU Rui, et al. Interaction modes and nanoparticle characteristics of bovine serum albumin with quercetin and anthocyanin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 7-13. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705002. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國家自然科學基金面上項目（31171676）

劉建壘（1987—），男，博士研究生，研究方向為蛋白與小分子相互作用。E-mail：liujianlei@cau.edu.cn

*通信作者：景浩（1957—），男，教授，博士，研究方向為蛋白與小分子相互作用。E-mail：haojing@cau.edu.cn