鯽魚貯藏過程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮

李秀秀，曾維偉，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

鯽魚貯藏過程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮

李秀秀，曾維偉，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-amplif i cation and denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）技術，分析4 ℃冷藏條件下鯽魚肌肉和魚鰓的菌相組成及變化，并利用不同濃度（效價分別為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL）抗菌脂肽溶液對鯽魚進行浸泡處理，以未處理作為對照，分別測定其菌落總數、揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、pH值和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）等指標，評價抗菌脂肽對鯽魚冷藏保鮮效果。結果表明：鯽魚貯藏過程中的微生物具有多樣性，PCRDGGE技術確定氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）和熱殺索絲菌屬（Brochothrix thermosphacta）為鯽魚魚肉的主要腐敗菌群，熒光假單胞菌是鯽魚貯藏過程中的優勢腐敗菌。而棉子糖乳球菌屬（Lactococcus raffinolactis）、從毛單胞菌屬（Comamonas sp.）和氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）為鯽魚魚鰓的主要腐敗菌群，表明魚肉和魚鰓在貯藏過程中，導致腐敗的主要腐敗菌群有一定差異性。同時，不同濃度的抗菌脂肽對鯽魚均有明顯的防腐保鮮作用，有效抑制了鯽魚菌落總數、TVB-N值和TBA值的增加以及pH值的升高。其中，高濃度抗菌脂肽（效價為67 608 IU/mL）在4 ℃貯藏條件下使鯽魚的貨架期延長了6 d，說明抗菌脂肽對鯽魚具有良好的保鮮作用，能明顯延緩鯽魚的腐敗變質。

鯽魚；腐敗微生物；聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術；抗菌脂肽；保鮮

鯽魚是我國傳統的淡水魚類，其產量居于各淡水魚前列。因鯽魚中營養豐富，含有鈣、鐵、維生素、核黃素等許多營養成分，而深受大眾消費者的喜愛[1]，但魚肉中蛋白質和水分含量高，且含有多種不飽和脂肪酸及內源酶，使得鯽魚容易腐敗[2]。水產品的腐敗主要受來自自身和環境中的微生物，以及本身的酶和脂肪氧化等因素的影響，其中微生物是造成腐敗的主要因素。因此，研究魚類腐敗菌的生長，探究細菌群落動態變化并采取相應的能夠有效抑制微生物生長的保鮮方法，對水產品捕撈、加工、貯藏、運輸、銷售過程中提高水產品品質和延長貨架期至關重要[3]。聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-amplif i cation and denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE）是研究微生物群落組成及親緣關系的分子指紋技術，可以高效、直接、快速全面地分析微生物組成及群落結構[4-5]。國內外已有很多研究將該方法有效地用來分析食品中腐敗菌[6-11]。目前DGGE技術在水產品腐敗菌群結構分析中的應用研究較多，但在鯽魚貯藏過程中的腐敗菌分析國內鮮見報道。有關鯽魚貯藏過程中菌群結構的變化情況，各類微生物的生長、腐敗特點，如何利用保鮮技術高效、針對性抑制鯽魚中的微生物生長、延長貨架期等，需有待進一步研究。

目前，水產品保鮮技術主要有冷凍保鮮、氣調保鮮、化學保鮮及輻照保鮮等，但以上技術存在蛋白質變性、營養成分流失和化學藥品殘留等問題[12]，因而安全、無毒的生物保鮮技術受到了人們廣泛關注。抗菌脂肽（lipopeptide）是指一類由芽孢桿菌（Bacillus sp.）通過非核糖體肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs）合成的具有高效抑菌活性的脂肽類次級代謝產物，其結構中包含一個含有7～10 個氨基酸和1 個短鏈脂肪酸（C9～C13）組成的環型脂肽，具有抗菌性強、抗菌譜廣、安全無毒、穩定性好等特性，因而抗菌脂肽作為一種新型、高效、廣譜的生物源天然食品防腐劑，在食品加工中具有潛在的應用前景[13-14]。目前抗菌脂肽已在食品保鮮中廣泛應用，如肉制品[15]、焙烤制品[16]、果蔬采后保鮮[17]等。但在淡水魚產品保鮮方面的應用研究鮮見報道。本實驗利用PCR-DGGE技術，研究鯽魚腐敗過程中的菌相變化，確定其在貯藏過程中的主要優勢腐敗菌，探討抗菌脂肽對鯽魚防腐保鮮作用，旨在為抗菌脂肽在水產保鮮中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鯽魚（300～400 g）購于南京市玄武區鐵匠營蘇果超市，產地為江蘇省興化市。

菌種Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4，為本實驗室保藏。營養肉湯固體培養基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂18 g、水1 000 mL，pH 7.0；平板菌落計數培養基 北京陸橋生物技術有限公司。

MgO、硼酸、鹽酸（均為分析純）、甲基紅、亞甲基藍 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

5084R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；高壓蒸汽滅菌鍋 北京發恩科貿有限公司；PCR擴增儀美國艾爾特公司；隔水式電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械廠；Dcode DGGE電泳系統（配有凝膠成像系統）美國伯樂公司；拍擊式均質機 法國Interscience公司；3-Star型pH計 美國Orion公司。

1.3 方法

1.3.1 菌落總數的測定

將從超市買的鮮活鯽魚在最短的時間內運送到實驗室，迅速敲頭致死，在無菌條件下用無菌剪刀分別取25 g魚肉樣品（含魚鱗，魚皮）置于無菌均質袋中，并加入225 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水中；取10 g魚鰓置于無菌均質袋中加入90 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水中，放入均質機中均質2 min。具體操作參照GB 4789.2—2010《食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定》。

1.3.2 揮發性鹽基氮和pH值的測定

揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值按照GB/T 5009.44—2003《肉與肉質品衛生標準的分析方法》中半微量定氮法進行測定。

取10 g樣品加入100 mL的煮沸冷卻后的蒸餾水浸提30 min，過濾后濾液使用經校正劑校正后的3-Star型pH計進行測定。

1.3.3 提取DNA的樣品處理

在無菌超凈工作臺中用無菌剪刀分別剪取魚肉25 g置于裝有50 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水的無菌均質袋中，魚鰓10 g置于裝有25 mL含0.1%蛋白胨的0.85%的生理鹽水的無菌均質袋中，均質2 min。200 目絹布過濾后，加入25 mL生理鹽水，濾液1 000 r/min離心10 min，去沉淀，濾液10 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀加入5 mL無菌雙蒸水，10 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀懸浮于1 mL TE buffer 中置于－20 ℃條件下備用。

1.3.4 總DNA的提取

按照Omega公司細菌基因組DNA提取試劑盒的方法操作，提取細菌總DNA，并用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1.3.5 PCR擴增

參考陳慧斌等[18]的方法采用巢式PCR擴增鯽魚魚肉和鯽魚魚鰓中細菌菌群的16SrDNA V3區。第1輪擴增16 S rDNA，引物為27F和1492R；第2輪擴增V3區，正向引物為5’端帶40GC夾子的338F（5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG CAC-3’），反向引物為518R（5’-ATT ACC GCA GCT GCT GG-3’）。本實驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。第2輪對細菌的16S rDNA的V3區片段進行PCR擴增。第2輪V3區擴增以第1輪16S rDNA擴增產物稀釋100 倍后的產物為模版。兩輪均用無菌ddH2O代替模版作為陰性對照進行擴增。擴增體系為：0.25 μL的Taq DNA聚合酶，10×buffer （Mg2＋Plus） 5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，引物各1 μL，模板4 μL，補ddH2O為34.75 μL。擴增條件擴增條件為94 ℃、5 min；94 ℃、1 min，55 ℃、1 min，72 ℃、2 min，循環30 次；72 ℃ 8 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.3.6 細菌DGGE分析

鯽魚魚肉和魚鰓中菌群的DGGE分析參照Chen Huibin等[19]的方法并加以改進。具體方法如下：采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為38%～55%（100%的變性劑：尿素42 g＋甲酰胺 40 mL/100 mL）。實驗在Biorad Dcode DGGE電泳儀上進行，上樣量為15 μL，在電泳系統電壓65 V，溫度60 ℃條件下電泳時間13.5 h。電泳結束后將膠片在SYBR GreenⅠ中染色30 min后取出，在然后在凝膠成像系統上拍照，采用Quantity One軟件分析圖像。

1.3.7 條帶回收及測序

在紫外燈下對各泳道的主要片段進行切割，回收24 條條帶，放入1.5 mL離心管中，加入40 μL無菌ddH2O，搗碎，置于4 ℃條件下過夜溶解。取上述回收DNA溶液2 μL作為模版，以338F（無GC夾子）和518R作為引物，進行PCR擴增。取5 μL PCR產物，瓊脂糖電泳檢查產量及特異性。剩余PCR產物，采用PCR清潔試劑盒進行純化。經純化后的PCR產物連接到PMD19-T載體，轉化DH5α感受態細胞，將陽性克隆株由上海生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序后獲得的24 個主要細菌16S rDNA基因片段序列，登錄NCBI（www. ncbi.nlm.nih.gov/blast/）查詢測序結果。

1.3.8 抗菌脂肽在鯽魚中保鮮應用

1.3.8.1 抗菌脂肽的制備

Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4產抗菌脂肽粗提物為芬薺素（fengycins）、表面活性素（surfactins）和伊枯草菌素（iturins）的混合物[13]。抗菌脂肽制備方法參考文獻[20]并作修改：將本實驗室保藏的Bacillus amyloliquefaciens ES-2-4接種于試管斜面PAD瓊脂培養基上，37 ℃培養箱中培養24 h活化菌種，再將活化后的菌種接種于裝有種子培養基BPY培養基的三角瓶中，37 ℃、180 r/min條件下培養24 h制成種子液。種子液以4%濃度接種于Landy發酵培養基中，在33 ℃、180 r/min條件下發酵36 h后取出，9 000 r/min離心15 min除去菌體，用HCl將上清液調節pH值至2，然后輕微攪動或靜止于4 ℃條件下12 h，最后9 000 r/min離心10 min收集沉淀，加入60%的乙醇抽提（約每50 mL的發酵液，加入1 mL的60%的乙醇），再用NaOH中和，10 000 r/min離心10 min取上清液，獲得抗菌粗提物的濃縮儲備液。并以Nisin做標準物，用效價的方法定量其抑菌特性。

1.3.8.2 抗菌脂肽對鯽魚中腐敗菌的最小抑菌濃度抑菌實驗

無菌條件下將抗菌脂肽倍比稀釋液按稀釋度從高到低加入無菌96 孔板的第1～11列，每孔加100 μL，第12孔為陽性對照加入等量的無菌水。隨后每孔加入100 μL濃度為105～106CFU/mL的熒光假單胞菌、氣單胞菌、熱殺索絲菌和不動桿菌菌液，密封混勻。用酶標儀測試0 h的OD630nm值，然后將96 孔板置于37 ℃培養箱中培養24 h后測試24 h的OD630nm值。對比0 h的OD630nm值和24 h的OD630nm值，從而得出該抗菌脂肽的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.3.8.3 不同濃度抗菌脂肽對鯽魚的保鮮效果

將一定量的抗菌脂肽ES-2-4溶解在無菌水溶液中，稀釋制得效價為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL的抗菌脂肽保鮮液。將新鮮鯽魚敲頭致死，去鱗，去頭，去內臟，用無菌水沖洗干凈后晾干，分為處理組和對照組6 個組。分別在相應效價為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL的抗菌脂肽保鮮液浸泡30 min，取出瀝干水分，放入到無菌自封袋中置于冰箱中貯藏，控制貯藏溫度（4±1） ℃，每隔2 d取樣進行菌落總數、TVB-N值、pH值和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）指標的測定，TBA測定參考文獻[12]方法，結果以丙二醛（malondialdehyde，MDA）計，單位表示為：mg MDA/kg。

2 結果與分析

2.1 鯽魚貯藏期間的菌落總數及各指標的變化

表 1 鯽魚在4 ℃貯藏條件下微生物指標及理化指標的變化Table 1 Changes in microbial and physicochemical properties of crucian carp during storage at 4 ℃

由表1可以看出，鯽魚貯藏期間魚鰓中初始菌相菌落總數為（5.85±0.11）（lg（CFU/g）），遠遠大于魚肉中的菌落總數（3.81±0.06）（lg（CFU/g））。魚肉在第6天菌落總數為（6.38±0.15）（lg（CFU/g）），已經超過國家標準中規定的菌落總數6（lg（CFU/g）），而魚鰓中的菌落總數在第2天就已經達到（6.86±0.07）（lg（CFU/g））；鯽魚的初始pH值為6.23±0.03，由于糖酵解的作用產生乳酸有一個下降的過程，之后由于蛋白質的分解pH值又有一個上升的過程，腐敗終點pH值達到6.40±0.12，而腐敗后期達到7.27±0.09；TVB-N是多肽和氨基酸在微生物作用下的分解產物，通常可以作為魚類初期腐敗的指標。鯽魚的TVB-N的初始值為（9.42±0.69） mg N/100 g，隨著貯藏時間的延長，TVB-N值不斷增加，當腐敗終點時TVB-N值達到（18.87±1.30） mg N/100 g，腐敗后期達到（21.37±0.11） mg N/100 g。

2.2 鯽魚貯藏過程中優勢菌的分析

圖 1 鯽魚在4 ℃條件下貯藏細菌的DGGE圖譜Fig. 1 DGGE fi ngerprinting of PCR products of DNA extracted from crucian carp stored at 4 ℃

DGGE分析結果如圖1所示。DGGE圖譜上不同條帶代表不同的微生物種類，條帶亮度大小代表微生物數量的多少，越亮則代表微生物數量越多[21]。由圖1可以看出，魚肉和魚鰓在貯藏過程中條帶存在一定的差異。將不同條帶割膠回收收后的測序結果見表2。

表 2 DGGE目標條帶基因片段序列的比對分析Table 2 Sequence analysis of selected bands in DGGE

由圖1可知，鯽魚魚肉初始菌相條帶較多且沒有較亮的條帶，說明微生物具有較高的多樣性。貯藏2 d時，微生物菌群發生變化，條帶3、4、5變亮，分別屬于棉子糖乳球菌屬（Lactococcus raffinolactis）、從毛單胞菌屬（Comamonas sp.）和漫球菌屬（Vagococcus sp.）。隨著時間的延長，貯藏6 d即腐敗終點時條帶3、4、5消失，可能是其他菌的代謝產物及環境的不適應抑制了這些菌的生長。但腐敗后期第8天條帶3、4、5又出現較暗的條帶，可能是腐敗終點未被完全抑制住，腐敗后期又重新獲得生長，使菌群比例發生改變的結果。條帶6、11、13、15、18、22均是在貯藏中期和腐敗終點時出現，分別屬于熱殺索絲菌屬（Brochothrix thermosphacta）、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、希瓦氏菌屬（Shewanella sp.），且條帶18、6、10、11條帶明顯的亮于其他條帶，尤其條帶18為最亮條帶，表明它的主導優勢地位，這與Gram等[22]關于特定腐敗菌（specific spoilage organism，SSO）理論相符：特定腐敗菌在產品貯藏初期數量很少，僅占微生物群落的很少部分，但在產品腐敗過程中逐漸占據主導地位。而條帶10氣單胞菌屬（Aeromonas sp.）從貯藏初期至腐敗后期都存在，說明它也是鯽魚腐敗時的主要腐敗菌之一。因此，確定假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、氣單胞菌屬和不動桿菌屬為4 ℃貯藏鯽魚魚肉的主要腐敗菌群，熒光假單胞菌是鯽魚貯藏過程中的優勢腐敗菌。

魚鰓DGGE圖譜與魚肉DGGE圖譜并不完全相同。魚鰓貯藏初始時就有5、12、16條亮的條帶，分別屬于漫球菌屬 （Vagococcus sp.）、腸桿菌屬（Enterobacter sp.）和嗜冷桿菌屬（Psychrobacter pulmonis）。貯藏2 d條帶6、10、11、14、18變成亮帶，條帶5、12、16均消失，說明微生物菌群發生變化，漫游球菌屬和大腸桿菌屬和嗜冷桿菌屬細菌生長逐漸受到抑制。隨著時間的延長，貯藏中期、腐敗終點和腐敗后期時即貯藏4、6 d和8 d時，條帶3、4、8、10、24處于較亮的狀態，分別代表棉子糖乳球菌屬（Lactococcus raffinolactis）、從毛單胞菌屬（Comamonas sp.）、氣單胞菌屬、假單胞菌屬，其中3、4、10為最亮條帶，確定棉子糖乳球菌、從毛單胞菌屬、氣單胞菌屬為4℃貯藏魚鰓的優勢腐敗菌。腐敗后期條帶14、18又出現，可能是腐敗后期那些沒完全被抑制住的菌種又重新獲得生長空間，使菌群的比例發生了改變而導致，說明假單胞菌屬亦是魚鰓腐敗菌的一部分，但在數量上不占主導。

表 3 鯽魚魚肉和魚鰓4 ℃貯藏過程中細菌多樣性的相似性Table 3 Similarity of bacterial diversity between fl esh and grill of crucian carp

根據DGGE圖譜中每個樣品不同條帶的強度及遷移率，對每個樣品的條帶圖譜進行細菌群落多樣性分析。由表3可知，鯽魚魚肉和魚鰓在不同貯藏時期相似性不大。鯽魚魚肉在貯藏中期即第4天和腐敗終點即第6天相似性最高，為61.1%；而鯽魚魚鰓在腐敗終點第6天與腐敗后期第8天相似性最高77.7%。鯽魚魚肉和魚鰓在初始和腐敗終點時的相似性均不高分別為13.1%和21.2%，這可能是因為魚鰓與外界環境接觸比較多，反映的主要是水環境中的微生物群落。

2.3 抗菌脂肽對鯽魚腐敗菌的抑菌效果

結合DGGE技術的實驗結果有選擇性地分離出鯽魚的優勢腐敗菌熒光假單胞菌、熱殺索絲菌、氣單胞菌和不動桿菌，并用于抗菌脂肽MIC測定，結果如表4所示。

表 4 抗菌脂肽對鯽魚腐敗菌的MICTable 4 MIC of antimicrobial lipopeptide for inhibition of spoilage bacteria in crucian carp

由表4可見，抗菌脂肽對鯽魚中的優勢腐敗菌均有抑制作用，其中對熱殺索絲菌的MIC最小為115 IU/mL，對熒光假單胞菌、不動桿菌和氣單胞菌的MIC均為1 175 IU/mL。

2.4 抗菌脂肽的防腐保鮮效果

表 5 4 ℃貯藏條件下不同處理鯽魚中微生物數量變化Table 5 Changes in microbial counts of crucian carp during storage at 4 ℃

從表5可知，效價為67 608、32 359、2 239、1 820、1 157 IU/mL的抗菌脂肽對鯽魚均有很好的保鮮效果，且隨著效價的增大，其抑菌效果是逐漸增加的。未加抗菌脂肽對照組鯽魚在第2天菌落總數達到6.72 （lg（CFU/g）），已超過國家標準中規定的菌落總數6 （lg（CFU/g）），而添加了抗菌脂肽的處理組在第2天菌落總數均未超過國家標準中規定的菌落總數6 （lg（CFU/g））。在第4天除效價為67 608 IU/mL和32 359 IU/mL的處理組外，其他組均超過國家標準中規定的菌落總數6 （lg（CFU/g））。而效價為67 608 IU/mL的處理組在第8天菌落總數才超過國家標準中規定的菌落總數6 （lg（CFU/g））。

圖 2 4 ℃貯藏條件下不同防腐處理鯽魚TVB-N值的變化Fig. 2 Changes in TVB-N of crucian carp during storage at 4 ℃

由圖2可知，抗菌脂肽對鯽魚T V B-N值的增長有很好的抑制作用。對照組初始值為（10.04±0.71） mg N/100 g，而其他處理組初始值均在7 mg N/100 g左右。隨著時間的延長，對照組的TVB-N的值始終高于處理組。貯藏8 d后，對照組TVB-N值最高達到（26.25±0.82） mg N/100 g，而效價為67 608 IU/mL和32 359 IU/mL的抗菌脂肽處理組的TVB-N值增長的最緩慢，僅為（17.04±0.35）、（18.97±0.52） mg N/100 g。但各處理組TVB-N值在腐敗終點時始終未超過25 mg N/100 g。

圖 3 4 ℃貯藏條件下不同防腐處理鯽魚pH值的變化Fig. 3 Changes in pH of crucian carp during storage at 4 ℃

由圖3可知，無論是對照組還是抗菌脂肽處理組鯽魚pH值均呈現出先下降后上升的趨勢，對照組與處理組初始值幾乎無差異均在6.3左右；4 ℃條件下貯藏2 d后，各組pH值迅速下降，隨著時間的延長pH值開始上升，但最終pH值都未超過7。其中無論是對照組還是處理組均是在第4天迅速上升，之后便緩慢上升。腐敗終點時，對照組和處理組的pH值均在在6.3～6.5左右，但各處理組pH值始終低于對照組pH值。

圖 4 4 ℃貯藏條件下不同防腐處理鯽魚TBA值的變化Fig. 4 Changes in TBA value of crucian carp during storage at 4 ℃

由圖4可知，抗菌脂肽各處理組均能有效地降低鯽魚的TBA值。各組初始TBA值差異不大，均在0.1～0.2 mg MDA/kg左右，但是隨著時間的延長，對照組TBA值增長速度顯著大于各保鮮組。貯藏8 d后，對照組鯽魚TBA值為（1.718±0.034） mg MDA/kg。而效價為1 157 IU/mL抗菌脂肽處理組的TBA值為（1.597±0.044） mg MDA/kg，與對照組相差不大，效價為67 608 IU/mL的抗菌脂肽處理組TBA值為（0.839±0.016） mg MDA/kg，顯著低于對照組（P＜0.05）。

3 討 論

應用PCR-DGGE分析水產品在貯藏過程中微生物的組成及變化有許多報道。王建輝等[23]通過PCR-DGGE技術研究冷藏過程中草魚肌肉的細菌群落結構分析中，發現假單胞菌屬和熱殺索絲菌屬是其冷藏過程中的優勢菌屬。許振偉等[24]也發現有氧冷藏鯉魚腐敗終點的腐敗菌為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬，藍蔚青等[25]也采用PCRDGGE技術發現假單胞菌屬和希瓦氏菌屬為冷藏帶魚貯藏后期的優勢腐敗菌。由此可見，大多數水產品中，假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬和希瓦氏菌屬等腐敗菌占絕對優勢。

本研究運用PCR-DGGE技術分析冷藏鯽魚貯藏期間的菌相組成及變化，微生物菌群結構隨鯽魚貯藏時間而變化，貯藏2 d 鯽魚各部位的細菌種類呈現多樣性；貯藏4、6 d后魚體各部位的細菌的種類明顯減少，而優勢菌群明顯。通過DGGE圖譜中對主要條帶的測序和GenBank數據庫比對結果，確定假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬為鯽魚魚肉的主要腐敗菌群，熒光假單胞菌是鯽魚貯藏過程中的優勢腐敗菌。而棉子糖乳球菌屬、從毛單胞菌屬、氣單胞菌屬為鯽魚魚鰓的主要腐敗菌群，表明魚肉和魚鰓在貯藏過程中，導致腐敗的主要腐敗菌群有一定差異性。高祥英[26]采用傳統方法分離鯽魚中的腐敗菌發現腐敗終點的優勢腐敗菌為希瓦氏菌屬和假單胞菌屬，本研究在后期也檢測到了希瓦氏菌屬，但是條帶相對于假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、不動桿菌屬、氣單胞屬的條帶較暗。這可能是因為不同地區的淡水魚細菌含量及種類存在差異，其菌相受到影響所致。研究結果說明PCR-DGGE技術能有效地應用于冷藏鯽魚中微生物的研究，直觀地反映冷藏鯽魚貯藏期間主要微生物群落及其菌相的動態變化過程。

同時，采用傳統培養技術與16S rDNA基因鑒定技術相結合的方法，對冷藏鯽魚在貯藏不同階段的微生物進行分離、純化和鑒定，確定冷藏鯽魚的主要腐敗菌群為假單胞菌屬、熱殺索絲菌屬、不動桿菌屬、氣單胞菌屬。因此，可以通過靶向抑制這些特定腐敗菌的生長來控制鯽魚腐敗變質。首先，通過抗菌脂肽對鯽魚防腐保鮮效果研究中，發現抗菌脂肽對鯽魚中的腐敗菌熒光假單胞菌、熱殺索絲菌、不動桿菌、氣單胞菌的最小抑菌濃度分別為1 175、115、1 175、1 175 IU/mL。其次，不同濃度的抗菌脂肽對鯽魚均有明顯的防腐保鮮作用，有效抑制了鯽魚菌落總數、TVB-N值的增長、pH值的升高以及TBA值的增長。其中，效價為67 608 IU/mL的抗菌脂肽在4 ℃貯藏條件下，使鯽魚的貨架期延長了6 d，說明抗菌脂肽對鯽魚具有良好的保鮮作用，明顯延緩鯽魚的腐敗變質。而目前乳酸鏈球菌素Nisin作為一種高效、無毒、安全和營養的生物保鮮劑，已被許多國家和地區廣泛應用于水產品保鮮中[27-28]。Nisin能夠有效抑制革蘭氏陽性菌，但對革蘭氏陰性菌的抑制效果并不好，且在中性和堿性條件下對熱不穩定。從已有的報道來看，Nisin主要用來抑制水產品中單增李斯特菌的生長，一般與其他保鮮劑復合使用來增強抑菌作用[29-30]。與化學防腐劑和生物防腐劑Nisin相比，特別是一些發達國家在某些食品中禁止使用苯甲酸鈉等化學防腐劑的現狀而言，抗菌脂肽能有效抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，抗菌譜廣、抗菌性強，特別是其本身為氨基酸組成的肽鏈，安全性高，王東[31]發現納豆抗菌脂肽對凡納濱對蝦具有良好的保鮮作用，不僅可以明顯抑制細菌的增長還能降低TVB-N值和pH值的增加，與本研究結果類似。因而抗菌脂肽作為新型綠色生物防腐劑在水產品保鮮中具有潛在的應用前景。

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PCR-DGGE Analysis of Microbial Community Composition and Preservation of Crucian Carp during Storage

LI Xiuxiu, ZENG Weiwei, LU Zhaoxin, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, ZHANG Chong, Lü Fengxia*
(College of Food and Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The microbial community structure of crucian carp was studied by polymerase chain reaction-amplification and denaturing gradient gel electrophorsis (PCR-DGGE) during storage at 4 ℃. Meanwhile, in order to use it for the preservation of crucian carp, the antimicrobial effect of antimicrobial lipopeptide was evaluated through the determination of total bacterial counts, total volatile basic nitrogen (TVB-N), pH and thiobarbituric acid (TBA). The results showed that the microbial community of crucian carp was diverse during storage. Specif i cally, Aeromonas sp., Pseudomonas sp., Acinetobacter sp. and Brochothrix thermosphacta were the main spoilage microorganisms, and Pseudomonas fluorescens was the dominant spoilage microorganism in the flesh of the fish, while Lactococcus raffinolactis, Comamonas sp. and Aeromonas sp. were the main spoilage microorganisms in the gill. These results also indicated that although the microbial community compositions in the flesh and gill of crucian carp were different, but they showed a similar trend during storage. On the other hand, the antimicrobial lipopeptide at different concentrations signif i cantly inhibited the increase of total bacterial counts, TVB-N, pH and TBA. The lipopeptide at a concentration of 67 608 IU/mL extended the shelf-life of crucian carp by up to 6 days during storage at 4 ℃. All these fi ndings demonstrated that the antimicrobial lipopeptide can signif i cantly inhibit the growth of spoilage microorganisms in crucian carp, thus being a promising preservative.

crucian carp; spoilage bacteria; polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE); antimicrobial lipopeptide; preservation

10.7506/spkx1002-6630-201705045

TS254.4

A

1002-6630（2017）05-0274-07

李秀秀, 曾維偉, 陸兆新, 等. 鯽魚貯藏過程中微生物菌相PCR-DGGE分析及其防腐保鮮[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 274-280. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705045. http://www.spkx.net.cn

LI Xiuxiu, ZENG Weiwei, LU Zhaoxin, et al. PCR-DGGE analysis of microbial community composition and preservation of crucian carp during storage[J]. Food Science, 2017, 38(5): 274-280. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705045. http://www.spkx.net.cn

2016-08-12

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B04）

李秀秀（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：2014108044@njau.edu.cn

*通信作者：呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn