黃曲霉毒素G1與人血清白蛋白的結合機理及分子對接

鐘 紅，王佳曼，馬 良，江 濤

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

黃曲霉毒素G1與人血清白蛋白的結合機理及分子對接

鐘 紅，王佳曼，馬 良*，江 濤

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

在模擬人體血液pH 7.4的條件下，用分子對接及其熒光光譜、3D熒光、圓二色譜等方法研究黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1） 與人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的相互作用。結果發現，根據雙對數方程得出AFG1與HSA結合反應猝滅機制為靜態猝滅，4 個溫度條件下結合常數數量級均為104，結合位點數近似為1。通過分子對接和熱力學參數計算，AFG1結合在HSA的ⅠB疏水腔中，二者結合力主要為疏水作用和氫鍵。通過研究體內金屬離子對AFG1-HSA反應的影響，Fe3＋、Mg2＋能增大AFG1對HSA的親和力，而Zn2＋、Cu2＋、Mn2＋離子則能大大降低AFG1與HSA的親和力。基于F?rster’s能量轉移，二者反應距離為3.26 nm。3D熒光結果顯示，二者的結合反應使HSA生色團氨基酸殘基疏水性增加，二級結構發生改變；圓二色譜結果表明，加入AFG1使得HSA的α-螺旋含量增加。

黃曲霉毒素G1；人血清白蛋白；光譜；分子對接；結合反應

鐘紅, 王佳曼, 馬良, 等. 黃曲霉毒素G1與人血清白蛋白的結合機理及分子對接[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 86-91.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705014. http://www.spkx.net.cn

ZHONG Hong, WANG Jiaman, MA Liang, et al. Binding mechanism and molecular docking between aflatoxin G1and human serum albumin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 86-91. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705014. http://www.spkx.net.cn

黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）是由黃曲霉（Aspergilus f l avus）和寄生曲霉（Aspergilus parasiticus）產生的主要次級代謝產物之一，主要污染花生、大豆等大宗糧油作物[1-4]。糧油產品產生的黃曲霉毒素中AFG1毒性僅次于AFB1[5]。有研究表明，它比AFB1具有更強的誘發腎臟瘤的潛力，且與肺癌的發生有一定的關聯[6-8]。目前黃曲霉毒素經肝臟代謝引起癌癥的機理已有很多研究，而在與血清蛋白結合轉運到肝臟的毒代動力學鮮少研究[9-11]。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）主要由肝臟產生，它是重要的轉運蛋白，能很好地結合很多外源性和內源性物質，并通過對有毒代謝產物的螯合，對機體產生一定的保護作用，同時也會加強該物質的慢性毒作用[12]。黃曲霉毒素經食物進入消化道，50%被排除體外，50%被吸收進入血液和淋巴循環，通過與血清白蛋白形成AFs-HSA復合物轉運到人體肝臟，并長期蓄積，通過肝臟代謝活化成強致癌物[13]。

黃曲霉毒素與HSA的反應在其毒代動力學中起著重要的作用。因此研究AFG1與HSA的相互作用對于更深入地了解AFG1的毒理學機制和發展潛在有效解毒劑和預防措施起著重要作用。本實驗采用計算模擬和實驗分析相結合的方法研究AFG1與HSA的結合模式特性，二者相互佐證、相互補充，為AFG1與HSA反應的毒動力學提供多角度的分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFG1標準儲備液（固體粉末標品用甲醇配制成濃度為4.0×10－3mol/L）、HSA（分子質量66 000 u，溶于Tris-HCl緩沖液中配制濃度為1.0×10－3mol/L）、Tris美國Sigma-Aldric公司；濃鹽酸、甲醇、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鐵、氯化鋅、氯化銅、氯化錳 成都市科龍化工試劑廠。

金屬離子儲存液由Tris-HCl緩沖液配制，pH 7.40、0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液含0.10 mol/L NaCl。

1.2 儀器與設備

PHS-25酸度計 杭州雷磁分析儀器廠；UV-2450紫外分光光度計 日本Shimadzu公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司；MOS-450圓二色譜儀 法國Bio-Logic公司；超純水系統 美國Milli-Pore公司。

1.3 方法

1.3.1 內濾光的效應的校正

由于AFG1在HSA的激發波長280 nm處有較強吸收，隨著AFG1濃度增加，其猝滅行為中存在內濾光效應，需要進行相應的校正。校正方法如下：在1 cm比色皿中加入2.0 mL緩沖液，用微量進樣器每次加入一定體積濃度為4.0×10－3mol/L的AFG1溶液，使AFG1濃度分別2.0×10－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6、12.0×10－6、14.0×10－6、16.0×10－6、 18.0×10－6、20.0×10－6mol/L，混勻后，掃描紫外波段為190～400 nm。結果中所用的熒光數據均為校正后的值。按公式（1）對實驗中獲得的熒光值進行校正[14]：

式中：Fcor為校正后的熒光值；Fobs為校正前的熒光值；Aex為HSA激發波長下相應濃度的AFG1吸收度；Aem為發射波長下相應濃度的AFG1吸收度。

1.3.2 不同溫度熒光猝滅和3D熒光的測定

1 cm石英比色皿中加入1.0 mL 2.0×10－6mol/L的HSA溶液，用微量進樣器每次加入一定量濃度為4.0×10－3mol/L的A F G1溶液，使A F G1濃度分別2.0×1 0－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6、12.0×10－6、14.0×10－6、16.0×10－6、18.0×10－6、20.0×10－6mol/L，混勻后，在不同的溫度條件（298、303、308、313 K）條件下，固定激發波長λex=280 nm，狹縫寬度為5 nm，發射波長在220～500 nm范圍內分別掃描HSA的熒光光譜及HSA與AFG1作用后的熒光光譜。

將激發波長掃描范圍設置為200～450 nm，發射波長設置為220～600 nm，激發波長每遞增5 nm掃描一次譜圖，用F-4500熒光分光光度計測定，可分別得到HSA及HSA與AFG1作用后的三維熒光光譜。

1.3.3 圓二色譜測定

配制1.0×10－6mol/L的HSA和HSA-AFG1復合物混合液（HSA濃度為1.0×10－6mol/L；AFG1濃度為1.0×10－5mol/L），單位掃描間隔設置為1 nm，單位掃描時間為2 s，掃描波段為190～250 nm。

1.3.4 AFG1與HSA的分子對接

先以Chemdraw畫出AFG1配體的結構簡圖，（HSA結構從Protein Data Bank（PDB）數據庫獲取，利用Autodockb 4.0進行分子對接，設置遺傳算法計算次數（number of GA runs）設置為10，種群數（population size）設置為150，最大迭代次數（maximum number of evals）設置為25 000 000，其他參數采用默認值。其次是搜索方法采用拉馬克遺傳算法，最后保存對接參數為dpf文。最后進行分子對接，輸出dlg文件。

1.3.5 金屬離子對AFG1與HSA結合的影響

在1 cm比色皿中加入1.0 mL濃度為2.0×10－6mol/L的HSA溶液，用微量進樣器加入配制好的金屬離子儲存液1 μL，混勻后掃描熒光光譜，再用進樣器每次加入一定量的AFG1標液，使AFG1濃度分別為2.0×10－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6、12.0×10－6、1 4.0×1 0－6、1 6.0×1 0－6、1 8.0×1 0－6、20.0×10－6mol/L，混勻后，在25 ℃條件下，固定激發波長λex=280 nm，狹縫寬度為5 nm，發射波長在220～500 nm范圍內掃描熒光光譜。

2 結果與分析

2.1 AFG1與HSA的結合常數、結合位點數研究

AFG1與HSA結合時，HSA熒光強度和AFG1濃度與結合常數和結合位點數的關系滿足方程式[15]：

式中：F0和F分別為加入毒素前后的HSA熒光強度；Q0和P0分別為AFG1和HSA的濃度/（mol/L）；K和n分別為結合常數和結合位點數。利用公式，通過（lg（F0－F）/F）對lg{[Q0]－（F0－F）/F0×[P0]}進行線性擬合得到直線的斜率和截距，計算得到AFG1與HSA在不同溫度條件下的n和K，線性擬合效果如圖1所示：

圖 1 不同溫度條件下的AFG1-HSA的雙對數曲線Fig. 1 Double logarithmic curves of AFG1-HSA binding at different temperatures

通過線性擬合，AFG1-HSA在4 個溫度條件下得到的結合位點數n值分別為0.951 8、1.038 8、1.149 5、1.311 4，都約為1，表明一分子的HSA與一分子AFG1結合，且結合過程中只有一個結合位點。通過計算，4 個溫度條件下的結合常數K值分別為3.08×104、2.80×104、2.43×104、2.28×104L/mol，K值隨著溫度的升高而變小，說明反應過程中形成了不穩定的復合物，溫度升高，復合物發生分解，進一步說明猝滅機制是靜態猝滅[16]。此外，AFG1-HSA在4 個溫度條件下K值的數量級都為104，同時溫度對結合常數的影響不大，說明AFG1與HSA存在較強的親和力[17]。毒素分子與HSA的高親和力結合，不僅會延長毒素在血液中的半衰期，更有利于毒素對器官的定位和形成高劑量的毒素。

2.2 分子對接分析AFG1和HSA結合特性

為了研究AFG1與HSA的結合位點、鍵合機理和相互作用力，利用Autodock程序進行分子對接研究。HSA由3 個相似的結構域（Ⅰ～Ⅲ）組成：域Ⅰ（1～195）、域Ⅱ（196～383）、域Ⅲ（384～585），每個結構域可以分為A、B兩個亞結構域（subdomain），每個亞結構域又分為3 個螺旋（X、Y、Z），以槽口相對的方式形成圓筒狀結構，幾乎所有的疏水性氨基酸都包埋在圓筒腔內部，構成疏水性腔[18-19]，如圖2所示。

圖 2 HSA的X-射線晶體結構Fig. 2 X-Ray crystallographic structure of HSA

通過Autodock程序進行HSA與AFG1的分子對接模擬計算，二者在298 K時的Gibbs自由能（Δ G）為－30.646 kJ/mol，最佳對接構象（結合位點為HSA的ⅠB疏水腔）見圖3。在ⅠB疏水腔中有兩個結合位點：一個位點為L1鏈、α-螺旋h7和h8之間，為遠端位點；另一個位點在L1和α-螺旋h9之間，為近端位點[19]。

圖 3 AFG1與HSA的最佳分子對接圖Fig. 3 Best molecular modeling for the interaction between AFG1and HSA

圖3顯示，AFG1整個分子嵌在ⅠB疏水腔的近端結合位點，說明二者主要的作用力為疏水作用。另外還能觀察到AFG1的外環酯鍵的羰基氧與精氨酸（Arg-114）形成了兩個氫鍵，鍵長為2.2 ?和3.0 ?，同時內環酯鍵羰基氧與組氨酸（His-146）、橋連五環醚基氧與酪氨酸（Tyr-138）各形成了一個氫鍵作用，鍵長分別為2.4 ?和2.0 ?，進一步穩定了AFG1-HSA復合物且增加了AFG1在HSA疏水腔中的疏水性。此外，AFG1雙呋喃環上的雙鍵能與附近的氨基酸His-146、Phe-149、Phe-157發生π－π*共軛作用，與呋喃環上沒有雙鍵的AFG1相比，AFG1-HSA復合物結構更為穩定，在血液中存在的半衰期時間更長，對人體來說，潛在毒性更大。

此外，有研究表明ⅠB結構域是復雜的雜環分子的主要結合位點[20]。而通過X-晶體衍射研究，含有雜環結構的植物抗癌藥物喜樹堿也結合在HSA的該疏水腔內[20]。在黃曲霉毒素引起的肝癌治療中，在手術前后，用喜樹堿藥物治療可以增加手術的成活率，這或許不僅跟喜樹堿本身的抗癌性有關，還與其能從血清蛋白中置換出黃曲霉毒素，減小黃曲霉毒素與血清蛋白的親和力，從而增加黃曲霉毒素自由濃度，加強其代謝有關。有赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）動物實驗表明，將OTA從血清蛋白中置換出來可以加快消除OTA在靶器官中的積累[21]。因此研究能降低黃曲霉毒素與HSA親和力的物質，能發展潛在的黃曲霉毒素中毒預防措施。

2.3 金屬離子對AFG1與HSA結合反應的影響

在小分子與血清白蛋白相互結合并被轉運的過程中，外源或內源金屬離子可能會對AFG1-HSA的相互作用過程產生影響。本實驗考察了人體內常見的6 種金屬離子對AFG1與HSA親和力的影響，結果見圖4。

圖 4 金屬離子對AFG1-HSA結合常數的影響Fig. 4 Effect of metal ions on the binding constant of AFG1to HSA

由圖4可看出，加入Ca2＋對AFG1-HSA的相互作用沒有影響，結合常數幾乎不變，而Fe3＋、Mg2＋的參與卻增大了AFG1對HSA的親和力，表明這兩種金屬離子參與降低了AFG1的游離濃度，有助于AFG1分子持久緩釋的發揮毒性，增加了個體攝入黃曲霉毒素后患癌癥的風險。Zn2＋、Cu2＋、Mn2＋的參與則能大大降低AFG1與HSA的親和力，具有一定的潛在預防AFG1對人體持久危害的作用，且Zn2＋的效果最好。

2.4 熱力學參數和結合力的確定

一般情況下，蛋白質與配體形成超分子復合物主要通過疏水作用、靜電作用、范德華力及氫鍵等來實現[22]。ΔH（焓變）、ΔS（熵變）、ΔG（自由能變化）可通過Van’t Hoff方程進行計算，再根據熱力學參數判斷AFG1與HSA主要作用力類型。

表 1 不同溫度條件下的AFG1-HSA熱力學參數Table 1 Thermodynamic parameters of AFG1-HSA system at different temperatures

由表1可知，AFG1與HSA反應的ΔG＜0，說明AFG1與HSA反應過程為自發過程。Ross等[23]通過大量實驗結果，得出了通過熱力學參數確定蛋白與配體作用力類型的判斷依據。結果顯示在4 個溫度條件下ΔH＜0，說明反應是放熱反應。ΔS＞0，說明AFG1與HSA之間存在疏水作用力。由于HSA的復雜結構，在實際與配體的反應中，往往同時存在幾種相互作用力[24]，而ΔH＜0，說明反應中還存在一定的氫鍵作用。通過ΔH和ΔS推斷出，AFG1與HSA結合作用力主要是疏水作用力和氫鍵，且ΔG值、相互作用力類型與分子對接結果一致。在研究AFG1的降毒過程中，增加AFG1的親水基團，降低其進入HSA疏水腔的概率，可以降低AFG1與HSA的親和力，從而達到降低AFG1對人體毒性作用的效果。

2.5 AFG1與HSA結合距離的研究

能量轉移現象是內源性熒光發色基團發生猝滅，本質上是存在一個分子發射光譜（供體）與另一個分子吸收光譜（受體）重疊，而此時分子之間在偶極-偶極共振耦合作用下使得能量發生轉移。根據F?rster’s非輻射能量轉移，供體和受體之間的距離r與轉移效率E、臨界距離R0的關系式如下[25]：

式中：F0和F分別是加入供體前后的HSA熒光值；K2為偶極空間取向因子；N是介質折射指數；J為毒素的吸收光譜與蛋白質的熒光發射光譜之間的重疊積分；F（λ）是供體在波長λ時的熒光強度；ε（λ）是毒素在波長λ處的摩爾吸光系數。毒素的紫外光譜與HSA的熒光重疊圖譜見圖5。在該實驗條件下，有報道K2=2/3、N=1.336和Φ=0.118[26]。

圖 5 熒光發射光譜與AFG1紫外吸收光譜重疊圖Fig. 5 Overlap between fl uorescence emission spectra and absorption spectra of HSA

根據上述公式計算得出，在AFG1-HSA體系中：J= 1.16×10－14（cm3·L）/mol，E=0.17，R0=2.51 nm，r=3.26 nm。數據結果表明AFG1與HSA反應的結合距離r小于7 nm，且同時符合了0.5 R0＜r＜2.0 R0，說明AFG1與HSA在結合過程中發生了非輻射能量轉移，導致HSA熒光猝滅，而R0＜r，說明非輻射能量轉移引起的熒光猝滅幾率較小，靜態猝滅占主要地位。

2.6 AFG1與HSA的3D熒光掃描

圖 6 HSA與AFG1-HSA的3D熒光譜圖和相對應的等高圖Fig. 6 Three-dimensional fl uorescence spectra and contour diagrams of HSA and AFG1-HSA

三維熒光光譜體現的是熒光強度隨激發和發射波長同時變化的信息，引起譜圖特征以及豐富的信息含量，為小分子與生物相互作用機理的研究提供了有力手段[27]。HSA及HSA與AFG1相互作用后的三維熒光及其等高圖見圖6。

HSA在激發波長為230 nm（峰1）和280 nm（峰2），發射波長為340 nm處分別有一個最大吸收峰。峰1主要顯示色氨酸和酪氨酸殘基的光譜特性；峰2主要顯示多肽鏈主鏈結構的熒光特征，是由于多肽骨架結構具有C＝O發生n–π*躍遷引起的，該峰的熒光強度與蛋白質的二級結構密切相關[28]。從圖6中的3D熒光的高度及其等高圖的疏密程度可以看出，加入AFG1后，HSA的峰1和峰2的熒光強度都呈現明顯下降，說明AFG1的加入使得HSA二級結構發生一定的變化。HSA的峰1位置為280 nm/340 nm（λex/λem），峰2位置為235 nm/340 nm；加入AFG1后峰1位置為280 nm/335 nm，峰2位置為235 nm/335 nm，兩個峰的stoke位移都發生了約5 nm藍移，說明AFG1與HSA的結合引起了HSA中部分肽鍵及其發色熒光基團微環境的疏水性增加，使整個大分子更趨向于折疊狀態。

2.6 AFG1與HSA反應的圓二色譜分析

不同二級結構的蛋白質或多肽所產生的CD譜帶的位置、吸收的強弱都不相同。因此CD譜帶的π–π*躍遷）和222 nm（肽鍵的n–π*躍遷）處出現負的吸收峰，α-螺旋結構的含量可用公式（6）、（7）求得[29]：

式中：θobs為208 nm波長處的橢圓度/mdeg；MRE為平均殘基的橢圓度/mdeg；Cp為HSA的濃度/（mol/L）；n為氨基酸殘基數目（HSA中氨基酸殘基數目為585）；l為樣品池的光徑（0.1 cm）。實驗中測定得到了cHSA∶cAFG1=1∶10時體系的CD光譜，結果見圖7。

圖 7 AFG1與HSA的圓二色譜圖Fig. 7 CD Spectra of AFG1and HSA

由圖7發現，在AFG1存在的條件下，HSA的208 nm和222 nm處的α-螺旋特征峰顯著地體現出來。通過計算，單獨HSA的α-螺旋含量為49.27%，加入10 μmol/LAFG1后，HSA的α-螺旋含量增加到60.60%。α-螺旋結構主要是由多肽鏈上羰基（—CO）和氨基（NH—）之間的氫鍵穩定[30]。結果說明AFG1與HSA的結合誘導了HSA多肽鏈的重排，引起原有的氫鍵網絡的結構改變，使得卷曲結構增加，肽鏈的二級結構發生了較大變化。推斷是AFG1與HSA相互作用，使得蛋白質分子的疏水性增強，導致HSA的肽鏈結構收縮，使得α-螺旋含量增加。說明血清蛋白在運輸AFG1的過程中，不僅改變了氨基酸所處的微環境，還使得HSA二級結構發生較大變化，該過程對HSA有一定的毒害作用。

3 結 論

通過研究AFG1與HSA相互作用，可獲取AFG1在體內被運轉、分配和代謝過程的重要信息。本實驗主要運用分子對接及其各種光譜方法，獲得AFG1-HSA體系的作用信息。研究發現AFG1能對HSA產生很強的猝滅效果，且猝滅機制為生成復合物的靜態猝滅，二者結合常數數量級為104，親和力較強，且結合位點數約為1。人體內必需的金屬離子能夠增大或降低AFG1對HSA的親和力，影響AFG1對人體的毒性行為。通過計算，二者反應距離為

3.26 nm，存在非輻射能量轉移。AFG1與HSA的最佳結合位點是HSA的ⅠB疏水腔中，主要結合力是疏水作用和氫鍵，且二者反應引起了HSA生色團氨基酸殘基微環境疏水性增加和二級結構α-螺旋含量增加。該研究對于深入分析小分子毒素在人體內的中毒機理及其暴露的風險評估提供了重要信息，且為發展潛在的中毒預防措施提供基礎理論研究。

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Binding Mechanism and Molecular Docking between Af l atoxin G1and Human Serum Albumin

ZHONG Hong, WANG Jiaman, MA Liang*, JIANG Tao
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The?interaction?between?the?mycotoxin?af l atoxin?G1(AFG1) and human serum albumin (HSA) was investigated by?molecular?docking,?f l uorescence?spectroscopy,?3D?f l uorescence?spectrum,?and?circular?dichroism?(CD)?under?simulated?physiological conditions (pH 7.4). According to the double logarithmic equation, the major binding mechanism between AFG1and HSA was a static quenching process. At four different temperatures, the magnitude of binding constants was 104and the number of binding sites was approximate to 1. Through the molecular docking and the calculation of thermodynamic parameters, the binding site of AFG1was in the ⅠB hydrophobic cavity, and hydrophobic interaction and hydrogen bonding were the major forces in the binding process. By studying the effect of metal ions on AFG1-HSA?reaction,?the?aff i nity?of?AFG1to HSA could be increased by Mg2+and Fe3+but greatly reduced by Zn2+, Mn2+and Cu2+. The binding distance between AFG1and?HSA?was?calculated?to?be?3.26?nm?based?on?F?rster’s?non-radiation?energy?transfer?theory.?The?3D?f l orescence?spectra revealed that the microenvironment of amino acid residues became more hydrophobic after the binding reaction. CD spectra revealed that the conformation of HSA was changed during the binding reaction as shown by an increase in α-helix. Key words: af l atoxin?G1(AFG1); human serum albumin (HSA); spectrum; molecular docking; binding interaction

10.7506/spkx1002-6630-201705014

R994.4

A

2016-09-10

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2013CB127803）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31301476）

鐘紅（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與質量控制。E-mail：625444055@qq.com

*通信作者：馬良（1979—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與食品檢測技術。E-mail：zhyhml@163.com