高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系結構及理化/功能性質的影響

畢 爽，李 楊，隋曉楠，王中江，齊寶坤，江連洲

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系結構及理化/功能性質的影響

畢 爽，李 楊，隋曉楠，王中江，齊寶坤，江連洲*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

以大豆蛋白-磷脂復合體系為研究對象，采用圓二色譜表征復合體系構象變化，采用乳化性及乳化穩定性測定、表面疏水性及粒度分析等解析高壓均質對復合體系中大豆蛋白二級結構的變化與理化/功能性質表達的影響。結果顯示：高壓均質會顯著改善復合體系的功能性質如乳化性和乳化穩定性。隨著均質壓力升高，體系中大豆蛋白表面疏水性顯著提高，說明疏水基團暴露明顯，蛋白質與磷脂間的相互作用程度增加。復合體系的體積平均粒徑由未均質時的33.21?μm降至3.61?μm，粒徑分布均勻，整體向小粒徑方向移動。圓二色譜結果顯示高壓均質改變了蛋白質-磷脂復合體系的構象，說明蛋白質和磷脂間發生相互作用，但當均質壓力進一步增加，和未經處理的樣品相比，樣品中的α-螺旋含量略有下降，同時功能性質稍有提高。

高壓均質；大豆蛋白；卵磷脂；結構性質；功能性質

大豆蛋白是一種良好的植物蛋白來源，營養價值較高，被廣泛地應用在食品加工與制造中[1]，但是天然大豆蛋白的各種功能性質很難同時滿足加工的需要，因此常對蛋白進行適當的改性。大豆磷脂是食品中重要的營養成分，具有改善食品風味和質地的作用。作為一種兩性離子表面活性劑，它可以通過疏水結合的方式使蛋白質的表面活性發生改變，且他們之間的交互作用會影響大豆蛋白的功能性質[2]。

至今，已有部分學者對大豆蛋白-磷脂交互作用方式進行了部分研究，但未能清晰地解釋高壓均質等物理加工方式對蛋白質-磷脂交互作用的影響，更缺少復合體系結構及功能性質隨高壓均質強度變化規律的研究。Beckwith[3]、Mantovani[4]等通過研究預測大豆蛋白與卵磷脂之間存在交互作用，Scuriatti等[5]研究發現磷脂可以與蛋白通過靜電作用和疏水作用結合形成復合物，復合物的產生對大豆蛋白的功能性質具有重要的影響。van Nieuwenhuyzen等[6]曾研究表明蛋白質的疏水區域可以與磷脂的疏水基團相結合。高壓均質在液體介質中的高速剪切和動態攪拌等作用，可以改變大豆蛋白的柔性空間結構，誘導磷脂結構變化，促進大豆蛋白與磷脂間的融合與交互[7]。Puppo[8]、姜梅[9]等研究發現高壓均質會導致大豆蛋白的二級結構發生重要的變化。Fernandez等[10]研究發現經過高壓均質處理形成的蛋白質乳液粒徑更小。但高壓均質對蛋白質磷脂相互作用、復合體系功能性質及復合體系結構和功能表達之間的構效關系等方面研究仍鮮見報道，限制了高營養價值大豆蛋白-磷脂產品的開發與利用。

針對此問題，本實驗利用高壓均質的空化及剪切撞擊作用調控大豆蛋白-磷脂復合體系的構建，解析高壓均質對大豆蛋白-磷脂交互作用的影響。對不同高壓均質條件下（0、50、100、150、200、250 MPa）復合體系的構象變化進行解析，對乳化性、乳化穩定性、表面疏水性、粒徑和ζ-電位進行分析和表征，明確高壓均質對蛋白質-磷脂間的相互作用、復合體系結構與功能之間構效關系的影響，以期為高壓均質技術運用生產高乳化性和穩定性的大豆蛋白-磷脂復合產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 東北農業大學糧食、油脂及植物蛋白工程實驗室自制；大豆卵磷脂 美國Sigma公司；葵花籽油 九三糧油工業集團有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 北京新光化工試劑廠；國產試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

ULTRA-TURRAX UTL2000乳化機 德國IKA公司；超高壓均質機FB-110T上海勵途機械設備工程有限公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；J-810圓二色譜儀 日本Jasco公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；ZetaPALS-Zeta電位儀 美國布魯克海文儀器公司；F-4500熒光分光光度計 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考Wolf[11]提取分離蛋白的方法。用2 mol/L的NaOH調節溶液的pH值至8.5，攪拌后在4 ℃條件下10 000×g離心20 min，取上清液再用2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5。靜置后在4 ℃條件下6 000×g離心20 min，沉淀水洗2 次后分散于水中并用2 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0。冷凍干燥后粉碎得大豆分離蛋白。

1.3.2 高壓均質制備大豆蛋白-磷脂復合體系

將10 mg/mL的大豆分離蛋白溶液置于燒杯中，以蛋白質-磷脂10∶1（m/m）的比例添加磷脂，攪拌1 h使蛋白質和磷脂充分溶解并產生交互作用。采用高壓均質機處理大豆蛋白-磷脂復合溶液，均質壓力分別選擇為0、50、100、150、200、250 MPa。

1.3.3 乳化性及乳化穩定性的測定

乳化性及乳化穩定性的測定參考Li Chen等[12]的方法。從高壓均質后的溶液樣品中取9 mL加入3 mL葵花籽油，室溫條件下組織分散1 min后從底部取樣：均質之后立即抽出乳狀液50?μL和均質之后乳液靜置10 min的乳狀液50?μL，再用0.1 g/100 mL的SDS溶液稀釋200 倍，漩渦振蕩混勻后用分光光度計在500 nm波長處測其吸光度A，以SDS溶液作為空白對照。乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性（emulsifying stability index，ESI）分別按式（1）和（2）計算。

式中：T為常數2.303；N為稀釋倍數200；θ為油相體積分數（25%）；L為比色杯厚度1 cm；C為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質質量濃度，10 mg/mL；A0、A10分別為乳狀液在0、10 min的吸光度；t10－t0：時間差，10 min。

1.3.4 表面疏水性的測定

蛋白質-磷脂復合物的表面疏水性測定參考Nakai[13]的測定方法，將不同高壓均質處理的大豆分離蛋白與磷脂溶液以10 000×g離心30 min，取上清液測定蛋白質量濃度，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液依次將蛋白樣品稀釋，使溶液質量濃度在0.05～0.40 mg/mL之間。實驗中激發波長λex=390 nm，發射波長λem=468 nm，夾縫為5 nm，掃描速率為10 nm/s。取溶液4 mL，分別加入40?μL濃度為8 mmol/L的8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）溶液，經振蕩快速混合后靜置3 min后測定樣品熒光強度。以熒光強度與蛋白質質量濃度作圖，表面疏水性為蛋白質分子的初始段斜率。

1.3.5 粒徑分布的測定

利用Mastersizer 2000激光粒度儀進行粒徑分布測定。對不同高壓均質條件形成的大豆蛋白-磷脂溶液樣品進行測定，顆粒折射率1.46，分散劑折射率1.33，吸收參數0.001[14]。

1.3.6 ?ζ-電位的測定

采用電位儀測定樣品的ζ-電位，大豆蛋白-磷脂溶液適度稀釋，上樣體積為1 mL，測定溫度為25 ℃，溫度平衡時間為2 min[15]。重復3 次測定最終得到的平均值即為最終結果。

1.3.7 圓二色譜分析

利用圓二色譜在遠紫外區（260～180 nm）測定高壓均質對樣品中蛋白質二級結構的影響。取樣品在20 ℃條件下10 000×g離心后稀釋至蛋白質質量濃度為0.1 mg/mL。測定條件：掃描速率為100 nm/min，掃描波長范圍為250～200 nm，樣品池光程為0.1 nm，靈敏度為100 mdeg/cm，每個樣品重復3 次測定。數據通過CDPro軟件進行分析。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系乳化性和乳化穩定性的影響

圖 1 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系乳化性及乳化穩定性的影響Fig. 1 Effect of homogenization pressure on emulsion activity and stability index of soybean protein-lecithin system

由圖1可知，大豆蛋白-磷脂復合體系的乳化性隨著均質壓力的增加而加強，壓力從0 MPa增加到250 MPa的過程中，乳化性由28.3 m2/g增加到115.4 m2/g。但當均質壓力從200 MPa升高到250 MPa時，乳化性增加率較小。復合體系乳化性的高低受諸多因素影響，如蛋白質與磷脂的結合程度、溶解性或蛋白質分子質量分布等。同時，這些因素都決定于高壓均質的強度[16]。大豆蛋白-磷脂復合體系的乳化穩定性變化趨勢與乳化性相似。沈蘭等[17]研究發現均質壓力的升高可使大豆分離蛋白的乳化性顯著增加，但當均質壓力達到160 MPa后，變化并不顯著。隨著均質壓力的增加，蛋白質分子結構變得松散，暴露出更多的疏水基團與磷脂的疏水尾部相互作用得到加強，復合體系的親水親油程度同時增加，且兩者達到較好的平衡[18]，提高了復合體系的乳化性和乳化穩定性。另一方面，蛋白質-磷脂復合體系的乳化性也同時表征大豆蛋白溶于水相溶液的能力和磷脂吸附到界面層上的能力。因此，大豆蛋白的溶解性提高也導致復合體系向油-水界面的擴散能力提高，乳化和乳化穩定能力上升。但當均質壓力進一步增大后，體系乳化性增加速率降低。可能是由于蛋白質-蛋白質分子間疏水相互作用產生，磷脂與蛋白質間的作用受到競爭抑制而減弱，因此乳化性增加不再明顯[19]。

2.2 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系表面疏水性的影響

圖 2 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系表面疏水性的影響Fig. 2 Effect of homogenization pressure on surface hydrophobicity of soybean protein-lecithin system

如圖2所示，未處理的樣品表面疏水性最低，經過高壓均質處理后，所有樣品中蛋白質的表面疏水性均有所升高。且在均質壓力為250 MPa條件下，表面疏水性最高。這與Hayakawa等[20]的研究結果一致，未經高壓均質處理的大豆蛋白中大多數疏水基團被緊密包埋在球狀區域內，疏水基團和熒光探針之間的接觸受到抑制。高壓均質處理后大豆分離蛋白與磷脂改變了自身的空間結構，同時兩者間的疏水相互作用也影響著磷脂分子的排列形式[21]，高壓均質作用使兩者之間的結合更為緊密。大豆蛋白以疏水作用固定在磷脂膜上，因此表面疏水性進一步提高。然而，當均質壓力增加到200 MPa后，大豆蛋白-磷脂復合體系的表面疏水性增加趨于緩慢、平穩的狀態，可能由于大豆蛋白出現一定程度的聚集，這種蛋白質聚集阻止了疏水基團的暴露[22]。

2.3 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系粒徑分布的影響

圖 3 高壓均質對大豆蛋白-磷脂乳液體積平均粒徑D[4,3]（A）和粒徑分布（B）的影響Fig. 3 Effect of homogenization pressure on emulsion D[4,3](A) and droplet size distribution (B) of soybean protein-lecithin system

體積平均粒徑D[4,3]可衡量體系液滴的平均大小。大豆蛋白-磷脂復合體系溶液經高壓均質處理前后，D[4,3]如圖3A所示。未經均質處理時體系的D[4,3]為33.21 μm，高壓均質處理后復合體系的D[4,3]普遍降低。可能是樣品溶液經過高壓均質機后在狹小的空間內被撞擊，造成復合體系顆粒的解聚、破碎，所以體系的粒徑較小。

由圖3B可知，未經高壓均質時溶液呈雙峰粒徑分布，且大峰主要分布在10～100?μm之間。經過高壓均質處理后粒度分布明顯向小粒徑方向移動，尤其是當均質壓力為200 MPa和250 MPa時，溶液粒徑主要分布在1～10?μm之間，且在0.3～1.0?μm之間也有小峰分布。說明此時溶液中液滴具有相似的直徑，故穩定性較強。與本文中ζ-電位結果一致。Fernandez等[10]研究發現高壓均質導致蛋白質解折疊，疏水基團暴露。磷脂由于具有親水親油特性，故與大豆蛋白間的疏水相互作用增強。同時磷脂也會誘導大豆蛋白結構進一步展開[23]，使疏水基團以更容易的方式暴露后增加與磷脂間的相互作用，從而降低粒徑。然而，當均質壓力從200 MPa升高至250 MPa后，體積平均粒徑D[4,3]雖仍然降低但變化不再顯著，粒徑分布移動差異也隨之減小，可能由于均質壓力過高導致能量輸入過大，體系中顆粒有重新聚合的趨勢[24]，所以平均粒徑不再降低。

2.4 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系ζ-電位的影響

圖 4 高壓均質大豆蛋白-磷脂復合體系溶液ζ-電位的影響Fig. 4 Effect of homogenization pressure on ζ-potential of soybean protein-lecithin system

不同高壓均質條件下，樣品的ζ-電位變化如圖4所示。在中性條件下，未經高壓均質處理的樣品粒滴表面呈現出較低的負電性，約為－8.71 mV。隨著均質壓力的升高，溶液的ζ-電位絕對值均增大。但當均質壓力超過150 MPa后，ζ-電位絕對值增加率降低，均質壓力由200 MPa提升至250 MPa的過程中，溶液的電位絕對值略有增加。ζ-電位可衡量顆粒之間相互吸引或吸引力強度[25]。其絕對值代表溶液的穩定性，絕對值越高，分散粒子間的排斥力越大，越不易發生相互碰撞而聚集。反之，絕對值越低，粒子間越傾向于相互吸引而發生聚集。Karlis等[26]研究發現高壓均質導致顆粒表面負電荷增加的原因是蛋白質分子結構發生了重排。Mantovani等[4]研究發現高壓均質提高了蛋白質表面的離子化基團數目和蛋白質水合能力，乳清蛋白-磷脂復合體系的穩定性在25～60 MPa范圍逐漸升高。而本實驗當均質壓力增加到200 MPa時，大豆蛋白-磷脂復合體系的ζ-電位絕對值增加率顯著降低。說明均質壓力達到200 MPa利于大豆蛋白與磷脂發生相互作用而提高體系穩定性。但過高的均質壓力可能會導致蛋白質的重聚集，液滴間的靜電排斥力不再增加，因而溶液穩定性維持在一定水平上，抑制復合體系溶液在貯存期間的擾動。該結果也可支持2.1節中樣品乳化穩定性較好的結果。

2.5 高壓均質后大豆蛋白-磷脂復合物中大豆蛋白的構象分析

圓二色譜是一種測量蛋白二級結構快速、準確且靈敏的技術，可以在水溶性蛋白溶液中直接測量計算出蛋白質各類型二級結構的含量[27]。研究選擇能反映肽鍵圓二色性的遠紫外區200～240 nm光譜條件，測定不同高壓均質條件處理后復合物中蛋白質的圓二色譜吸收，測定結果計算后見表1。

表 1 圓二色譜測定不同高壓均質處理后復合物中大豆蛋白的二級結構含量Table 1 Secondary structural contents of homogenization pressuretreated soybean protein-lecithin complex estimated from circular dichroism spectra

經過不同條件高壓均質處理后，蛋白質中二級結構含量均發生了明顯的變化。如表1所示，所有樣品均表現出α-螺旋含量降低，β-折疊和β-轉角含量升高的現象，樣品中蛋白質二級結構以β-結構為主。與Li Chen等[12]的研究一致，可能是大豆卵磷脂結合到大豆蛋白α-螺旋結構中的疏水性氨基酸區域，從而使蛋白質分子展開改變其空間構象。且該現象在均質壓力增大后更加明顯。這歸因于高壓均質產生的壓力作用、高頻振蕩和對流撞擊等機械力誘導蛋白質結構發生改變，從而影響了大豆蛋白-磷脂復合體系的功能性質。但是當高強度均質作用于復合體系后，α-螺旋結構的含量增加緩慢，蛋白質發生不溶性聚集，與磷脂間的相互作用減弱。復合體系的結構特征和功能特性是高度相關的，蛋白質二級結構的改變使復合體系更具有均勻性和柔性的特點，在油-水界面上吸附得更完全，與本研究中復合體系乳化性的測定結果一致。

3 結 論

本實驗采用不同均質壓力處理大豆蛋白與磷脂形成的復合體系溶液，以探究外界條件對復合體系結構和功能性質的影響，主要結論：1）高壓均質能夠顯著提高大豆蛋白與磷脂的相互作用程度，同時改善大豆蛋白-磷脂復合乳化體系的乳化特性、表面疏水性等性質。隨著均質壓力的提高，復合體系的粒徑減小、整體粒徑分布向小粒徑區域移動，溶液體系外觀均一；2）復合體系的ζ-電位及乳化穩定性分析表明，高壓均質通過增加顆粒表面的凈電荷含量提高蛋白質-磷脂復合體系和水包油型乳狀液的穩定性。高壓均質處理可使大豆蛋白分子展開，通過與磷脂發生疏水相互作用而保持乳化層致密、完整。但均質壓力超過200 MPa后，復合體系趨于穩定；3）圓二色譜結果表明，高壓均質會改變大豆蛋白-磷脂復合體系的構象。隨著均質壓力的升高，大豆蛋白二級結構中的α-螺旋含量降低，β-折疊和β-轉角含量上升，這說明大豆蛋白與磷脂產生了相互作用。適宜高壓均質條件下大豆蛋白與磷脂間的交互作用加強，從而提高了復合體系的功能性質。

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Effect of High Pressure Homogenization on Structural, Physicochemical and Functional Properties of Soybean Protein-Lecithin Composite System

BI Shuang, LI Yang, SUI Xiaonan, WANG Zhongjiang, QI Baokun, JIANG Lianzhou*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

The objective of this research was to reveal the effect of high pressure homogenization on the change in protein secondary structure and physicochemical and functional properties of soybean protein isolate (SPI)-lecithin system through characterizing conformational changes by circular dichroism spectroscopy and through measuring emulsifying capacity, emulsion stability, surface hydrophobicity and droplet size distribution. The results showed that high pressure homogenization improved emulsion activity index and emulsion stability index of the complex system signif i cantly. The surface hydrophobicity of SPI significantly increased at higher pressure of homogenization, implicating considerable exposure of surface hydrophobic groups and increased interaction between soybean protein and phospholipid. After the homogenization treatment, the average droplet diameter of the composite system decreased from 33.21 to 3.61 μm, and the droplet size distribution was uniform with a slight shift towards smaller droplet sizes. Circular dichroism spectral results showed that high pressure homogenization resulted in conformational changes of the composite system, implying the occurrence of interaction between protein and lecithin. However, with further increasing homogenization pressure, only a little reduction in α-helix content was observed compared with untreated samples.

high pressure homogenization; soybean protein; lecithin; structural properties; functional properties

10.7506/spkx1002-6630-201705024

TS214.9

A

1002-6630（2017）05-0148-06

畢爽, 李楊, 隋曉楠, 等. 高壓均質對大豆蛋白-磷脂復合體系結構及理化/功能性質的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(5): 148-153. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705024. http://www.spkx.net.cn

BI Shuang, LI Yang, SUI Xiaonan, et al. Effect of high pressure homogenization on structural, physicochemical and functional properties of soybean protein-lecithin composite system[J]. Food Science, 2017, 38(5): 148-153. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705024. http://www.spkx.net.cn

2016-02-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD22B00）；

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2013AA102104）；黑龍江省自然科學基金重點項目（ZD201302）；高等學校博士生學科點專項科研基金博導類資助項目（20132325110013）

畢爽（1992—），女，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：13163436989@163.com

*通信作者：江連洲（1960—），男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：jlzname@163.com