ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制二肽與ACE結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式

管 驍，洪延涵，劉 靜，李景軍，孫 注，韓 飛

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海海事大學(xué)信息工程學(xué)院，上海 201306；3.江蘇長壽集團(tuán)有限公司，江蘇 無錫 226500；4.內(nèi)蒙古燕谷坊生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展（集團(tuán)）有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 201106；5.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制二肽與ACE結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式

管 驍1，洪延涵1，劉 靜2，李景軍3，孫 注4，韓 飛5

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海海事大學(xué)信息工程學(xué)院，上海 201306；3.江蘇長壽集團(tuán)有限公司，江蘇 無錫 226500；4.內(nèi)蒙古燕谷坊生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展（集團(tuán)）有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 201106；5.國家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

IW（Ile-Trp）、VW（Val-Trp）是兩種對人體體細(xì)胞ACE（somatic ACE，sACE）中的C-結(jié)構(gòu)域（C-domain）具有選擇抑制性活性的食源性二肽，但其與ACE兩個(gè)結(jié)構(gòu)域（包括C-domain和N-domain）的結(jié)合模式與分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用分子柔性對接技術(shù)分別對上述兩種肽與靶標(biāo)的作用位點(diǎn)、結(jié)合能及作用力類型等進(jìn)行研究。對接結(jié)果表明，IW、VW與ACE C-domain的活性位點(diǎn)存在氫鍵、親水、疏水相互作用力及配位鍵，與N-domain作用模式相似，但生成氫鍵數(shù)目較少，且與Zn2＋不產(chǎn)生靜電相互作用。通過比較IW、VW分別與兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能量差異，證明IW、VW針對兩個(gè)結(jié)構(gòu)域有不同的抑制強(qiáng)度，可為指導(dǎo)開發(fā)ACE C-domain選擇性抑制肽提供理論參考。

ACE；C-domain 選擇性抑制肽；柔性對接；結(jié)合模式

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）是一種含鋅的二肽羧肽酶，可催化無活性的血管緊張素（angiotensin，Ang）Ⅰ轉(zhuǎn)化為強(qiáng)烈收縮血管的血管緊張素Ang Ⅱ，同時(shí)可水解具有舒張血管作用的舒緩激肽[1-2]，導(dǎo)致人體血壓升高。人體內(nèi)的ACE以兩種形式存在：體細(xì)胞ACE（somatic ACE，sACE）和睪丸ACE（testic ACE，tACE）。特別是sACE在各種組織中普遍存在，由兩個(gè)高度同源的蛋白結(jié)構(gòu)域N、C-domain組成，各包含一個(gè)活性序列His-Glu-X-X-His（HEXXH）和Zn2＋[3-4]。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域擁有60%的序列相似性，但在底物和抑制劑的特異性及氯離子激活等方面存在較大差異[5-7]。前人研究表明，將無活性的Ang Ⅰ水解為具有強(qiáng)烈收縮血管作用的Ang Ⅱ是專一通過sACE的C-domain完成的，N-domain無此功能；而對具有舒張血管作用的舒緩激肽的水解則可通過兩個(gè)結(jié)構(gòu)域同時(shí)完成[8]。

當(dāng)前所認(rèn)識的絕大多數(shù)ACE抑制肽都屬結(jié)構(gòu)域混合型抑制肽（同時(shí)抑制兩個(gè)結(jié)構(gòu)域活性），在抑制ACE活性的同時(shí)也導(dǎo)致了舒緩激肽的積累，過量的舒緩激肽易導(dǎo)致干咳、嘔吐、皮疹等副作用[9]。從理論上講，ACE C-domain選擇性抑制肽既可有效抑制Ang Ⅱ的生成，又保留了ACE N-domain水解舒緩激肽的活性，是副作用更小、安全性更高的預(yù)防與控制心血管疾病的藥物[10-11]。最新的研究發(fā)現(xiàn)IW（Ile-Trp）、VW（Val-Trp）兩種二肽對ACE C-domain有特異性抑制作用[12-14]，但它們對ACE兩個(gè)結(jié)構(gòu)域作用的分子機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以這兩種選擇性抑制肽為研究對象，通過與ACE兩個(gè)結(jié)構(gòu)域柔性對接結(jié)果的分析闡明其結(jié)合模式與選擇性抑制作用機(jī)制，為針對性設(shè)計(jì)ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制肽提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 初始結(jié)構(gòu)的獲得及處理

從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中下載ACE的C-domain與N-domain的X衍射三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，編號分別為1O86和2C6N[15-18]。結(jié)晶結(jié)構(gòu)中還存在某些氨基酸殘基和原子的缺失，采用Discovery Studio2.5軟件（Accelrys公司）處理該蛋白質(zhì)，刪除模擬過程中不需要的水分子和抑制劑小分子Lisinopril，保留Zn2＋和Cl－并優(yōu)化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

1.2 小分子的生成及結(jié)構(gòu)優(yōu)化

以IW、VW為抑制劑研究對象，用MDL ISISDraw v2.5軟件（創(chuàng)騰科技有限公司）畫出IW、VW的結(jié)構(gòu)式（圖1），加氫后糾正其結(jié)構(gòu)并用Discovery Studio中的CHARMm[17-19]力場進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，得到最低能量結(jié)構(gòu)。并利用DS 2.5中的Prepare Ligands處理該配體，使其產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)及異構(gòu)體。最終得到的結(jié)構(gòu)保存為mol格式，用于分子對接。

圖 1 VW（A）、IW（B）的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structural formula of VW (A) and IW (B)

1.3 分子對接參數(shù)設(shè)置

所有計(jì)算工作均在HP Z620計(jì)算機(jī)工作站上完成。采用Discovery Studio2.5以分子柔性對接方法分別建立ACE的C-domain和N-domain與底物及抑制肽的分子對接模型，利用柔性對接可以較好模擬活性肽與ACE之間的誘導(dǎo)契合效應(yīng)，使對接結(jié)果接近二者的真實(shí)構(gòu)象[20]。C-domain中需補(bǔ)全的殘基為Ser435、Glu436、Gly437、Gly438，均位于蛋白酶的活性位點(diǎn)外。N-domain中沒有需補(bǔ)全的殘基。

依據(jù)DS對接程序，將ACE定義為受體，二肽設(shè)置為配體，C-domain的對接運(yùn)行參數(shù)為：Radius（半徑）12 ?，三維坐標(biāo)為X：40.90；Y：37.22；Z：46.13。活性位點(diǎn)的選擇基于文獻(xiàn)、軟件中的Define Site及復(fù)合物的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。選用C-domain的His353、Ala354、Ser355、Ala356、Val380、His383、Glu384、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Asp415、Lys511、Phe512、His513、Ser516、Ser517、Val518、Tyr520、Arg522、Tyr523為活性位點(diǎn)殘基[16-17,21-23]。N-domain的對接運(yùn)行參數(shù)為：Radius 12 ?，三維坐標(biāo)為X：－26.39；Y：－20.78；Z：－35.88，對接區(qū)域殘基為：His331、Ser333、Ala332、Ala334、Val358、His361、Glu362、His365、Phe369、His388、Glu389、Asp393、Lys489、Phe490、His491、Val496、Arg500、Tyr501、Phe505[24-25]。用Flexible Docking 工具包將IW、VW分別對接到兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中，得到一系列結(jié)合配體構(gòu)象。綜合考慮LibDockScore的高低、配體-受體復(fù)合物的CDocker Energy、CDocker Interaction Energy得分、軟件中打分函數(shù)（Ligscore 1、Ligscore 2、PLP1、PLP2、Jain、PMF、PMFO4）打分值的高低選取最優(yōu)構(gòu)象[26-28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 VW與ACE的對接結(jié)果

2.1.1 VW與ACE C-domain對接結(jié)果分析

表 1 VW與ACE C-domain形成的最佳結(jié)合構(gòu)象的氫鍵參數(shù)Table 1 Hydrogen bonds observed between the C-domain and the best pose of VW

圖 2 VW與ACE C-domain的相互作用圖Fig. 2 Interaction schemes between VW and the ACE C-domain

分析VW與ACE C-domain的分子對接結(jié)果，可以看到VW呈現(xiàn)一種蜷曲的構(gòu)象深埋于C-domain的活性中心裂縫中，形成5個(gè)氫鍵（圖2a、b），最佳結(jié)合構(gòu)象的氫鍵參數(shù)如表1所示。Ala354、Glu384各與VW形成兩個(gè)較強(qiáng)的氫鍵，為二者相互作用的關(guān)鍵氨基酸殘基，VW的N端氨基產(chǎn)生4 個(gè)氫鍵為舵手基團(tuán)。VW的C端羧基與His383形成一個(gè)相對較弱的氫鍵，His383是ACE C-domain維持活性、調(diào)控血壓的主導(dǎo)性位點(diǎn)的重要氨基酸殘基，VW與His383的結(jié)合可抑制ACE與Zn2＋的結(jié)合。同時(shí)，VW與His513形成較強(qiáng)Pi鍵，鍵長5.40 ?；VW的N端氨基的氫原子與Glu384之間有靜電相互作用力產(chǎn)生；VW的O16與ACE的Zn2＋形成配位鍵，產(chǎn)生電荷相互作用。圖2c中圍繞在VW外面的不同濃度的灰度圖表示VW與蛋白之間的疏水相互作用力，疏水作用力的大小由顏色深淺度區(qū)分，顏色越淺表明疏水作用力越大。可以看到VW和C-domain的結(jié)合產(chǎn)生疏水作用，尤其在C-domain活性位點(diǎn)疏水區(qū)有疏水相互作用力。疏水作用由Ala354、Phe457、 Phe527和Val380等殘基形成。產(chǎn)生親水作用的氨基酸殘基有9 個(gè)：Gln281、His353、His383、Glu384、His387、Glu411、Asp415、Lys511、His513（圖2d）。VW中的吲哚芳環(huán)等疏水基團(tuán)與C-domain的疏水氨基酸殘基形成了較強(qiáng)疏水作用，親水基團(tuán)如羧基、氨基等參與了分子間親水作用的形成。

2.1.2 VW與ACE N-domain對接結(jié)果分析

表 2 VW與ACE N-domain形成的最佳結(jié)合構(gòu)象的氫鍵信息Table 2 Hydrogen bonds observed between the N-domain and the best pose of VW

圖 3 VW與N-domain的相互作用圖Fig. 3 Interaction schemes between VW and the ACE N-domain

將VW對接到ACE的N-domain上，篩選出最佳對接構(gòu)象（圖3a、b）。由圖中可以清晰看出VW結(jié)合于空腔內(nèi)，與N-domain之間形成2 個(gè)氫鍵。Thr496與VW的氮端氨基形成一個(gè)較強(qiáng)氫鍵，Tyr501和肽鍵上的羥基形成一個(gè)弱氫鍵。Thr496、Tyr501為產(chǎn)生氫鍵的關(guān)鍵氨基酸殘基。與C-domain不同，VW與ACE N-domain之間的氫鍵作用相對較弱，產(chǎn)生氫鍵數(shù)目較少。具體氫鍵參數(shù)如表2所示。同時(shí)Tyr501與VW形成兩個(gè)較強(qiáng)Pi鍵，鍵長分別為4.38 ?和6.68 ?；His491與VW的氮端N20形成鍵長3.86 ?的Pi鍵。Lys489與VW形成強(qiáng)Pi鍵，鍵長2.31 ? 。ACE抑制劑的活性形態(tài)要求與ACE的Zn2＋結(jié)合的基團(tuán)必須為—SH、COO—兩類，而VW中羧基中的氧原子與Zn2＋的距離為2.43 ?，大于氧原子（1.40 ?）與Zn2＋（0.74 ?）的共價(jià)半徑總和，意味著未形成配位鍵。圖3c中VW外圍的密布圖呈深灰表明VW與ACE的N-domain形成的疏水作用力較小。其中，Ala332、Ala334、Phe490、Phe435和Phe505是通過疏水作用力穩(wěn)定復(fù)合物的構(gòu)象；His491、Asn494、His331、Glu389、His361、Glu362、His365、Asp393通過親水作用影響兩者之間的關(guān)系（圖3d）。

2.2 IW與ACE的對接結(jié)果

2.2.1 IW與ACE C-domain對接結(jié)果分析

表 3 IW與ACE C-domain形成的最佳結(jié)合構(gòu)象的氫鍵參數(shù)Table 3 Hydrogen bonds observed between the ACE C-domain and the best pose of IW

圖 4 IW與ACE C-domain的相互作用圖Fig. 4 Interaction schemes of IW with the ACE C-domain

將IW對接到ACE的C-domain中，最佳結(jié)合構(gòu)象的結(jié)構(gòu)圖如圖4a所示。圖中可以清晰看到IW位于疏水空腔中，與C-domain形成6 個(gè)氫鍵。由表3可看出，IW氮端氨基的H原子，在兩者相互作用中貢獻(xiàn)較大，為舵手基團(tuán)，作為氫鍵供體與Ala354和Glu384形成4 個(gè)氫鍵，Ala354參與形成一個(gè)較強(qiáng)氫鍵，Glu384參與形成3 個(gè)強(qiáng)氫鍵，IW的肽鍵分別與Ala354和His513各形成一個(gè)氫鍵，故Ala354、His513和Glu384為產(chǎn)生氫鍵的關(guān)鍵氨基酸殘基。圖4b顯示Glu384與IW氮端氨基的氫原子形成靜電相互作用情況。IW通過C端羧基與酶活性位點(diǎn)處Zn2＋螯合，產(chǎn)生電荷相互作用，且Zn2＋與VW中羧基中的O原子距離為2.10 ?，表明形成配位作用。圖4d所示為IW周圍親水氨基酸及疏水氨基酸殘基分布圖。其中，與IW產(chǎn)生親水作用的ACE氨基酸殘基有7 個(gè)：His353、His383、Glu384、His387、Glu411、His513、His353、Arg522。產(chǎn)生疏水作用的ACE氨基酸殘基有6 個(gè)，由弱到強(qiáng)排序?yàn)锳la354、Ala356、Phe391、Phe512、Val380、Val518（疏水值1.8～4.2）。這些疏水性氨基酸產(chǎn)生了較強(qiáng)的疏水相互作用力（圖4c），形成的作用力將IW固定在C-domain的活性中心，對復(fù)合物的穩(wěn)定起主要作用。

2.2.2 IW與ACE N-domain對接結(jié)果分析

表 4 IW與ACE N-domain形成的最佳結(jié)合構(gòu)象的氫鍵信息Table 4 Hydrogen bonds observed between N-domain and the best pose of IW

圖 5 IW與ACE N-domain的相互作用圖Fig. 5 Interaction schemes of IW with the ACE N-domain

IW對接到ACE的N-domain中，按LibDockScore 降序排列，再綜合比較各個(gè)打分函數(shù)的打分值，最佳構(gòu)象見圖5a。最佳結(jié)合構(gòu)象的氫鍵參數(shù)如表4所示。IW的肽鍵上的氫原子與Ala332和Glu362分別產(chǎn)生兩個(gè)強(qiáng)氫鍵，且Glu362與IW氮端氨基的氫原子有靜電相互作用產(chǎn)生。His365作為與Zn2＋產(chǎn)生配位鍵的氨基酸殘基與IW的氮端氨基形成較強(qiáng)Pi鍵，鍵長4.29 ?。Lys489的NZ與IW形成鍵長4.51 ?的Pi鍵。Zn2＋與IW中羧基中的O原子距離為2.07 ?，表明有配位鍵產(chǎn)生。通過圖5c中圍繞在IW外的灰度圖看出IW與ACE N-domain之間形成較弱的疏水相互作用力，與IW產(chǎn)生疏水作用的氨基酸殘基由弱至強(qiáng)依次為Ala332、Ala334、Phe505、Phe490（疏水值1.8～2.8）；與IW產(chǎn)生親水作用的氨基酸殘基為：His491、His331、Arg500、Asp393、Glu389、His361、Glu362、His365。

綜合以上分析結(jié)果可知，IW、VW與ACE的C-domain作用機(jī)制相似，包括氫鍵、親水、疏水相互作用等方面，但在與N-domain的對接方式有所不同。通過比較可知IW、VW與C-domain結(jié)合產(chǎn)生氫鍵數(shù)目均多于各自與N-domain結(jié)合的氫鍵數(shù)，且氫鍵作用力均較強(qiáng)。在抑制劑與酶的結(jié)合過程中，氫鍵起穩(wěn)定對接復(fù)合物的作用，氫鍵的數(shù)目決定了抑制劑對酶的親和力。因此IW、VW與C-domain具有更高的親和力，是IW、VW對ACE C-domain具有選擇性抑制的重要原因之一。Zn2＋在一定程度上也可促進(jìn)酶與抑制劑的結(jié)合，IW、VW均能在C-domain與Zn2＋螯合以穩(wěn)定構(gòu)象，且產(chǎn)生靜電相互作用，靜電作用能分別為－79.45、－129.84 kJ/mol。IW在N-domain上雖然與Zn2＋螯合但沒有靜電相互作用，表現(xiàn)為較低的抑制活性，與體外活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。另外，對兩種二肽而言，與C-domain、N-domain兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)由蓺滏I的舵手基團(tuán)基本相同，即二肽的N端氨基與肽鍵參與形成氫鍵，但二肽的N端氨基在ACE的C-domain上參與形成氫鍵數(shù)量較N-domain更多，可推測，二肽的氮端氨基酸在與C-domain結(jié)合比在N-domain中作用大。

2.3 二肽分別與C-domain和N-domain氨基酸殘基間的作用能分析

表 5 VW、IW與C-domain活性位點(diǎn)氨基酸殘基間的相互作用能Table 5 Electrostatic energy, van der Waals energy and total potential energy between the best poses of bioactive peptides obtained from docking results and the C-domain

為了驗(yàn)證上述提出的結(jié)合模式，分別對不同結(jié)合體系的活性位點(diǎn)氨基酸殘基進(jìn)行了結(jié)合自由能分解計(jì)算[29]。主要通過DS2.5中的“Calculate Interaction Energy protocol”模塊進(jìn)行計(jì)算，在此，調(diào)用了經(jīng)典的CHARMm力場進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果由表5可知，在ACE的C-domain與VW、IW分別相互作用過程中，Ala354、Ser355、His383、Glu384、Lys511、Phe512和His513的總電勢能對體系貢獻(xiàn)較大。對VW-C-domain結(jié)合體系分析，靜電力（－113.20 kJ/mol）比范德華力（－5.77 kJ/mol）對體系穩(wěn)定起更大作用，特別是His513、Lys511、Ala354、His383和Glu384這些殘基與VW之間的靜電力起主導(dǎo)作用，分別為－12.64、－12.97、－16.50、－17.94 kJ/mol和－54.99 kJ/mol；His353和Ser355這兩個(gè)殘基對范德華力起主導(dǎo)作用（－3.31 kJ/mol和－3.73 kJ/mol）。

在IW與C-domain的相互作用中，靜電力同樣較范德華力起主導(dǎo)作用，Ala354、His383、Glu384和His513靜電力相對更低，特別是 Glu384與IW的靜電力能量負(fù)值最大（－48.21 kJ/mol），可能是因?yàn)榕cC-domain存在氫鍵作用。Tyr523表現(xiàn)出有利的范德華作用貢獻(xiàn)（－9.24 kJ/mol）。有研究證明[24]，若抑制劑能與Glu384以氫鍵結(jié)合，可抑制ACE與Zn2＋的結(jié)合，并使其失去血壓升高的能力，因此抑制劑與Glu384之間形成氫鍵作用至關(guān)重要。通過對C-domain活性位點(diǎn)周圍殘基的相互作用能計(jì)算及上述對接模式、氫鍵數(shù)目和強(qiáng)度等綜合分析，可知Ala354、Ala356、His383、Glu384、Lys511、Phe512、His513和Tyr523對復(fù)合物的穩(wěn)定性影響較大，其中Ala354、His383、Glu384和His513作為C-domain活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基對復(fù)合物的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)最大。

表 6 VW、IW與N-domain活性位點(diǎn)氨基酸殘基間的相互作用能Table 6 Electrostatic energy, van der Waals energy and total potential energy between the best poses of bioactive peptides obtained from docking results and the N-domain

同理，VW、IW與ACE的N-domain相互作用能情況如表6所示。對于VW-N-domain結(jié)合體系，His331、Ala332、Ser333、Glu362、Phe490、His491、Tyr496、 Tyr498和Tyr501總電勢能對體系貢獻(xiàn)較大。其中Tyr496、Glu362、Tyr501、Tyr498、 Ala332和His491表現(xiàn)出十分有利的靜電力貢獻(xiàn)（－16.01、－14.29、－13.59、－10.84、－8.95 kJ/mol和－8.47 kJ/mol）。這與2.1.2節(jié)中預(yù)測的結(jié)合模式基本一致，Tyr496和Tyr501都與VW之間存在著氫健相互作用。另外，從表6可以看出Phe490和 Phe505具有較為有利的范德華力貢獻(xiàn)。在IW與N-domain的活性位點(diǎn)附近氨基酸殘基相互作用中，靜電力所起作用比范德華力大，Ala332、Asp393、Glu362和Lys489表現(xiàn)出明顯的靜電力作用（－12.32、－13.27、－25.04 kJ/mol和－33.25 kJ/mol）。通過對N-domain活性位點(diǎn)周圍殘基的能量分解值計(jì)算及上述對接模式、氫鍵數(shù)目和強(qiáng)度等綜合分析，可知His331、Ala332、Ser333、Glu362、Asp393、Lys489、Phe490、 Tyr496、Tyr498和Tyr501對結(jié)合體系穩(wěn)定性有較大影響，特別是Ala332、Glu362、Lys489、Tyr496和Tyr501作為N-domain活性位點(diǎn)關(guān)鍵殘基對復(fù)合物的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)最大。

表 7 IW、VW與兩個(gè)結(jié)構(gòu)域通過對接形成的最佳構(gòu)象的結(jié)合能Table 7 Binding energy values of the best conf i gurations in IW and VW obtained by molecular docking at the two ACE domains

對比肽分別與兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基間的相互作用能可知，C-domain存在較多靜電貢獻(xiàn)大的殘基，且靜電作用強(qiáng)度比N-domain大得多。N-domain殘基范德華作用強(qiáng)度相對較大。一般來說，衡量一組配體和受體結(jié)合強(qiáng)弱可以通過結(jié)合能這一參數(shù)，對接預(yù)測結(jié)合能量越低，則表明活性肽與ACE間的結(jié)合越緊密[30]。利用DS2.5的“calculate binding energy”得到VW-C-domain和VW-N-domain的結(jié)合能分別為－248.83 kJ/mol和－135.83 kJ/mol，IW-C-domain和IW-N-domain的結(jié)合能分別為－221.44 kJ/mol和－160.13 kJ/mol（表7），由此說明VW、IW對C-domain的結(jié)合力更強(qiáng)，因此兩種肽均具有較好的C-domain選擇性抑制活性。另一方面，從VW與兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能相對比較值來看，也高于IW，說明VW比IW具有更好的結(jié)構(gòu)域選擇性抑制，這一分析結(jié)果與Lunow等[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是一致的。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)將兩個(gè)ACE C-domain選擇性抑制肽IW、VW分別與sACE的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)?，通過對對接結(jié)果的分析， IW、VW與C-domain、N-domain的結(jié)合具有相似的分子作用機(jī)制。不同的是，在氫鍵、疏水相互作用上IW、VW與C-domain結(jié)合作用明顯強(qiáng)于N-domain，且IW、VW與C-domain的Zn2＋產(chǎn)生靜電相互作用，在N-domain上無該作用力。通過結(jié)合體系的相互作用方式以及氨基酸殘基的能量分解值可知，對C-domain活性起重要作用的殘基包括Ala354、His383、Glu384和His513；對N-domain活性起重要作用的殘基為Ala332、Glu362、Lys489、Tyr496和Tyr501。另外，通過比較復(fù)合體系的結(jié)合能，印證了IW、VW具有較好的C-domain選擇性抑制作用，且VW的選擇性抑制作用強(qiáng)于IW。以上研究可部分揭示ACE C-domain選擇性抑制肽的作用機(jī)制，給出選擇性抑制肽與ACE相互作用的直接證據(jù)，對進(jìn)一步認(rèn)識C-domain選擇性抑制肽與ACE的結(jié)合原理有一定的理論指導(dǎo)意義，對于以ACE C-domain為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。

[1] LARAGH J H, BAER L, BRUNNER H R, et al. Renin, angiotensin and aldosterone system in pathogenesis and management of hypertensive vascular disease[J]. The American Journal of Medicine, 1972, 52(5): 633-652. DOI:10.1016/0002-9343(72)90054-X.

[2] ROKS A, BUIKEMA H, PINTO Y M, et al. The renin-angiotensin system and vascular function. the role of angiotensin II, angiotensinconverting enzyme, and alternative conversion of angiotensin I[J]. Heart and Vessels, 1997(Suppl 12): 119-124.

[3] AKIF M, SCHWAGER S L, ANTHONY C S, et al. Novel mechanism of inhibition of human angiotensin-I-converting enzyme (ACE) by a highly specific phosphinic tripeptide[J]. Biochemical Journal, 2011, 436(1): 53-59. DOI:10.1042/BJ20102123.

[4] MASUYER G, YATES C J, STURROCK E D, et al. Angiotensin-I converting enzyme (ACE): structure, biological roles, and molecular basis for chloride ion dependence[J]. Biological Chemistry, 2014, 395(10): 1135-1149. DOI:10.1515/hsz-2014-0157.

[5] ACHARYA K R, STURROCK E D, RIORDAN J F, et al. ACE revisited: a new target for structure-based drug design[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2003, 2(11): 891-902. DOI:10.1038/ nrd1227.

[6] BERNSTEIN K E, SHEN X Z, GONZALEZ-VILLALOBOS R A, et al. Different in vivo functions of the two catalytic domains of angiotensin-converting enzyme (ACE)[J]. Current Opinion in Pharmacology, 2011, 11(2): 105-111. DOI:10.1016/j.coph.2010.11.001.

[7] WEI L, ALHENC-GELAS F, CORVOL P, et al. The two homologous domains of human angiotensin I-converting enzyme are both catalytically active[J]. Journal of Biological Chemistry, 1991, 266(14): 9002-9008.

[8] GEORGIADIS D, BEAU F, CZARNY B, et al. Roles of the two active sites of somatic angiotensin-converting enzyme in the cleavage of angiotensin I and bradykinin insights from selective inhibitors[J]. Circulation Research, 2003, 93(2): 148-154. DOI:10.1161/01. RES.0000081593.33848.FC.

[9] BEZALEL S, MAHLAB-GURI K, ASHER I, et al. Angiotensinconverting enzyme inhibitor-induced angioedema[J]. The American Journal of Medicine, 2015, 128(2): 120-125.

[10] van ESCH J H M, TOM B, DIVE V, et al. Selective angiotensinconverting enzyme C-domain inhibition is sufficient to prevent angiotensin I-induced vasoconstriction[J]. Hypertension, 2005, 45(1): 120-125. DOI:10.1161/01.HYP.0000151323.93372.f5.

[11] 趙鈺嵐, 許傳蓮. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的結(jié)構(gòu)功能及相關(guān)抑制劑[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 2008, 24(2): 171-176. DOI:10.13345/ j.cjb.2008.02.027.

[12] LUNOW D, KAISER S, RUCKRIEMEN J, et al. Tryptophancontaining dipeptides are C-domain selective inhibitors of angiotensin converting enzyme[J]. Food Chemistry, 2015, 166: 596-602. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.06.059.

[13] LUNOW D, KAISER S, BRUCKNER S, et al. Selective release of ACE-inhibiting tryptophan-containing dipeptides from food proteins by enzymatic hydrolysis[J]. European Food Research and Technology, 2013, 237(1): 27-37. DOI:10.1007/s00217-013-2014-x.

[14] LI Guanhong, LE Guowei, SHI Yonghui, et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects[J]. Nutrition Research, 2004, 24(7): 469-486. DOI:10.1016/j.nutres.2003.10.014.

[15] NATESH R, SCHWAGER S L U, STURROCK E D, et al. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex[J]. Nature, 2003, 421: 551-554. DOI:10.1038/nature01370.

[16] PAN Daodong, GUO Huiqing, ZHAO Bo, et al. The molecular mechanisms of interactions between bioactive peptides and angiotensin-converting enzyme[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2011, 21(13): 3898-3904. DOI:10.1016/j.bmcl.2011.05.033.

[17] PAN Daodong, CAO Jinxuan, GUO Huiqing, et al. Studies on purif i cation?and?the?molecular?mechanism?of?a?novel?ACE?inhibitory?peptide from whey protein hydrolysate[J]. Food Chemistry, 2012, 130(1): 121-126. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.07.011.

[18] 周敏. 小分子肽抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的分子動力學(xué)模擬研究[D].北京: 北京化工大學(xué), 2011: 17.

[19] 王偉, 沈生榮, 馮鳳琴. 基于藥效團(tuán)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的結(jié)構(gòu)優(yōu)化[J]. 中國科學(xué), 2008, 38(4): 357-364. DOI:10.3321/ j.issn:1006-9240.2008.04.012

[20] 朱志遠(yuǎn), 張燕, 李征, 等. 受體蛋白與藥物分子對接的研究進(jìn)展[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2009, 14(11): 1308-1313.

[21] HE R, ALUKO R E, JU X G. Evaluating molecular mechanism of hypotensive peptides interactions with renin and angiotensin converting enzyme[J]. PLoS ONE, 2014, 9(3): e91051. DOI:10.1371/ journal.pone.0091051.

[22] LI Peng, JIA Jia, FANG Ming, et al. In vitro and in vivo ACE inhibitory of?pistachio?hydrolysates?and?in?silico?mechanism?of?identif i ed?peptide?binding with ACE[J]. Process Biochemistry, 2014, 49(5): 898-904. DOI:10.1016/j.procbio.2014.02.007.

[23] NCHINDA A T, CHIBALE K, REDELINGHUYS P, et al. Synthesis and molecular modeling of a lisinopril-tryptophan analogue inhibitor of angiotensin I-converting enzyme[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2006, 16(17): 4616-4619. DOI:10.1016/ j.bmcl.2006.06.004.

[24] CORRADI H R, SCHWAGER S L U, NCHINDA A T, et al. Crystal structure of the N domain of human somatic angiotensin I-converting enzyme provides a structural basis for domain-specific inhibitor design[J]. Journal of Molecular Biology, 2006, 357(3): 964-974. DOI:10.1016/j.jmb.2006.01.048.

[25] GUAN Shanshan, HAN Werwei, ZHANG Hao, et al. Insight into the interactive residues between two domains of human somatic angiotensin-converting enzyme and Angiotensin II by MM-PBSA calculation and steered molecular dynamics simulation[J]. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 2016, 34(1): 15-28. DOI:10.10 80/07391102.2015.1007167.

[26] MONTES M, MITEVA M A, VILLOUTREIX B O. Structurebased virtual ligand screening with LigandFit: pose prediction and enrichment of compound collections[J]. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 2007, 68(3): 712-725. DOI:10.1002/prot.21405.

[27] TAHA M O, ALDAMEN M A. Effects of variable docking conditions and scoring functions on corresponding protein-aligned comparative molecular field analysis models constructed from diverse human protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48(25): 8016-8034. DOI:10.1021/jm058047o.

[28] LABERGE M, KOVESI I, YONETANI T, et al. R-state hemoglobin bound to heterotropic effectors: models of the DPG, IHP and RSR13 binding sites[J]. FEBS Letters, 2005, 579(3): 627-632. DOI:10.1016/ j.febslet.2004.12.033.

[29] WU J P, ALUKO R E, NAKAI S. Structural requirements of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides: quantitative structure-activity relationship study of di-and tripeptides[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(3): 732-738. DOI:10.1021/jf051263l.

[30] 管驍, 劉靜, 蘇淅娜. ACE 抑制三肽與ACE相互作用的分子機(jī)制[J]. 分析測試學(xué)報(bào), 2014, 33(10): 1116-1122. DOI:10.3969/ j.issn.1004 -4957.2014.10.004 .

Binding Modes between C-Domain Selective Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Dipeptides and ACE Domains

GUAN Xiao1, HONG Yanhan1, LIU Jing2, LI Jingjun3, SUN Zhu4, HAN Fei5
(1. School of Medical Instruments and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. College of Information Technology, Shanghai Maritime University, Shanghai 201306, China; 3. Jiangsu Longevity Group Co. Ltd., Wuxi 226500, China; 4. Inner Mongolia Yangufang Group Co. Ltd., Hohhot 201106, China; 5. Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037, China)

The C-domain selective angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory activities of food-derived dipeptides, including?Ile-Trp?(IW)?and?Val-Trp?(VW),?were?recently?verif i ed?by?experiments.?However,?their?interaction?modes?with?the?C-domain?and?N-domain?of?ACE?and?the?molecular?mechanism?remain?unclear.?In?the?present?study,?f l exible?molecule?docking technology was used to elucidate the active sites, interaction energy and intermolecular force types between the peptides and ACE. The results demonstrated that hydrogen bond, hydrophilic, hydrophobic and electrostatic interactions, and coordinate bond existed between the active pockets of the C-domain and IW and VW. The interaction of the N-domain with the peptides was similar to that of the C-domain, which had fewer hydrogen bonds and no electrostatic interactions. By calculating the binding energy difference between the two domains, we could seek the theoretical support for the different inhibitory potency of IW and VW. The above information will be helpful for the development of C-domain selective ACE inhibitory peptides.

ACE;?C-domain?selective?inhibitory?peptides;?f l exible?docking;?interaction?mode

10.7506/spkx1002-6630-201705026

O629.7

A

1002-6630（2017）05-0160-07

管驍, 洪延涵, 劉靜, 等. ACE C-結(jié)構(gòu)域選擇性抑制二肽與ACE結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 160-166.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705026. http://www.spkx.net.cn

GUAN Xiao, HONG Yanhan, LIU Jing, et al. Binding modes between C-domain selective angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory dipeptides and ACE domains[J]. Food Science, 2017, 38(5): 160-166. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705026. http://www.spkx.net.cn

2016-07-01

上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14ZR1419200）

管驍（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭δ芘c營養(yǎng)。E-mail：gnxo@163.com