煙熏鰹魚粉復(fù)合酶解過程中的品質(zhì)變化

顧賽麒，彭玲玲，丁玉庭，高 瑩，趙丹丹，周緒霞

（浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014）

煙熏鰹魚粉復(fù)合酶解過程中的品質(zhì)變化

顧賽麒，彭玲玲，丁玉庭，高 瑩，趙丹丹，周緒霞*

（浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014）

采用優(yōu)化后的酶解工藝（胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶活力配比2∶1、總加酶量3 000 U/g），對煙熏鰹魚加工副產(chǎn)物“煙熏鰹魚粉”進(jìn)行雙酶水解，并對酶解液品質(zhì)變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明：0～30 h內(nèi)水解度不斷增大，酶解液感官評分10 h內(nèi)較高，10 h后急劇下降，揮發(fā)性鹽基氮含量10 h內(nèi)緩慢增加，后急速增加；可溶性氮指數(shù)20 h內(nèi)呈不斷上升趨勢，之后增幅不大；整個酶解過程中，游離氨基酸含量始終呈上升趨勢，20 h后增速變緩，谷氨酸對酶解液整體滋味輪廓貢獻(xiàn)最為顯著，其滋味活性值較高。酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味成分以酚類和醛類為主，兩者相對含量均隨酶解時間延長而不斷降低，醛類具有較高的相對氣味活性值，對酶解液煙熏風(fēng)味具有顯著貢獻(xiàn)。本研究結(jié)果可指導(dǎo)制備高風(fēng)味品質(zhì)的煙熏鰹魚粉酶解液，可為相關(guān)企業(yè)進(jìn)一步研發(fā)海鮮調(diào)味制品提供理論參考。

煙熏鰹魚粉；復(fù)合酶解；感官評價；游離氨基酸；揮發(fā)性風(fēng)味物；品質(zhì)變化

煙熏鰹魚也稱木魚或柴魚（Katsuwonus pelamis），柴魚營養(yǎng)價值高，具有水產(chǎn)品的鮮味和特殊的煙熏風(fēng)味[1]，一般需進(jìn)一步加工成鰹魚花片后食用。柴魚在其熏制加工過程中會產(chǎn)生較多次品，且柴魚加工成花片時可產(chǎn)生大量碎屑，造成了資源的極大浪費，如何有效利用煙熏鰹魚加工副產(chǎn)物、進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)附加值，對促進(jìn)整個鰹魚加工業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

目前，已有一些有關(guān)金槍魚下腳料蛋白酶水解工藝的報道，為金槍魚下腳料的開發(fā)利用提供了一定的理論參考，但其研究對象多以生鮮原料為主。丁偉璐[2]、張華丹[3]等分別以金槍魚暗色肉加工下腳料為原料，采用胰酶水解技術(shù)和雙酶法提油及破乳工藝，制備功能性魚蛋白制品，溶解性較好，可作為調(diào)味品或蛋白質(zhì)營養(yǎng)劑。而煙熏鰹魚粉與生鮮原料相比，酶解液呈味物質(zhì)含量更加豐富、煙熏風(fēng)味特征突出，但目前鮮見相關(guān)報道。本研究擬優(yōu)化煙熏鰹魚粉復(fù)合酶解配方，基于感官評分、氮溶解指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）、揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）指標(biāo)評價其酶解產(chǎn)物的品質(zhì)特性及食用安全性，探討不同酶解階段游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AA）組成及風(fēng)味成分變化規(guī)律，旨在獲得良好風(fēng)味品質(zhì)的酶解液，為相關(guān)企業(yè)研發(fā)海鮮調(diào)味制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙熏鰹魚粉 寧波三英食品有限公司；胰蛋白酶（1 000 U/mg）、木瓜蛋白酶（1 000 U/mg） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；風(fēng)味蛋白酶（15 U/mg）江蘇銳陽生物科技有限公司；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸、磺基水楊酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR21GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司；433D型氨基酸自動分析儀 德國Sykam公司；1525高效液相色譜儀 美國Waters公司；7890A氣相色譜串接質(zhì)譜儀 美國安捷倫科技有限公司；手動進(jìn)樣手柄、75 μm CAR/ PDMS萃取頭 美國Supelco公司；海能K9840自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 煙熏鰹魚粉酶解液的制備

表 1 復(fù)配酶的種類和添加量Table 1 Dosages and types of protease for combined use

實驗共設(shè)計A、B、C 3 組不同配方的復(fù)合蛋白酶[4]對煙熏鰹魚粉進(jìn)行酶解（表1），其工藝如下：取適量煙熏鰹魚粉→加入去離子水調(diào)節(jié)料液比至1∶3→充分?jǐn)噭颉肗a2CO3調(diào)節(jié)pH值至7.5→分3 組各自加入不同配方的復(fù)合蛋白酶（底物初始質(zhì)量分?jǐn)?shù)均控制在25%）→50 ℃條件下酶解30 h→獲得煙熏鰹魚粉酶解液。酶解過程中每隔5 h取一次樣，沸水浴10 min滅酶后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3.2 蛋白質(zhì)水解度的測定

氨基態(tài)氮含量和總氮含量分別參照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中的甲醛滴定法和GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測定。水解度（degree of hydrolysis，DH）的計算見式（1）：

1.3.3 感官評定

參照鄭捷等[5]的方法，召集10 名感官評價員對煙熏鰹魚粉酶解液進(jìn)行感官評定，分別從氣味與滋味兩方面進(jìn)行打分，加權(quán)平均后確定最終感官評分S，計算公式為：S＝（0.8ΣGi＋0.2ΣTi）/10，式中：Gi和Ti分別為第i位評判員對樣品氣味和滋味的感官評分分值，評分標(biāo)準(zhǔn)詳見表2。

表 2 煙熏鰹魚粉酶解液的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation of smoked skipjack tuna hydrolysates

1.3.4 NSI的測定

參照Thiansilakul等[6]的方法，酶解液中NSI計算見公式（2）：

其中水溶性氮和總氮含量參照GB 5009.5—2010中的凱氏定氮法進(jìn)行測定。

1.3.5 TVB-N含量測定

TVB-N含量的測定參照SC/T 3032—2007《水產(chǎn)品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》的方法并稍作修改：稱取5 g樣品，加入0.6 mol/L高氯酸45 mL混合均勻，用濾紙過濾，濾液以半自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定。

1.3.6 FAA含量測定

精確稱取2 mL樣品于試管中，加入18 mL 30 g/L的5-磺基水楊酸溶液混合均勻，于4 ℃條件下靜置2 h以沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃條件下高速離心10 min（8 000 r/min）后取上清液，以4 mol/L NaOH調(diào)整濾液pH值至6.0，并定容至50 mL。將定容后濾液過0.22 μm水系膜并裝瓶上機(jī)，用433D型氨基酸自動分析儀測定樣品中FAA組成。不同呈味物質(zhì)對酶解液整體滋味輪廓的貢獻(xiàn)大小采用呈味強(qiáng)度值（taste activity value，TAV）法進(jìn)行判定，TAV是呈味物質(zhì)在樣品中的含量與其對應(yīng)呈味閾值的比值[7]，TAV大于1時，該物質(zhì)對樣品的整體滋味輪廓有著顯著影響。

1.3.7 揮發(fā)性風(fēng)味成分測定

將3 g煙熏鰹魚粉酶解液置于15 mL頂空瓶中，以75 μm CAR/PDMS萃取頭于80 ℃條件下頂空萃取30 min，萃取完畢后拔出萃取頭插入氣相色譜進(jìn)樣口熱解析進(jìn)樣。

氣相色譜條件：DB-5毛細(xì)管柱（J&W氣相色譜柱，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：柱初溫40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；再以25 ℃/min升至240 ℃，保持14 min；解析時間3 min；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為99.999%高純氦氣，流量1.0 mL/min；不分流模式進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度240 ℃；離子源溫度240 ℃；掃描范圍35～500 m/z；電離電壓70 eV。揮發(fā)性成分通過NIST 2008和Wiley譜庫進(jìn)行定性，僅報道正反匹配度均大于800（最大值為1 000）的結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 19.0軟件和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，以單因素方差分析法（one way ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，基于相對氣味活性值（relative odor activity value，ROAV）法確定煙熏鰹魚酶解液的主體揮發(fā)性風(fēng)味成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶酶解對煙熏鰹魚粉酶解效果的影響

圖 1 煙熏鰹魚粉酶解液水解度隨時間的變化Fig. 1 Effect of hydrolysis time on DH of smoked skipjack tuna hydrolysates

由圖1可知，在30 h的水解過程中，3 組酶解液的水解度均呈不斷上升趨勢。在30 h時水解度最高的為A組，B、C兩組水解度值沒有顯著性差異（P＞0.05），這可能是因為隨著酶解時間的延長幾種酶之間發(fā)生一定程度的相互酶解，從而降低了底物的水解程度。感官評價表明A組蛋白酶效果最佳。因此，從水解效果和產(chǎn)業(yè)化經(jīng)濟(jì)角度分析，考慮選用A組蛋白酶的復(fù)合酶配比。

2.2 酶解過程中鰹魚酶解液品質(zhì)及酶解產(chǎn)物特性分析

圖 2 煙熏鰹魚粉酶解產(chǎn)物隨時間的變化Fig. 2 Effect of hydrolysis time on sensory scores, NSI and TVB-N values of smoked skipjack tuna hydrolysates

由圖2A可知，酶解10 h前感官評分逐漸增大，10 h后感官評分急劇下降，尤其是在20 h以后，酶解液均出現(xiàn)了不愉悅的氨臭味，可能是由于：1）在長時間酶解過程中微生物污染，發(fā)生蛋白質(zhì)酸敗，生成的氨基酸發(fā)生脫氨基或脫羧基作用而被破壞，生成游離氨或堿性胺類物質(zhì)；2）產(chǎn)生胺類、低級脂肪酸及硫化物，出現(xiàn)腐敗臭、刺激臭。張應(yīng)年[8]、Beatty[9]等就從鱈魚肌肉腐敗過程中發(fā)現(xiàn)氨臭味的產(chǎn)生與碳水化合物、蛋白質(zhì)和氨基酸的分解有關(guān)。

通過NSI分析酶解過程中蛋白溶解情況，由圖2B可知，酶解過程會促進(jìn)蛋白溶解，使得NSI不斷升高，這與蔣清君等[10]對花生蛋白酶解液研究中酶解時間對NSI的變化影響的趨勢相一致。NSI在酶解20 h 達(dá)到44.21%，而后趨于平緩。從水解液的形態(tài)來說，20 h以后酶解液呈糊狀而不是明顯的固液分層，可見已有較良好的蛋白溶解度，但是相比其他研究[11-12]中的NSI仍然偏低，這可能是由于煙熏鰹魚粉特殊的粉末狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致顆粒內(nèi)部蛋白無法得到良好的溶解。

煙熏鰹魚粉酶解過程中TVB-N含量的變化如圖2C所示。酶解液中TVB-N含量隨酶解時間的延長不斷上升，在10 h后上升趨勢更快。TVB-N是蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，其含量的增多表明氨基酸破壞嚴(yán)重，特別是蛋氨酸和酪氨酸。結(jié)合上述感官評價中氨臭等氣味的產(chǎn)生，可以進(jìn)一步說明10 h以后酶解液品質(zhì)發(fā)生了不良的變化。故煙熏鰹魚粉酶解時間需控制在10 h以內(nèi)。

2.3 酶解液中FAA組成與釋放規(guī)律分析

表 3 煙熏鰹魚粉酶解產(chǎn)物中FAA組成Table 3 FAA composition of smoked skipjack tuna hydrolysates

煙熏鰹魚粉酶解過程會釋放大量FAA，對酶解液的營養(yǎng)及滋味起到一定貢獻(xiàn)，也可為Maillard反應(yīng)制備熱反應(yīng)型肉味香精提供底物[13]。酶解過程中FAA的釋放規(guī)律及TAV分析結(jié)果見表3。酶解初期FAA含量增加較快，20 h以后FAA含量增加趨于緩慢，這可能由于酶解作用趨于平衡或是部分氨基酸發(fā)生了進(jìn)一步的反應(yīng)作用導(dǎo)致。鮮味氨基酸含量隨酶解時間延長不斷增加，甜味氨基酸呈先增大后減小的趨勢，總體在酶解15 h時達(dá)到最大值，苦味氨基酸整體上也呈先增大后減少趨勢，相比于酶解前，酶解后苦味氨基酸含量占的比例最大，但是由于其閾值較大，所以對苦味貢獻(xiàn)并不明顯，這與趙謀明等[14]對海產(chǎn)低值魚酶解的研究結(jié)果相似，Lioe等[15]研究發(fā)現(xiàn)低于呈味閾值的苦味氨基酸，可增強(qiáng)其他氨基酸的鮮味和甜味。

TAV值越大，呈味作用越顯著，對滋味的貢獻(xiàn)越大。TAV值大于1的氨基酸有谷氨酸、組氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、丙氨酸與苯丙氨酸，其中鮮味氨基酸總TAV值隨著酶解時間的延長增加明顯，這些氨基酸對酶解液的鮮味、甜味及苦味呈現(xiàn)了一定作用，且可能對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的生成有重要貢獻(xiàn)。

2.4 酶解過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成變化規(guī)律及ROAV值分析

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是分析煙熏鰹魚粉酶解液中品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。酶解過程中酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成、相對含量以及ROAV值的變化如表4所示。可以看出，有70 余種揮發(fā)性成分被檢測出，其中，未酶解組主要成分為酚類，相對含量為66.81%。與未酶解組相比，酶解10 h時酚類和醛類相對含量均少量下降，而芳香類、烴類、呋喃類以及含N類物質(zhì)相對含量均增加。隨著酶解時間的延長，酶解30 h時，酶解液主要風(fēng)味成分是酚類，但相對含量下降到34.31%，烴類、酸類、酮類、芳香類與含S類物質(zhì)相對含量上升，其他物質(zhì)相對含量均下降。在酶解各個時間段中，愈創(chuàng)木酚相對氣味活性值最大，因此對煙熏風(fēng)味貢獻(xiàn)最明顯。隨著酶解時間的延長，酚類、芳香類、酮類、酸類以及含S類ROAV值均增加，醛類、烴類與醇類ROAV值減小，以下就其來源及產(chǎn)生途徑做一簡要探討。

在煙熏鰹魚粉酶解液中，酚類對煙熏風(fēng)味貢獻(xiàn)最大[16]，是煙熏制品的典型風(fēng)味成分，王宏海等[17]發(fā)現(xiàn)魷魚在煙熏后酚類含量和種類迅速增加，并且酚類是主要呈味物質(zhì)。酶解液中，對甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、甲氧甲酚、2-甲氧基-4-丙基苯酚主要是煙熏中木材熏煙成分向魚體轉(zhuǎn)移形成的[18]。酚類化合物通常閾值很低，例如愈創(chuàng)木酚閾值僅有0.84 ng/g[19]，具有木香、辛香、肉香和煙熏味，酶解液中這類成分含量達(dá)10%，是一種作為食用煙熏香精的物質(zhì)。

醛、酮類這些物質(zhì)閾值較低，對酶解液風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)較大。其中如辛醛，主要來源于油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸的分解，其閾值較低[20]，是鰹魚的特征風(fēng)味物質(zhì)。苯甲醛是由氨基酸的Strecker反應(yīng)生成的，具有杏仁香、堅果香和水果香[21]。鄭捷等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與煙熏前相比，煙熏過程中羰基化合物含量增加，其來源可能是醇的氧化產(chǎn)物，也可能是酯類分解的主要產(chǎn)物。值得注意的是，很多含有醛類物質(zhì)的官能團(tuán)可以加強(qiáng)煙熏風(fēng)味魚中酚類化合物的優(yōu)勢[23]。

烴類化合物大體上可分為兩類：烷烴類和芳香烴類，其來源比較復(fù)雜，部分有香味的烴可能來自于脂質(zhì)熱降解產(chǎn)物，也可能由烷基自由基的脂質(zhì)氧化或類胡蘿卜素的分解過程生成[21]。烷烴類物質(zhì)通常具有較高的閾值，對產(chǎn)品的總體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大，但一些含苯環(huán)的芳香烴類化合物往往閾值較低，可對樣品總體風(fēng)味造成一定的影響，如檸檬烯具有令人愉快的、新鮮橙的甜味[24]。隨著酶解時間的延長聯(lián)苯含量上升，可能是酶解過程中產(chǎn)生的，而其中存在的萘及1-甲基萘等萘類可能是從環(huán)境污染物轉(zhuǎn)移到酶解液中[25]。不飽和醇由于閾值較低，對魚類風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[26]，如1-辛烯-3-醇，其閾值為1.5 ng/g，具有類似蘑菇、泥土氣味的魚腥味物質(zhì)，飽和醇閾值較高，一般對風(fēng)味貢獻(xiàn)較低[27]；此外，酯類、含N、含S及雜環(huán)化合物主要來源于煙熏過程中的Maillard反應(yīng)、氨基酸和硫胺素的降解[28]。隨著酶解的進(jìn)行，煙熏特征風(fēng)味物質(zhì)相對含量降低，而相繼產(chǎn)生一些不愉悅的物質(zhì)，如二硫化二甲基，具有不愉悅惡臭的氣味，進(jìn)而極大程度影響了酶解液的品質(zhì)。故由揮發(fā)性風(fēng)味特征這一指標(biāo)來看，酶解時間不宜過長，需控制在10 h左右。

表 4 煙熏鰹魚粉酶解過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化Table 4 Changes in volatile components of smoked skipjack tuna hydrolysates

續(xù)表4

續(xù)表4

注：N.D.未檢出；—.無法得到相關(guān)數(shù)據(jù)。

3 結(jié) 論

煙熏鰹魚粉酶解時酶的選擇對于酶解效果以及感官品質(zhì)有很重要的影響，本研究優(yōu)化了胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解配方，發(fā)現(xiàn)煙熏鰹魚粉水解度在30 h內(nèi)呈不斷上升趨勢；酶解液感官評分10 h內(nèi)較高；NSI 20 h內(nèi)不斷增大，20 h后增幅不大；TVB-N含量10 h內(nèi)增長趨勢緩慢，10 h后急劇增加；FAA含量始終增大，20 h后緩慢增加。谷氨酸TAV值較高，對酶解液整體滋味貢獻(xiàn)最為顯著，酶解液中揮發(fā)性風(fēng)味成分以酚類和醛類為主，醛類具有較高的ROAV值，對酶解液煙熏風(fēng)味有顯著貢獻(xiàn)。結(jié)合酶解液風(fēng)味及品質(zhì)指標(biāo)，煙熏鰹魚粉酶解時間建議控制在10 h內(nèi)為宜。

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Quality Changes of Smoked Skipjack Tuna (Katsuwonus pelamis) Processing Byproduct during Enzymatic Hydrolysis

GU Saiqi, PENG Lingling, DING Yuting, GAO Ying, ZHAO Dandan, ZHOU Xuxia*
(College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Quality changes of smoked skipjack tuna processing byproduct during enzymatic hydrolysis under optimized conditions?(trypsin?to? fl avourzyme?activity,?2:1;?and?total?enzyme?dosage,?3?000?U/g) were analyzed. The results showed that the degree of hydrolysis (DH) kept increasing during 30 h hydrolysis. Sensory evaluation showed that the hydrolysates had a favorable sensory score within 10 h, and then began to fall sharply. The content of TVB-N increased slowly during the? fi rst?10?h?and?then?increased?sharply.?The?nitrogen?solubility?index?kept?rising?during?the? fi rst?20?h?and?then?increased?slightly. Free amino acid content gradually increased during the entire hydrolysis process, but increased slower from 20 h onwards. Glutamic acid, giving a relatively higher TAV value and umami taste, contributed most to the overall taste of the hydrolysates.?Although?they?continuously?decreased?as?the?reaction?time?extended,?phenols?and?aldehydes?made?signi fi cant?contribution?to?the? fl avor?of?the?hydrolysates,?especially?the?latter,?which?had?a?higher?relative?odor?activity?value?(ROAV).?The results of the present study is useful for the preparation of high-quality smoked skipjack tuna hydrolysate with good fl avor,?and?could?also?provide?a?theoretical?basis?for?further?development?of?related?seafood?seasoning?products.

smoked?skipjack?tuna;?mixed?enzyme?hydrolysis;?sensory?evaluation;?free?amino?acid;?volatile? fl avor;?quality?variation

10.7506/spkx1002-6630-201705029

TS201.2

A

1002-6630（2017）05-0180-06

顧賽麒, 彭玲玲, 丁玉庭, 等. 煙熏鰹魚粉復(fù)合酶解過程中的品質(zhì)變化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 180-185. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705029. http://www.spkx.net.cn

GU Saiqi, PENG Lingling, DING Yuting, et al. Quality changes of smoked skipjack tuna (Katsuwonus pelamis) processing byproduct during enzymatic hydrolysis[J]. Food Science, 2017, 38(5): 180-185. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705029. http://www.spkx.net.cn

2016-04-12

浙江省科技廳重點研發(fā)計劃項目（2015C02033）；浙江省公益性技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項目（2016C32056）

顧賽麒（1984—），男，講師，博士，研究方向為水產(chǎn)品風(fēng)味化學(xué)。E-mail：gusaiqi@126.com

*通信作者：周緒霞（1980—），女，副教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工。E-mail：xzhou@zjut.edu.cn