PDGFRA在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

陸 玲， 黃志衛(wèi)

(1.廣西壯族自治區(qū)北海市結(jié)核病防治院呼吸內(nèi)科， 廣西 北海 536000 2.廣西壯族自治區(qū)欽州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 廣西 欽州 535000)

PDGFRA在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

陸 玲1， 黃志衛(wèi)2

(1.廣西壯族自治區(qū)北海市結(jié)核病防治院呼吸內(nèi)科， 廣西 北海 536000 2.廣西壯族自治區(qū)欽州市第一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科， 廣西 欽州 535000)

目的：明確血小板源性生長(zhǎng)因子受體A(platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法：在8種肺癌細(xì)胞系以及正常肺細(xì)胞HBE中通過RT-PCR方法檢測(cè)PDGFRA的基本表達(dá)水平，分別選取PDGFRA表達(dá)高的兩組肺癌細(xì)胞系(A549)通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定knock down和過表達(dá)PDGFRA細(xì)胞系，再進(jìn)一步通過MTS，劃痕實(shí)驗(yàn)，transwell實(shí)驗(yàn)以及western-blot實(shí)驗(yàn)明確PDGFRA對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，過表達(dá)PDGFRA后，細(xì)胞增殖以及侵襲能力顯著增加，同時(shí)與侵襲能力相關(guān)的細(xì)胞黏附分子E-cadherin和細(xì)胞骨架蛋白Vimentin表達(dá)上調(diào)，劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PDGFRA能夠促進(jìn)細(xì)胞侵襲能力。在knock down PDGFRA細(xì)胞系中，細(xì)胞增值能力降低，細(xì)胞黏附分子E-cadherin和細(xì)胞骨架蛋白Vimentin表達(dá)下調(diào)，與對(duì)照組相比，細(xì)胞侵襲能力下降。結(jié)論：PDGFRA能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖并有助于肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

血小板源性生長(zhǎng)因子受體α； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞侵襲； 肺癌細(xì)胞

在各類惡性腫瘤中，肺癌是的發(fā)病率和死亡率居于第一[1]。肺癌患者的預(yù)后較差，其發(fā)生機(jī)制尚不明確。血小板源性生長(zhǎng)因子受體α多肽(platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)是一種生長(zhǎng)因子受體，是胃腸道間質(zhì)瘤的重要參考指標(biāo)[2]。研究表明，PDGFRA可表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，且與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在多種腫瘤中都可檢測(cè)到PDGFRA基因發(fā)生突變，其中包括肺癌[3,4]。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，生長(zhǎng)因子通過與特異性受體結(jié)合，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力。本研究擬探討PDGFRA對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞:人正常肺支氣管上皮細(xì)胞HBE，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H358、PC9、95C、H1299均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究中心。

1.2 主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、Fetal Bovine Serum (Hyclone)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)、定量PCR試劑盒(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)試劑盒(MTS, Promega)、BCA Assay Reagent(美國(guó)Pierce Chemical公司)、PVDF膜(Millpore公司，Cat NO.IPVH00010)。

1.3 主要抗體:PDGFRA antibody (santa cruz, sc-338)、E-cadherin antibody(Abcam, ab15148)、Vimentin antibody(Abcam, ab92547)、β-actin antibody(santa cruz, sc-4778)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)PDGFRA基因的表達(dá):TRIZOL法抽提細(xì)胞總RNA。紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度，取5μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用Cyber Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃4 min，擴(kuò)增條件 94℃ 30 s，60℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。PDGFRA 上游引物: TTGAAGGCAGGCACATTTACA; PDGFRA下游引物：GCGACAAGGTATAATGGCAGAAT；擴(kuò)增引物大小為119bp。以β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列為TGGCACCCAGCACAATGAA；下游引物序列為CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA；目的片段大小為186bp。

1.5 Western-Blot檢測(cè)PDGFRA、E-cadeherin以及Vimentin表達(dá)水平 收集肺癌細(xì)胞，裂解液裂解，提取蛋白質(zhì)，BCA 法行蛋白定量分析，濕轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5 % 脫脂奶粉封閉 1.0h，一抗 4℃孵育過夜，二抗 37℃孵育 1.5h，發(fā)光液曝光顯影。一抗?jié)舛缺葹?：1000，二抗?jié)舛缺葹?：3000，以β-actin作為內(nèi)參。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定knock down PDGFRA細(xì)胞系 利用二代慢病毒包裝系統(tǒng)在A549細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定knock down PDGFRA 細(xì)胞系，用Lipofectamine 2000以2.5:1的體積比將慢病毒shRNA質(zhì)粒(6μg/dish)、packing質(zhì)粒(psPAχ2, 4.5μg/ dish)和envelop質(zhì)粒(pMD2.G; 1.5 μg/ dish)一并轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,7h后更換正常培基，培養(yǎng)48h，過濾收集上清液，并將帶有慢病毒的上清液感染A549細(xì)胞，感染3d后，使用puromycin篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，并進(jìn)行Western-Blot驗(yàn)證。有效shRNA序列為 shPDGFRA#1: GCCTTTGTACCTCTAGGAATG; shPDGFRA#2：GCTTGAAGGCAGGCACATTTA; shCtrl: CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA,具體步驟參見文[5]。

1.7 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以4×103個(gè)細(xì)胞每孔的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞接種至96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液(設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別檢測(cè)細(xì)胞24h，48h以及72h的細(xì)胞增殖活力，MTS與培基以1:5的比例混合均勻，混勻后于生化培養(yǎng)箱中孵育60min后用多孔板酶標(biāo)儀在490nm檢測(cè)吸光度。

1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn):采用 Transwell 小孔遷移試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力，具體步驟見參見文[6]及說明書。

2 結(jié) 果

2.1 五株人肺癌細(xì)胞系中PDGFRA的基本表達(dá)水平:運(yùn)用 RT-PCR 方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺癌細(xì)胞中PDGFRA的 mRNA 水平相較人正常肺支氣管上皮細(xì)胞(HBE)均顯著升高，其中 A549 肺癌細(xì)胞的PDGFRA水平最高(圖 1)。進(jìn)一步用 Western-blot方法檢測(cè)PDGFRA的蛋白水平(圖 2)，同樣也發(fā)現(xiàn)在五株肺癌細(xì)胞系中PDGFRA的蛋白水平也均高于正常肺上皮細(xì)胞，而且蛋白水平與 mRNA 相一致。

圖1 PDGFRA在正常肺上皮細(xì)胞及五種肺癌細(xì)胞系中的mRNA表達(dá)水平

圖2 PDGFRA在正常肺上皮細(xì)胞及五種肺癌細(xì)胞系中的蛋白表達(dá)水平

2.2 在A549細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定knock down PDGFRA細(xì)胞系，檢測(cè)其mRNA和蛋白水平以及對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響:針對(duì)PDGFRA基因，設(shè)計(jì)兩組shRNA以及對(duì)照組隨機(jī)插入序列，利用二代包裝系統(tǒng)包裝成慢病毒。挑選PDGFRA表達(dá)最高的A549使用慢病毒進(jìn)行感染，觀察干擾效果。慢病毒連續(xù)感染二次后，使用puromycin進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定knock down PDGFRA細(xì)胞系。收集細(xì)胞抽提總蛋白以及RNA，利用Western-blot及RT-PCR方法檢測(cè)PDGFRA的mRNA及蛋白表達(dá)水平。進(jìn)而利用MTS方法檢測(cè)knock down PDGFRA后，細(xì)胞增殖活力的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3～5所示，兩組shRNA慢病毒干擾序列均有效，其中#1干擾效率為50%，#2干擾效率為70%以上，RT-PCR檢測(cè)PDGFRA在A549細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，表明干擾效果均有顯著抑制，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步抽提細(xì)胞總蛋白，Western-Blot分析慢病毒感染后對(duì)蛋白水平PDGFRA的下調(diào)水平，發(fā)現(xiàn)shPDGFRA#1和shPDGFRA#2慢病毒感染后，PDGFRA蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)，尤其是shPDGFRA#2的A549細(xì)胞中，下調(diào)最為明顯，結(jié)果與mRNA檢測(cè)一致，如圖4所示。MTS法連續(xù)檢測(cè)3d對(duì)照組及knock down PDGFRA穩(wěn)定細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖活力改變，如圖5所示，在經(jīng)過慢病毒感染后的穩(wěn)定knock down PDGFRA細(xì)胞中，細(xì)胞在第2天細(xì)胞增殖活力下調(diào)，在第3天細(xì)胞增殖活力顯著下調(diào)，且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明PDGFRA基因能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖能力。

圖3 慢病毒感染A549細(xì)胞對(duì)PDGFRA的mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 慢病毒感染A549細(xì)胞對(duì)PDGFRA的蛋白水平的影響

圖5 干擾下調(diào)PDGFRA表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖活力的影響

2.3 干擾PDGFRA表達(dá)水平對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響:因shPDGFRA#2細(xì)胞對(duì)PDGFRA的干擾最為明顯，故本實(shí)驗(yàn)選定shPDGFRA#2穩(wěn)定敲除PDGFRA的A549細(xì)胞進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，采用 Matrigel 侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PDGFRA穩(wěn)定敲除細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞中，細(xì)胞侵襲能力的變化。如圖6所示，對(duì)照組A549細(xì)胞穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)為864.0±46.9個(gè)，而在慢病毒感染下調(diào)PDGFRA的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞數(shù)為156.0±35.8，與對(duì)照組相比，穩(wěn)定敲除PDGFRA的肺癌細(xì)胞穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著下調(diào)(P<0.001)，結(jié)果提示PDGFRA可能在肺癌的侵襲過程發(fā)揮促侵襲作用。

圖6 感染下調(diào)PDGFRA表達(dá)水平對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

2.4 干擾下調(diào)PDGFRA表達(dá)水平對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響:通過細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)，觀察對(duì)照組細(xì)胞以及穩(wěn)定敲除PDGFRA的shPDGFRA#2細(xì)胞系中，肺癌細(xì)胞遷移能力的改變。在劃痕剛開始及24h后這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照，比較兩組細(xì)胞的遷移能力，如圖7所示，與對(duì)照組相比，下調(diào)PDGFRA后細(xì)胞遷移能力下調(diào)，這表明PDGFRA可能在肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

圖7 干擾下調(diào)PDGFRA表達(dá)水平對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

2.6 干擾下調(diào)PDGFRA表達(dá)水平對(duì)肺癌細(xì)胞中E-cadeherin和Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響:有文獻(xiàn)報(bào)道指出E-cadeherin和Vimentin在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，它們的表達(dá)水平可作為腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志性特征。而上述研究表明PDGFRA可能在肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。因此，筆者抽提慢病毒感染后構(gòu)建的A549穩(wěn)定敲除PDGFRA細(xì)胞系的總蛋白，Western-Blot檢測(cè)E-cadeherin和Vimentin的蛋白表達(dá)水平。如圖8所示，PDGFRA下調(diào)后，E-cadeherin和Vimentin的表達(dá)水平都有顯著下調(diào)，這進(jìn)一步證實(shí)了，PDGFRA在肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要作用。

圖8 干擾下調(diào)PDGFRA表達(dá)水平對(duì)肺癌細(xì)胞E-cadeherin和Vimentin蛋白水平的影響

3 討 論

血小板源性生長(zhǎng)因子受體A((platelet—derived growth factor receptor alpha，PDGFRA)PDGFRA 位于染色體4q12，與配體PDGFS結(jié)合后，可促進(jìn)腫瘤的血管生成。有研究報(bào)道，在肺鱗癌中，PDGFRA有8.7%的高表達(dá)[7]。在針對(duì)PDGFRA表達(dá)的各種腫瘤研究中，對(duì)比腫瘤細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞，出現(xiàn)了幾乎一致的結(jié)果，表明PDGFRA與腫瘤的惡性化程度密切相關(guān)，并且PDGFRA 的突變異構(gòu)體近年來在腫瘤的研究中越來越熱門，在肺癌及胃腸道腫瘤中，PDGFRA具有較高的突變率。PDGFRA的突變會(huì)致使KIT酪氨酸激酶持續(xù)活化，細(xì)胞增殖分化失控[8]。楊柳青等研究發(fā)現(xiàn)胃腸道間質(zhì)瘤患者的預(yù)后復(fù)發(fā)性轉(zhuǎn)移與PDGFRA的突變呈正相關(guān)。顧健人等研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中，PDGFRA的突變?yōu)?.1%且與患者的預(yù)后不良及非細(xì)胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究都表明PDGFRA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中作為促癌基因起作用，而在肺癌相關(guān)的PDGFRA研究中，發(fā)現(xiàn)PDGFRA在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移前的持續(xù)性活化對(duì)于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移可能具有促進(jìn)作用，其機(jī)制目前尚未明確。

本研究運(yùn)用 RT-PCR、Westernblot 及慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定knock down細(xì)胞系等方法檢測(cè)細(xì)胞中 PDGFRA的表達(dá)， 研 究 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 肺 癌 細(xì) 胞 中 PDGFRA的mRNA 和蛋白表達(dá)水平高于正常的人肺上皮細(xì)胞，進(jìn)一步通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定敲除PDGFRA的A549細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)PDGFRA下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞增殖活力降低，這表明PDGFRA能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。針對(duì) PDGFRA促細(xì)胞增殖的能力，結(jié)合臨床研究中PDGFRA的突變對(duì)患者預(yù)后及復(fù)發(fā)性侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，在體外水平監(jiān)測(cè)了下調(diào)PDGFRA后，細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下調(diào)，結(jié)果與郝騰等報(bào)道的PDGFRA相關(guān)肺癌臨床研究相互佐證，確認(rèn)了PDGFRA對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的促進(jìn)作用。

目前對(duì)于PDGFRA在腫瘤中高表達(dá)以及其對(duì)腫瘤的侵襲能力作用機(jī)制尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞系中PDGFRA高水平表達(dá)，同時(shí)干擾PDGFRA的表達(dá)可以有效的降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，在分子水平，PDGFRA下調(diào)后，能夠顯著下調(diào)E-cadeherin和Vimentin蛋白水平的表達(dá)。E-cadeherin是一種細(xì)胞黏附分子，在所有上皮組織中都表達(dá)，能夠介導(dǎo)上皮細(xì)胞的黏附，而細(xì)胞間黏附能力的改變是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的前提條件，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，PDGFRA能夠直接影響E-cadeherin的表達(dá)，提示在腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，PDGFRA可能通過介導(dǎo)間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換的相關(guān)分子表達(dá)，進(jìn)而有助于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。Vimentin是一種波形蛋白，與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力密切相關(guān)，同時(shí)也是癌細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的下游標(biāo)志信號(hào)分子，下調(diào)PDGFRA后，Vimentin的表達(dá)也同時(shí)被抑制。

[1] Organization WH. Global status report on alcohol and health 2014[J].Global Status Report on Alcohol, 2014, 18(7): 1～57.

[2] 楊曉歐,張夢(mèng)云,李秀華,等.慢性心力衰竭大鼠腎組織中血小板源性生長(zhǎng)因子及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)[J].解剖學(xué)雜志,2016,39(2):161～165.

[3] 鄧子龍,劉蔚東.EGFR、PDGFRA和VEGFR2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及變異分析[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2016,26(4):24～28.

[4] 王棟,劉相燕,宋永明,等.肺鱗狀細(xì)胞癌分子特征及治療對(duì)策研究現(xiàn)狀[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(16):1287～1290.

[5] 鞏偉麗,徐廣,韓秋影,等.慢病毒感染方法構(gòu)建穩(wěn)定干涉PDRG1的HeLa細(xì)胞系[J].科學(xué)技術(shù)與工程,2013,13(22):6385～6388.

[6] 宋水川,陳達(dá)偉,江曉肖.骨橋蛋白不同剪接變體對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2014,22(3):529～533.

[7] Ramos H, Dutt Amit, Mermel Craig, et al. Amplification of chromosomal segment 4q12 in non-small cell lung cancer[J].Cancer Biol Ther, 2009, 8(21): 2042～2050.

[8] 王永海,邢建群,寇麗春,等.經(jīng)纖維支氣管鏡局部化療治療中央型肺癌的應(yīng)用研究[J].河北醫(yī)學(xué),2015,21(10):1610～1612,1613.

Effect of PDGFRA on Cell Proliferation and Invasion in Lung Cancer Cell Lines

LULing,etal

(.DepartmentofRespiratoryMedicineofBeihaiTuberculosisPreventionandTreatmentInstitute,GuangxiBeihai536000,China)

Objective: To evaluate the effect of platelet derived growth factor receptor alpha(PDGFRA) on the proliferation and invasion of lung cancer cells. Methods: The mRNA expression level of PDGFRA in eight lung cancer cell lines and normal lung cell HBE was detected by PT-PCR. Two groups of lung cancer lines(A549) from the high expression level of PDGFRA were selected, then stable knock down and over-expression PDGFRA cell lines were constructed through lentiviral transfection. Furthermore, the effect of PDGFRA on cell proliferation and invasion in these cells were evaluated by MTS, scratch test, Transwell and western-blot test. Results: Over-expression of PDGFRA showed that cell proliferation and invasion significantly increased, meanwhile, E-candherin and Vimentin also increased, scratch test and transwell revealed that PDGFRA significantly improved the cell invasion. Whereas, knock down of PDGFRA decreased the cell proliferation, the expression of E-candherin and Vimentin decreased and the cell invasion also significantly also decreased compared with the control group. Conclusion: PDGFRA can promote the cell proliferation and contribute to the cell invasion in lung cancer cells.

PDGFRA; Cell proliferation; Cell invasion; Lung cancer cells

廣西壯族自治區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生計(jì)劃項(xiàng)目,(編號(hào)：Z2014323)

1006-6233(2017)02-0259-05

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.025