Th22細胞及其細胞因子IL-22在冠心病外周血的表達及與冠脈病變的相關性研究

楊新超 (長江大學第二臨床醫學院，湖北 荊州 434023)

姜曼 (長江大學醫學院，湖北 荊州 434023)

胡鋼 (長江大學第二臨床醫學院 荊州市中心醫院心血管內科，湖北 荊州 434023)

Th22細胞及其細胞因子IL-22在冠心病外周血的表達及與冠脈病變的相關性研究

楊新超
(長江大學第二臨床醫學院，湖北 荊州 434023)

姜曼
(長江大學醫學院，湖北 荊州 434023)

胡鋼
(長江大學第二臨床醫學院 荊州市中心醫院心血管內科，湖北 荊州 434023)

目的：觀察冠心病患者外周血Th22細胞及其細胞因子白細胞介素-22(IL-22)的水平變化，探討其與冠狀動脈病變的相關性。 方法：入選冠心病患者60例，其中急性心肌梗死組(AMI)20例、不穩定型心絞痛組(UAP)20例及穩定型心絞痛組(SAP)20例，同時選取同期健康對照組(HC，冠脈造影正常者)20例。采用流式細胞技術檢測各組外周血Th22細胞在外周血細胞中的比例；ELISA法檢測血漿IL-22濃度；Gensini評分系統評價冠脈病變程度，分析Th22及IL-22與冠脈病變程度的相關性。 結果：AMI組血漿Th22細胞在CD4+T細胞中的比例為(2.02±0.84)%、IL-22濃度為(39.12±5.41)pg/mL，顯著高于SAP組(0.74±0.27)%、(28.14±3.78)pg/mL，UAP組(1.20±0.34)%、(33.50±3.47)pg/mL及HC組(0.48±0.19)%、(25.38±3.13)pg/mL，差異具有統計學意義(P均<0.05)；UAP組與SAP組和HC組差異有統計學意義(P均<0.05)；SAP組與HC組差異有統計學意義(P<0.05)。AMI組、UAP組及SAP組患者的Th22細胞比例與IL-22濃度均呈顯著正相關，γ分別為0.877，0.764，0.968，P均<0.001。Th22和IL-22與Gensini評分呈顯著正相關，person分析，γ分別為0.962，0.889，P均<0.001。結論： Th22細胞及其分泌的主要細胞因子IL-22在冠心病的發生中起重要作用，血漿中Th22和IL-22水平的測定可為早期診斷冠心病及評估冠狀動脈病變程度提供臨床依據，是一種無創、有效的診斷方法，值得在臨床推薦使用。

冠心病；Th22細胞；IL-22；冠狀動脈評分

文獻報道，自20世紀80年代以來，國外冠心病的發病率和病死率呈逐年下降趨勢，而我國冠心病發病率和死亡率居高不下，發病率僅低于印度，位于世界第二[1]。冠心病是多種因素共同作用的結果，以往的多種代表性發病機制學說相互聯系、相互補充，但仍未能完整闡釋冠心病的發病機制。關于冠心病發病機制的最新研究表明，冠心病的發生與炎癥反應密切相關，是一種典型的慢性炎癥性疾病，主要以不同的CD4+T淋巴細胞為主，共同介導了冠心病的發生發展全過程[2,3]。Th22細胞是近年來新發現的一種輔助型T細胞亞群，獨立于其他已知的T細胞亞群(Th1，Th2，Th17)，主要分泌效應因子IL-22,其與冠心病的研究較少且不成熟，目前關于Th22細胞及IL-22在冠心病患者體內的表達水平，及與Gensini評分的相關性尚無相關報道。本研究觀察Th22及IL-22在冠心病患者體內的表達情況，分析其與Gensini評分的相關性，探討Th22細胞及IL-22與冠心病發病機制的關系，為臨床診斷和治療冠心病提供一種高效、便捷的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年11月至2016年9月在荊州市中心醫院心血管內科住院的冠心病患者60例及同期冠脈造影正常者20例為健康對照組，其中男49例，女31例，年齡54～81歲，平均年齡(65.00±8.12)歲。其中冠心病患者分為三組，分別為穩定型心絞痛組(SAP)20例，不穩定型心絞痛組(UAP)20例，急性心肌梗死組(AMI)20例。20例HC組為CAG正常者，經體格檢查血常規、血脂、血糖、肝腎功能均正常，冠脈造影陰性，運動負荷心電圖陰性。四組在年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、體重指數、糖尿病史、血脂異常方面差異無統計學意義(P>0.05)。

排除標準：先心病、肺心病、合并風濕性心臟病及其他嚴重的心臟瓣膜病、合并各種心肌病、合并腫瘤、心力衰竭、肝腎功能不全、創傷、感染、周圍血管病變、自身免疫性疾病，以及3個月內進行心臟外科或介人手術。以上均符合世界衛生組織(WTO)診斷標準。

1.2 方法

所有患者均行心電圖、全胸片、超聲心電圖、肝腎功能等入院常規檢查。四組患者抽取靜脈血，AMI組的釆血時間于發病后24h之內；UAP組、SAP組及HC組于清晨空腹狀態下抽取。所有標本在30min內3000r/min離心10min，分離血清后密封封管，于-80℃保存待測。

1.3 主要試劑

離子霉素、莫能霉素、佛波醇乙酯(PMA)、固定劑、破膜劑、RPMI-1640培養基、PE標記鼠抗人IL-22抗體購自德國美天旎生物技術有限公司，PerCP-Cy5.5標記鼠抗人IL-17抗體、APC標記鼠抗人IFN-γ抗體、FITC標記鼠抗人CD4抗體均購自美國BD pharmingen公司，IL-22ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.4 流式細胞技術檢測外周血Th22在CD4+T細胞中的百分比

AMI組的釆血時間于發病后24h之內；UAP組、SAP組及HC組于清晨空腹狀態下抽取。各組分別抽取靜脈血5mL(肝素鈉抗凝)，從中取抗凝全血200μL于EP管中，用RPMI1640調整細胞濃度至2.0×106/mL；接種于24孔培養板(1mL/孔)，加入50μl的PMA工作液(1μg/mL)、15μL離子霉素工作液(50μg/mL)、10μl莫能霉素工作液(20μg/mL)混勻，置于5%CO2、37℃細胞培養箱孵育4h；取100μL刺激后血于流式管中，加入4μL FITC標記CD4單抗，室溫避光孵育15min后加入100μL 細胞固定液，再室溫避光孵育15min；加入3mL 0.9%氯化鈉混勻，1500r離心5min，棄掉上清，加入100μL 破膜液，同時加入4μL PerCP-Cy5.5標記鼠抗人IL-17抗體、2μL APC標記鼠抗人IFN-γ抗體、4μL PE標記鼠抗人IL-22抗體，室溫避光孵育15min；加入3mL 0.9%氯化鈉，1500r離心5min，棄掉上清；400μL 1×PBS重懸細胞，進行流式細胞學上機分析。Th22細胞定義為CD4+IFNγ-IL17-IL22+。

1.5 ELISA檢測IL-22水平

將保存的血漿取出，放置于常溫下復融備用，IL-22試劑盒檢測血漿IL-22的濃度，具體步驟嚴格按照說明書進行。

1.6 統計學分析

所有數據均采用SPSS17.0統計軟件進行分析，組間差異比較采用LSD-t檢驗，指標間的關系用Pearson相關分析。P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Th22細胞占CD4+T比例及其細胞因子IL-22濃度

AMI組血漿Th22細胞在CD4+T細胞中的比例(2.02±0.84)%、IL-22濃度(39.12±5.41)pg/mL，顯著高于UAP組(1.20±0.34)%、(33.50±3.47)pg/mL，SAP組(0.74±0.27)%、(28.14±3.78)pg/mL及HC組(0.48±0.19)%、(25.38±3.13)pg/mL，差異具有統計學意義(P<0.05)；UAP組與SAP組和HC組差異有統計學意義(P<0.05)；SAP組與HC組差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 三組冠心病組Th22與IL-22的相關性分析

AMI組患者的Th22細胞比例與IL-22濃度(γ=0.877，P<0.01)呈顯著正相關；UAP組患者的Th22細胞比例與IL-22濃度(γ=0.764，P<0.01)呈顯著正相關；SAP組患者的Th22細胞比例與IL-22濃度(γ=0.968，P<0.01)呈顯著正相關。

表1 各組患者Th22及IL-22水平

注：a:與HC比較，P<0.05；b:與SAP組比較，P<0.05；c:與UAP組比較，P<0.05。

2.3 Th22及IL-22與Gensini評分的相關性分析

Th22和IL-22與Gensini評分呈顯著正相關，person分析，γ分別為0.962，0.889，P均<0.001。見圖1，圖2。

圖1 Th22與Genisini評分散點圖 圖2 IL-22與Genisini評分散點圖(正態分布資料，person相關分析γ=0.962，P<0.001) (正態分布資料，person相關分析γ=0.889，P<0.001)

3 討論

Th22細胞是新近發現的一種T細胞亞群，其在血液CD4+T記憶性T細胞中表型呈CLA+(皮膚細胞淋巴相關抗原)CCR6+CCR4+CCR10+，典型特征為在皮膚炎癥性疾病中分泌IL-22和TNF-α，不能分泌IL-4、IL-17或IFN-γ，且與Th17細胞亞群功能相似，故將其命名為Th22細胞亞群[4,5]。文獻報道，Th22細胞及其效應因子IL-22在多種炎癥反應疾病和自身免疫疾病中表達異常，如類風濕性關節炎、銀屑病、慢性異位性皮炎、哮喘、系統性硬化癥[6,7]。然而，目前臨床上關于Th22細胞及其細胞因子IL-22在冠心病這種慢性炎癥性疾病中的確切作用機制尚未完全明確，為探討及明確Th22細胞及IL-22是否參與冠心病的形成，本研究通過分組比較健康對照組和不同類型冠心病患者外周血中Th22的表達情況及血漿IL-22濃度，并分析不同類型冠心病患者Th22與IL-22的相關性以及探討Th22細胞和IL-22與冠脈病變程度的相關性。研究結果提示，Th22和IL-22與冠心病的形成密切相關，共同介導了冠心病的發生發展。其共同參與冠心病形成的相關機制可能為：Th22細胞作為一種新型的T細胞亞群，通過分泌IL-22對冠心病的發生發展起重要作用。

Th22分化大量IL-22，當IL-22水平升高達到一定程度時，誘發S100A8、S100A9等促炎分子鈣離子結合蛋白表達增多[8]。S100A8/A9作為急性期炎癥因子，可以作為急性冠脈綜合征(ACS)患者早期檢測的特異性指標之一。研究指出，急性冠脈缺血患者，其外周血S100A8/A9水平顯著高于穩定型心絞痛患者及冠脈造影正常的健康人[9]。IL-22不僅通過誘導S100A8/A9的產生誘發急性期反應，還可以通過調節纖維蛋白原和血小板參與血液的凝固，當血液中纖維蛋白原和血小板的數量增加時，增加了血管堵塞的風險，誘導ACS的發生[10]。有學者指出，冠脈血管內皮上可能存在IL-22的受體，當IL-22作用于受體時，可能會出現內皮細胞的損傷和凋亡，當損傷沒有消除時，血小板粘附聚集，形成血栓，同時穩定性被破壞，斑塊形態異常進而破裂出現血栓堵塞血管導致心肌梗死。

IL-22能夠上調MMP-1等基質金屬蛋白酶增加細胞的活動性[11]。MMP-1可降解基底膜并且加快低密度脂蛋白的氧化和滲入，從而促使單核細胞侵潤并轉化為泡沫細胞，最終導致斑塊的形成，引發斑塊破裂堵塞血管。IL-22也能使ICAM表達顯著升高，動脈內皮損傷后引起內皮細胞表明粘附性改變，表達粘附分子，使單核細胞粘附于內皮細胞，并遷移進入內皮下層，轉化為巨噬細胞，吞噬脂質形成泡沫細胞[12～14]。

本研究還顯示，冠心病組內AMI組和UAP組外周血Th22細胞表達水平及血漿IL-22濃度明顯高于SAP組，提示Th22及IL-22在人類動脈粥樣硬化斑塊中的表達水平可能與炎癥嚴重程度和斑塊的脆性相關。

Gensini評分全面反映冠狀動脈狹窄程度及嚴重性[15]。本研究通過比較冠心病組Th22及IL-22與Gensini評分的相關性，結果表明Th22及IL-22與Gensini評分均呈顯著正相關(γ分別為0.962,0.889，P均<0.001)，提示Th22細胞及IL-22可促進冠狀動脈粥樣硬化的形成并與冠脈斑塊的嚴重程度成正相關，Gensini評分可以作為間接評價冠脈病變嚴重程度的一項重要指標。

綜上所述，Th22細胞及其效應因子IL-22在冠心病患者外周血中表達異常，冠心病組Th22與IL-22呈顯著正相關，且Th22細胞在外周血的表達水平和血漿IL-22濃度與冠狀動脈病變程度密切相關。實際工作中，臨床醫生診斷冠心病患者應重視外周血Th22和IL-22的檢測。但本研究選取的樣本量較少，分組過程中可能存在不平衡性，且本實驗屬于回顧性研究，可能存在一些混雜因素，仍未能完全明確Th22細胞及IL-22參與冠心病的發病機制。未來應通過大樣本、多中心、前瞻性臨床隨機對照試驗進行驗證，明確Th22細胞與IL-22與冠心病的關系，及與冠脈病變程度的相關性。

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[編輯] 劉陽

2016-12-03

楊新超(1991-)，男，碩士生，主要從事冠心病研究工作；通信作者：胡鋼，hugang@medmail.com.cn。

R541.4

A

1673-1409(2017)04-0011-04

[引著格式]楊新超，姜曼，胡鋼.Th22細胞及其細胞因子IL-22在冠心病外周血的表達及與冠脈病變的相關性研究[J].長江大學學報(自科版)，2017，14(4)：11～14.