多囊卵巢綜合征患者BMP7異常表達對顆粒細胞增殖的影響

劉俊芬 崔向榮 吳媛霞 蘇丹 武學清

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是青春期及育齡期女性中最常見的具有高度異質性伴有糖代謝異常的內分泌及代謝紊亂性疾病，是引發無排卵性不孕的主要原因，其具體病因尚未闡明［1］。有研究表明，卵泡的發育受阻及優勢卵泡的選擇與顆粒細胞凋亡有關［1］。骨形態發生蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP7）作為轉化生長因子β（TGFβ）超家族中的一員，在胚胎發育及再生修復中起重要作用，但BMP7的異常表達是否與顆粒細胞凋亡及進而引發卵泡發育受阻和優勢卵泡選擇閉鎖相關，目前尚未見報道［2］。本研究通過比較PCOS與正常排卵患者顆粒細胞凋亡情況及BMP7的表達差異，初步探討PCOS患者體內BMP7的異常表達對顆粒細胞增殖的影響，為改善臨床PCOS患者的卵泡發育及妊娠率提供理論依據。

對象與方法

一、對象

選擇2015年9月—2016年1月于本中心行體外受精胚胎移植技術（IVF ET）或卵泡質內單精子顯微注射（ICSI）助孕治療的患者44例，年齡22～37歲，平均（28．9±3．1）歲。符合 2003年荷蘭鹿特丹會議上制定的PCOS診斷標準的PCOS組33例；無排卵功能障礙，因輸卵管因素或男性不育接受IVF／ICSI治療的對照組11例。排除標準：患者近3個月受過促排卵治療或服用過促排卵治療；患者合并有子宮內膜異位癥、庫欣綜合征、腎上腺腫瘤、卵巢功能早衰及卵巢男性化腫瘤等。本研究已由山西省婦幼保健院（兒童）醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、方法

1．卵巢刺激方案：本研究中PCOS患者于治療周期前部分口服避孕藥達英35或炔雌醇環丙孕酮片。所有患者均采用拮抗劑方案，患者從月經周期第2天或口服避孕藥、孕激素撤退出血第2天，通過陰道B超及血激素水平評估卵巢基礎狀態，于月經第2～3天開始啟動促排卵，從啟動日起使用FSH（普利康，美國默沙東公司或麗申寶，珠海麗珠制藥公司）及人絕經期促性腺激素（human menopausal gonadotrophin，hMG）（珠海麗珠制藥公司）進行促排卵，啟動劑量根據患者年齡、體重指數（body mass index，BMI）、基礎 FSH水平、竇卵泡計數等而定。在Gn應用4～5天后陰道B超監測卵泡生長情況，根據卵泡生長及血激素水平，及時調整促排卵藥物劑量。在優勢卵泡直徑＞14 mm時開始注射GnRH拮抗劑（加尼瑞克，美國默沙東公司）0．25 mg／d。當有3枚以上卵泡直徑≥18 mm時，于當晚給予人絨毛膜促性腺激素（hCG，珠海麗珠制藥公司）5 000～10 000 U肌肉注射，注射hCG后36～38 h行超聲引導下經陰道穿刺取卵術。其余操作按照本中心的常規進行。

2．體外受精胚胎移植和黃體支持治療：兩組均在hCG注射后36～38 h后經陰道B超引導下行取卵術，取卵日開始進行黃體支持（注射用黃體酮40 mg／d）。根據患者病情行常規受精或單精子卵胞漿內注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），16～18 h后觀察受精情況，授精后18～20 h觀察，有清晰雙原核者（2PN）為受精卵。在取卵后第3天進行可用胚胎評估并移植，可用胚胎為受精第3天卵裂球4～8個，分級為2級及以上的胚胎，取卵后3 d或5 d行ET術。

3．卵泡液及顆粒細胞的收集：于患者取卵當天，收集PCOS及對照組婦女未經血液污染的卵泡液，經4 000 r／min離心25 min，將上清液收集便為分析用卵泡液，且將其封存于 15 ml離心管內，于－80℃冰箱凍存備用。用PBS將卵泡液離心后的沉淀清洗3次，用PBS（1 m l）將其混勻，隨后用吸管將其吸取且加入具有等體積的淋巴細胞分享液中，于2 500 r／min條件下離心20 min，將第2層顆粒細胞（白色云霧狀細胞團）收集于離心管內，且用PBS將其清洗3次后于－80℃冰箱凍存備用，用于相關指標檢測。

4．Real time PCR：檢測膜受體 BMP7、Bcl2及Caspase3 mRNA轉錄水平。用PBS將收集的卵丘顆粒細胞洗滌3次，采用 RNA提取試劑盒（TIANGEN，天根生化科技有限公司）提取細胞總RNA進行逆轉錄，采用Real time PCR對逆轉錄的cDNA進行PCR擴增。以GAPDH，進而優化反應條件，使目的基因與內參的擴增效率接近100%，Ct值代表基因的起始拷貝數，可根據Ct值比較基因的表達量。ΔΔCt＝（Ct目的基因Ct內參基因）（Ct陰性對照Ct內參基因），以2ΔΔCt計算各組 mRNA的相對表達量。基因引物序列如下：BMP7上游 5′CTCCAAGACGCCCAAGAACCAGG3′， 下 游 5′GCTGTCATCGAAGTAGAG GACGGA3′；Bcl2上游5′GGTGGGGTCATGTGTGTGG3′， 下 游 5′CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC3′；Caspase3上 游5′CATGGAAGCGAATCAATGGACT3′， 下 游 5′CTGTACCAGACCGAGATG TCA3′；GAPDH上游 5′ATGGGCAGCCGTTAGGAAAGC3′， 下 游 5′CCTGGAAGATGGTGATGGGATT3′，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。

5．Western blotting檢測卵巢顆粒細胞中BMP7的蛋白表達水平：取4μl蛋白上樣緩沖液與20μl卵泡液混合，于100℃水中煮沸10 min。隨后采用SDS PAGE膠對顆粒細胞中的蛋白進行電泳分離，采用半干轉膜，用5%的牛奶封閉液對PVDF膜進行封閉 1 h，隨后加入 BMP7的多克隆一抗（Proteintech公司）于4℃搖床孵育過夜。辣根過氧化物酶標二抗（康為世紀）孵育2 h后，加入化學發光劑曝光。各組以βactin為研究內參，比較各組卵泡液中蛋白的相對表達水平。

6．流式細胞儀檢測顆粒細胞凋亡率：用PBS將顆粒細胞洗滌3次后，將顆粒細胞懸液的深度調整到1×106個／m l，隨后取1 ml顆粒細胞懸液經1 000 r／min離心10 min，去PBS后垂直加入預冷的70%乙醇中固定1～2 h。經離心將固定液棄去，于3 ml PBS中重懸 5 min，再經 1 000 r／min離心5 min，棄去 PBS，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI，100μg／ml）于4℃避光 30 min上機。于 PI熒光的直方圖上，凋亡細胞于G1／G0期會出現一個亞二倍體峰，其所占樣本數的比例即為顆粒細胞凋亡率。

7．統計學處理：采用SPSS 170統計軟件進行統計學分析。計量資料用（珋x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。計數資料用率（%）表示，采用χ2檢驗。p＜005為差異有統計學意義。

結 果

一、兩組一般參數及用藥情況比較

兩組腰臀比（waist hip ratio，WHR）及超排天數比較，差異無統計學意義；PCOS組年齡、FSH及Gn用量均低于對照組，而BMI、LH、E2、T值均高于對照組，差異均有統計學意義，見表1。

表1 兩組一般參數及用藥比較

二、兩組間顆粒細胞凋亡情況

兩組卵丘顆粒細胞固定后于流式細胞儀上檢測其凋亡率，PCOS患者顆粒細胞凋亡細胞的DNA含量為（3．51±0．23）顯著高于對照組（1．32±0．09），差異有統計學意義（圖1）。

圖1 兩組間顆粒細胞凋亡情況

三、兩組 BMP7、Bcl2及 Caspase3 mRNA轉錄水平

PCOS組卵丘顆粒細胞內Bcl2轉錄水平顯著降低對照組，Caspase3轉錄水平高與對照組，差異均有統計學意義；BMP7 mRNA轉錄水平略低與對照組，但差異無統計學意義，見表2和圖2。

表2 兩組BMP7、Bcl2及Caspase3 mRNA轉錄水平比較

圖2 兩組 BMP7、Bcl2及 Caspase3mRNA轉錄水平

四、兩組顆粒細胞內BMP7蛋白的表達情況

PCOS組顆粒細胞內 BMP7表達為（036±004），低于對照組（079±017），差異有統計學意義，見圖3。

圖3 兩組卵泡液中卵源性蛋白BPM7的表達情況

討 論

PCOS是育齡期女性最常見的內分泌紊亂性疾病，臨床主要表現為持續無排卵、高雄激素血癥及B超下卵巢呈多囊樣改變，其病理生理特點主要表現為卵泡發育障礙，然而迄今為止其病因及具體發病機制尚未探明［3］。目前認為，PCOS患者卵泡發育障礙可能是異常內分泌及旁分泌因子、代謝障礙及卵泡內微環境改變共同作用的結果。其中卵泡內微環境是影響卵母細胞的質量及卵裂能力的關鍵因素之一，可通過自分泌及旁分泌形式產生的局部調節因子構建一個不斷變化而又相對穩定的微環境，進而影響卵泡的生長發育，在PCOS的發生、發展過程中發揮重要作用。同時有研究表明，TGFβ超家族成員BMP7可通過旁分泌和自分泌的方式影響卵泡發育及促進顆粒細胞生長成熟、減緩顆粒細胞凋亡，抑制孕酮分泌等［4］。因此，對本中心IVF／ICSI助孕治療的女性患者取卵當天顆粒細胞中BMP7進行了檢測，發現PCOS患者的顆粒細胞BMP7蛋白表達水平較對照組降低而mRNA與對照組無差異，因此，推測BMP7的異常改變可能不是由轉錄水平引起。BMP7不僅是卵泡生成過程中重要的調控因子，且可通過旁分泌及自分泌作用參與卵丘擴展，對于維持卵母細胞的最佳微環境及正常排卵、受精具有重要意義。

有研究表明，延遲成熟的卵母細胞與顆粒細胞的凋亡密切相關，且可對胚胎的發育潛能造成影響［5］。PCOS患者雙側卵巢存在大量小竇卵泡，然而其無法周期性形成成熟卵泡，進而卵泡發育停滯，無優勢卵泡排出，其機制可能與細胞凋亡調控異常相關［6］。Bcl2在細胞的凋亡進程中發揮著關鍵作用，其主要通過阻止線粒體內Ca2＋與細胞色素C的釋放作用，來發揮抗氧化作用進而抑制細胞的凋亡。Caspase3主要通過破壞DNA修復及操作基因整性來引發細胞凋亡，且該進程會被 Bcl2阻斷［7］。同時有文獻報導，BMP7可通過抑制Caspase3及上調Bcl2的表達來抑制線粒體凋亡途徑，進而對損傷組織細胞起到保護作用［8］。然而，PCOS患者體內BMP7的異常表達是否與其體內凋亡相關因子的紊亂相關，目前較少研究。本研究通過對顆粒細胞凋亡率的檢測發現，PCOS患者的凋亡率較對照組顯著增高，且凋亡相關基因Bcl2表達下調而Caspase3表達顯著增高。同時，另有研究報道，BMP7能刺激大鼠顆粒細胞內DNA的合成，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶激活的脫氧核糖核酸酶的釋放以減緩顆粒細胞凋亡［9］。由此可以推斷，在PCOS患者體內存在BMP7信號通路的異常，而此通路的異常可能與顆粒細胞增殖存在一定的相關性。

綜上所述，BMP7可于人的卵丘顆粒細胞中檢測到，且于PCOS患者卵泡液中表達量顯著降低，BMP7的異常表達可能是引發PCOS患者卵母細胞成熟障礙及胚胎發育潛能降低的重要因素。同時驗證了PCOS患者顆粒細胞凋亡率的增加及凋亡調控蛋白的異常改變，說明BMP7的異常改變與PCOS的發病有一定的關系，且參與了卵巢顆粒細胞的凋亡過程，但要確切知道引發BMP7蛋白水平改變的原因需從表觀遺傳學角度進一步進行研究。

1 Li S．Differential DNA methylation patterns of polycystic ovarian syndrome in whole blood of Chinese women．Oncotarget，2016．

2 Guan J．Bone morphogenetic protein7（BMP7）mediates ischemic preconditioning induced ischemic tolerance via attenuating apoptosis in rat brain．Biochem Biophys Res Commun，2013，441：560566．

3 Jalilian N，Haghnazari L，Rasolinia S．Leptin and body mass index in polycystic ovary syndrome．Indian JEndocrinol Metab，2016，20：324328．

4 Artimani T．Downregulation of adiponectin system in granulosa cells and low levels of HMW adiponectin in PCOS．JAssist Reprod Genet，2016，33：101110．

5 Cai G．MicroRNA145 Negatively Regulates Cell Proliferation Through Targeting IRS1 in Isolated Ovarian Granulosa Cells From Patients With Polycystic Ovary Syndrome．Reprod Sci，2016．

6 Mikaeili S．Altered FoxO3 expression and apoptosis in granulosa cells of women with polycystic ovary syndrome．Arch Gynecol Obstet，2016．

7 Xiao Z．Mechanisms of cyclosporine induced renal cell apoptosis：a systematic review．Am JNephrol，2013，37：3040．

8 Liapis H．Biology of congenital obstructive nephropathy．Nephron Exp Nephrol，2003，93：e8791．

9 Falke LL．CCN2 reduction mediates protective effects of BMP7 treatment in obstructive nephropathy．JCell Commun Signal，2016．