血漿ctDNA在卵巢上皮惡性腫瘤的早起診斷與療效研究

楊麗娜，徐 琳，高玉濤

（昆明醫科大學第一附屬醫院 ，云南 昆明 650032）

血漿ctDNA在卵巢上皮惡性腫瘤的早起診斷與療效研究

楊麗娜，徐 琳，高玉濤

（昆明醫科大學第一附屬醫院 ，云南 昆明 650032）

卵巢上皮性癌是常見的婦科惡性腫瘤，早期診斷非常困難，70%以上的患者就診時已屬晚期，5年生存率滯留在30%左右。早發現、早診斷、早治療對卵巢癌的預后至關重要。卵巢癌的早期診斷、療效評估多依靠腫瘤標志物，但敏感性和特異性均不夠理想。故尋求理想的標記物早期診斷、評估化療的敏感性，對提高臨床療效具有重要意義。ctDNA是腫瘤細胞脫落或凋亡后釋放進入循環系統的DNA片段。有文獻證明在腫瘤患者中ctDNA可以被定性、定量和追蹤，可以用于腫瘤的早期發現和治療評估。

血漿ctDNA；腫瘤；卵巢癌；早期診斷；療效評價

血漿游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）是外周血中游離存在、不包含在完整細胞結構內的DNA。循環系統中存在cfDNA早已得到證實。目前，cfDNA可能來源于以下三種情況：①來自于細胞的凋亡進程中片段化的DNA；②來自于壞死的細胞的DNA碎片；③來自于細胞分泌的exosome。其中，cfDNA主要來源于細胞凋亡。而國內ctDNA 在婦科惡性腫瘤中的相關研究極少。本實驗通過對比腫瘤組織及外周血ctDNA基因突變，評估早期診斷的可行性，提高卵巢癌早期檢測的靈敏度、特異性。并對治療前后患者外周血ctDNA變化情況進行監測，探尋一種可以預測治療效果的方法[1-2]。對于早期診斷卵巢癌，選擇最佳的、個性化的治療方案及判斷預后有非常重要的價值。

1 立項依據與研究內容

項目的立項依據，研究意義、國內外研究現狀及發展動態分析，需結合科學研究發展趨勢來論述科學意義；或結合國民經濟和社會發展中迫切需要解決的關鍵科技問題來論述其應用前景。卵巢上皮性癌是常見的婦科惡性腫瘤，死亡率居婦科惡性腫瘤的首位。早期缺乏特異性的腹盆腔癥狀和敏感標記物使得卵巢癌的早期診斷非常困難，70%以上的患者就診時已屬晚期，其5 年生存率仍然滯留在30%左右。早發現、早診斷、早治療是卵巢癌治療的關鍵。卵巢癌的早期診斷、療效評估多依靠腫瘤標志物，如CA125和HE4，但現有的腫瘤標志物敏感性和特異性均不夠理想。故尋求理想的腫瘤標記物早期診斷并有效地預估卵巢癌對化療的敏感性，實現個性化方案，對提高臨床療效頗具意義。ctDNA（Circulating tumor DNA），是原發腫瘤甚至是轉移形成的新腫瘤上的細胞脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環系統的DNA 片段。在腫瘤形成早期，血液中已經開始有ctDNA 了，有多篇文獻證明在多種腫瘤患者中ctDNA可以被定性、定量和追蹤，可以用于腫瘤的早期發現和治療評估。2015 年發表于《Nature Communications》雜志的一項新的研究，Mark Sausen 等[3]首次發現，流進入血液中的腫瘤DNA，可用于實時跟蹤胰腺癌的發展以及對治療的反應。在非小細胞肺癌方面，ctDNA 研究頗多，如有學者研究[4]顯示ctDNA 濃度水平可真實反映經不同手段治療的早期或晚期非小細胞肺癌腫瘤負荷變化。ctDNA 有望成為惡性腫瘤早期診斷和療效判斷的新型腫瘤分子生物學標志物。在諸多腫瘤ctDNA 研究方面，ctDNA 在卵巢癌方面的研究國外報道較少，如有學者研究[5]顯示ctDNA 在7 例III 期卵巢癌患者的血漿中均可檢測到。而目前國內ctDNA 在卵巢癌方面的相關研究尚未見報道。卵巢上皮癌死亡率在婦科腫瘤中占第一位，為降低卵巢癌的死亡率，改善卵巢癌患者的預后，迫切需要積累更多相關數據來明確ctDNA 在卵巢癌早篩、療效監測、預測疾病復發以及化療耐藥甚至靶向治療方面的作用和價值。

2 研究內容

2.1 明確ctDNA 在卵巢癌的早期診斷方面的價值；

2.2 卵巢上皮性癌患者術前、術后、化療過程中、化療后、隨訪中、復發時等不同時間點ctDNA 含量的變化；

2.3 ctDNA 含量與卵巢癌手術病理分期、腫瘤大小、腫瘤級別等臨床病理參數之的相關性；

2.4 ctDNA 含量與化療效果及腫瘤預后的相關性；

2.5 ctDNA 水平和腫瘤大小(用超聲和CT 評估) 之間的相關性；

2.6 ctDNA 預測上皮性卵巢癌復發的敏感性和特異性；

2.7 對腫瘤組織和血液樣本進行基因篩查和對比，確定卵巢癌的基因型；

3 研究方法

卵巢癌患者ctDNA 檢測樣本的獲取：卵巢癌患者術前、術后、化療過程中、化療后、復發時的血樣均于清晨空腹時抽取肘靜脈血10ml 于EDTA 抗凝管中，并在30 分鐘至 2 h 內做以下 2 步處理：

1）在4℃條件下1800 g 離心 10 min，離心后將上清（血漿）分裝到多個 2.0 ml 的離心管中。下層血細胞分裝到 2 ml 凍存管中，即為所需血細胞；

2）在4℃條件下以 16000 g 離心 10 min 去除殘余細胞，將上清轉入新的 2.0 ml 的離心管中，即得到所需的血漿。而后將樣品保存到-80℃冰箱中或干冰中待測定。

4 本項目的特色與創新之處

4.1 通過定性、定量和追蹤ctDNA，探索通過ctDNA 進行卵巢癌早期診斷及療效評價的可能機制。

4.2 癌癥個體化深度測序分析方法是目前液態檢測的一種新方法，其在卵巢癌中的相關研究鮮有報道。

4.3 目前腫瘤治療已經進入靶向治療的新時期，卵巢癌Brca 基因突變靶向治療初現端倪，本實驗應用ctDNA 檢測腫瘤的突變位點，尋找新的靶向治療位點的可能。

5 總 結

ctDNA，ctDNA中檢測出的基因變異（EGFR或者ALK）是否可以直接指導臨床治療，我們需要進一步的數據來證實；EGFR突變患者使用靶向治療耐藥的過程中，RECIST標準往往評價不夠完整，如何通過血液監測耐藥突變（T790M）的豐度來指導我們的耐藥，也非常值得臨床探索。在將來，隨著我們檢測方法的不斷進步，期待液態活檢技術能夠真正應用到臨床，指導肺瘤精準治療，成為延長患者生存期的必備手段！

[1] Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitormetastatic breast cancer. N Engl J Med.2013;368:1199–1209.

[2] Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, Ng C, Hrebien S, Cutts RJ, Cheang M, Osin P,Nerurkar A, Kozarewa I et al: Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in earlybreast cancer. Sci Transl Med 2015, 7(302):302ra133.

[3] Sausen M, Phallen J, Adleff V, et al. Clinical implications of genomic alterations in the tumourand circulation of pancreatic cancer patients. Nature communications. 2015;6:7686.

[4] 高玉濤,吳令英,張 偉,等.三磷酸腺苷-腫瘤體外藥敏試驗指導復發性卵巢上皮性癌化療的前瞻性研究[J].中華婦產科雜志,2013,48(5):358-363.

[5] 徐 琳,王 艷,韓雪松,等.超聲消融治療大于45 歲子宮肌瘤患者后性激素變化分析[J]. 云南醫藥,2016,(02):172-175.

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ISSN.2095-8803.2017.24.075.02