基因修飾DC疫苗在肺癌中的研究進展

簡 艷綜述 鈄方芳審校

·綜述與講座·

基因修飾DC疫苗在肺癌中的研究進展

簡 艷綜述 鈄方芳審校

基因修飾；樹突細胞；肺癌

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，大部分患者在確診時已處于中晚期，手術(shù)和放化療是肺癌的傳統(tǒng)治療模式。近年來，生物治療逐漸成為腫瘤的第四大治療模式，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑為肺癌患者的生存帶來福音，以DC和CIK疫苗為基礎(chǔ)的主動和過繼免疫治療也在臨床上取得了一定成績，但肺癌的5年生存率仍不足15%[2]。所以不斷探索肺癌的發(fā)病機制及尋找新的治療方式仍是攻克腫瘤的重要方向。以基因修飾的細胞免疫治療可從分子水平激活免疫應(yīng)答并重建機體免疫功能，對腫瘤干細胞或處于非增殖期的腫瘤細胞均有殺傷作用，是肺癌治療模式的重要補充手段[3]。DC作為目前唯一能激活未致敏初始型T細胞的APC，能特異性地識別遞呈腫瘤抗原，以特異性腫瘤基因轉(zhuǎn)染DC制作個體化疫苗，在基因水平上針對患者制定精準化治療方案，以此免疫荷瘤宿主，激發(fā)高效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，起到事半功倍的效果。本研究將具體描述基因修飾的DC疫苗在肺癌免疫治療中的發(fā)展。

1 DC的生物學特性

DC來源于骨髓CD34+造血干細胞，因突起的偽足像樹枝，故命名為樹突狀細胞，根據(jù)來源不同分為淋巴系DC和髓系DC兩大類，淋巴系DC的前體與NK細胞、T細胞相同，髓系DC前體細胞與單核細胞和粒細胞相同[4]。根據(jù)成熟度不同DC功能有差異，未成熟的DC內(nèi)含重要細胞器，包括內(nèi)體或稱MHCⅡ類小室和溶酶體等，高表達補體、Toll樣受體，為DC攝取抗原提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；當未成熟DC攝取抗原后或受到某些因子刺激則分化為成熟DC，高表達共刺激因子(CD80、CD86、CD40、CD40L等)和粘附因子(IL12p35、IL12p40、IL12p70、IFN-γ等)，獲得遞呈抗原(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)及活化T細胞的能力[5]。

2 DC與肺癌的發(fā)生發(fā)展

2002年，Dunn等[6]在總結(jié)前人研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過大量基礎(chǔ)和臨床試驗驗證提出“腫瘤免疫編輯”假設(shè)，認為腫瘤形成在免疫應(yīng)答中分為3個階段：清除、平衡、逃逸，其中DC在免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵作用。在肺癌的發(fā)生發(fā)展中，當宿主細胞發(fā)生癌變后，未成熟的DC經(jīng)趨化作用從外周血進入腫瘤微環(huán)境，在腫瘤抗原刺激下形成成熟DC，上調(diào)抗原遞呈能力，高表達共刺激因子，攝取腫瘤抗原與MHC結(jié)合成MHC-抗原肽復(fù)合物作為第一活化信號激活初始T細胞使之活化分化成為T輔助細胞(Th)和細胞毒T淋巴細胞(CTL)，從而啟動體液免疫應(yīng)答消滅表達HLA多肽的癌變細胞[7]；同時高表達IL-12、IL-6、TNF-a和IL-10，增強自然殺傷細胞的直接殺傷作用，作為第二活化信號增強機體對炎癥或腫瘤的免疫應(yīng)答[8]。DC分泌的趨化因子可專一性趨化初始型T細胞，促進T細胞在腫瘤部位的聚集，增強T細胞激發(fā)相應(yīng)的免疫應(yīng)答[9]。然而，由于腫瘤細胞遺傳的不穩(wěn)定性及異質(zhì)性，可逃避DC識別和攝取，從而導(dǎo)致腫瘤細胞不斷增殖甚至轉(zhuǎn)移。有研究證實：腫瘤細胞一般低表達或不表達MHCⅠ、MHCⅡ類分子和細胞黏附分子，同時釋放VEGF，TGF-β阻礙DC分化成熟，不利于加工形成MHC-抗原肽復(fù)合物，從而喪失抗原呈遞功能，最終出現(xiàn)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移[10]。 也有研究表明[11-12]：與正常組織相比，肺癌、喉癌和鼻咽癌等多種惡性腫瘤癌巢內(nèi)DC數(shù)目不足；與正常供體DC相比，從腫瘤分離得到的DC明顯缺乏抗原提呈功能，進一步支持了該假說。

3 肺癌相關(guān)抗原基因轉(zhuǎn)染DC疫苗的制備方式

3.1 DC疫苗來源

目前用于臨床免疫治療的DC多來源于肺癌患者的外周血，亦可從骨髓、臍血中提取，但骨髓提取的有創(chuàng)性及臍血來源困難限制了使用；同時外周血淋巴系DC含量少，體外培養(yǎng)困難，故疫苗制作多來源于外周血的髓系DC。外周血分離出單個核細胞后，在白介素-4(IL-4)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的誘導(dǎo)下分化為成熟的DC。腫瘤抗原加載方式主要有抗原致敏和基因修飾兩種，抗原致敏主要是將腫瘤細胞的全部抗原信息或特異性抗原肽通過接觸融合共培養(yǎng)方式負載。這類疫苗制備方法簡便，容易實施，但非相關(guān)抗原量大且種類多，有誘發(fā)自身免疫性疾病危險。基因修飾是通過特異性基因轉(zhuǎn)染方式改變DC的遺傳表達，精準個體化的提呈腫瘤抗原，避免了上述缺點。沈晨陽等[13]研究發(fā)現(xiàn)：單純的熱休克蛋白gp96-肽復(fù)合物/DC疫苗較腫瘤細胞粗提物/DC 疫苗誘導(dǎo)的淋巴細胞分泌產(chǎn)生更高的IFN-γ和更強烈的抗腫瘤免疫應(yīng)答，究其原因為腫瘤細胞粗提物特異性不高或者丟失導(dǎo)致，進一步證明特異性的腫瘤抗原修飾DC疫苗效果更佳。

3.2 基因轉(zhuǎn)染樹突細胞的方式

3.2.1 物理化學法 物理法常用為顯微注射法及電穿孔法，化學法常用如DNA-磷酸鈣共沉淀法、二乙基氨基乙基-葡聚糖法、聚陽離子-二甲基亞砜法等，上述兩種轉(zhuǎn)染技術(shù)易于操作，具有可重復(fù)性，對靶細胞的影響因素少，但轉(zhuǎn)染率相對不高。

3.2.2 非病毒基因轉(zhuǎn)移法 將目的基因以非病毒載體包裝攜帶，通過細胞膜內(nèi)吞或膜溶合的方式將基因組導(dǎo)入靶細胞。常用試劑如陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物。它無免疫原性，且不攜帶致病基因，對負載的DNA大小不限制，可負荷RNA、核糖體及其他大分子物質(zhì)。Zou等[14]將負載在陽離子脂質(zhì)體上的p53用于肺癌的基因治療，發(fā)現(xiàn)不管在體內(nèi)還是體外實驗中均可使腫塊縮小，但脂質(zhì)體的靶向性欠佳。

3.2.3 病毒載體轉(zhuǎn)染法 以病毒作為載體將目的基因轉(zhuǎn)染至靶細胞染色體從而獲得持續(xù)表達，常用如：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒以及單純皰疹病毒等。病毒載體可承載比較大的外源基因，同時高表達多個目的基因，轉(zhuǎn)染率較非病毒載體和物理化學法高，目的基因可持續(xù)表達，是目前常用的轉(zhuǎn)染方式之一。Lin等[15]使用慢病毒作為MAGE-A3基因載體轉(zhuǎn)染DC，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染率高達(80±2.5)%，轉(zhuǎn)染后DC疫苗高表達CD80、CD86、HLA-DR，對表達MAGE-A3抗原的細胞株具有殺傷作用。

4 特異性基因修飾DC疫苗在肺癌中的應(yīng)用

4.1 基因修飾DC疫苗治療肺癌的優(yōu)勢

基因修飾DC疫苗相較于傳統(tǒng)的DC疫苗治療肺癌具有如下優(yōu)勢：①基因轉(zhuǎn)染后DC疫苗能表達全蛋白序列，包含所有抗原位點，相較于單純的外源性刺激能更有效地進行抗原遞呈；②表達抗原時間更持久，增強抗原提呈能力，同時高表達共刺激因子和細胞因子的能力，對抗腫瘤細胞的抑制作用，具有更強的激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)能力；③病毒載體轉(zhuǎn)染后刺激DC細胞成熟并延長存活時間，增強免疫應(yīng)答；④基因修飾DC疫苗表達抗原精準，不含有正常人體抗原，不易誘發(fā)自身免疫疾病。基因修飾DC疫苗的高效性和安全性奠定了其在臨床腫瘤治療中的地位。

4.2 基因修飾DC疫苗在肺癌中的臨床轉(zhuǎn)化研究

肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素多階段過程，其中外界理化因素是誘因，不同癌基因上調(diào)表達或抑癌基因突變、異常甲基化及缺失被認為是不同病理類型肺癌發(fā)生的早期分子事件。基于基因水平的改變，我們通過改造DC疫苗特異性呈遞腫瘤抗原，達到殺傷腫瘤細胞的功效。有研究發(fā)現(xiàn)15%～20%的非小細胞肺癌患者存在RAS原癌基因突變，其中90%為K-RAS基因突變[16]。Zhao等[17]通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)：K-ras 基因修飾的DC 疫苗相較于單純DC疫苗組能更快更高效地縮小荷瘤小鼠腫塊。針對約有50%以上的非小細胞肺癌出現(xiàn)抑癌P53基因突變[18]，有人評估了腺病毒轉(zhuǎn)染特異性基因P53的DC疫苗在肺癌中的療效和安全性，Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)納入的40%～50%患者有良好的抗腫瘤免疫應(yīng)答，且無不良反應(yīng)；Ⅲ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)回輸P53/DC疫苗有效率和進展率分別為78.6%和33.3%，進一步證實了特異性表達腫瘤抗原的DC疫苗的有效性和安全性[19]。細胞因子可使免疫細胞趨向癌巢中心，促進DC識別抗原并高表達共刺激分子，在抗腫瘤免疫應(yīng)答中具有重要作用，Morandi等[20]研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子修飾的DC疫苗能夠持續(xù)表達并增強抗腫瘤免疫應(yīng)答。陳吉泉等[21]研究發(fā)現(xiàn)IL-12基因修飾的DC疫苗可增強NK活性，更加高效地激發(fā)CTL抗腫瘤免疫應(yīng)答。癌胚抗原(CEA)作為肺癌早期篩查的一個指標，側(cè)面反映腫瘤的活動程度，吳軍等[22]利用癌胚抗原重組痘苗病毒(rV-CEA)轉(zhuǎn)染樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了rV-CEA的DC疫苗表面高表達MHC-CEA抗原肽復(fù)合物、共刺激分子和細胞間粘附分子，高效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答對抗分泌性CEA的腫瘤細胞。Ishikawa等[23]臨床Ⅰ期研究發(fā)現(xiàn)半乳糖酰基鞘氨醇修飾的DC疫苗針對進展期肺癌有一定的治療作用，且無不良應(yīng)出現(xiàn)。CK19在肺癌中高表達，通過慢病毒將CK19轉(zhuǎn)染至DC疫苗相較單純DC疫苗，能夠更高效地縮小荷瘤小鼠肺癌腫塊[24]。

4.3 基因修飾DC疫苗治療肺癌的不足

特異性基因修飾DC疫苗治療肺癌具有廣泛的前景，但仍存在不足之處。首先，基因工程制作的高耗時耗費在經(jīng)濟上存在一定的發(fā)展限制，仍需探索更高效簡便安全的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。其次，病毒轉(zhuǎn)染DC后可能出現(xiàn)基因重組或互補致表達異常，具有潛在的致病危險。Zhang等制作了一種新型的溶瘤腺病毒疫苗：使用端粒反轉(zhuǎn)錄酶促進溶瘤腺病毒進行抗癌作用，單純皰疹病毒腺苷激酶作為自殺基因控制溶瘤腺病毒的存亡，在體內(nèi)外實驗中證實了該新型疫苗的有效性和安全性[25]，可能克服DC疫苗病毒轉(zhuǎn)染后的不良反應(yīng)。

總之，基因表達異常是細胞癌變的原因之一，從分子水平上尋找新的治療途徑是目前肺癌治療的研究熱點，特異性基因修飾DC疫苗具有精準的靶向性和強大的抗原遞呈能力，達到個體化免疫殺傷治療，具有可靠的理論基礎(chǔ)和成功的臨床前期試驗基礎(chǔ)，是目前理想的、有希望的治療途徑之一。但由于基因工程的耗費、技術(shù)的限制及可能存在的細胞免疫治療不良反應(yīng)限制了其發(fā)展，廣泛應(yīng)用于臨床仍需更嚴謹?shù)囊呙缭O(shè)計和樣本量更大的臨床前期探索。

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330000 南昌大學醫(yī)學院(簡 艷)；330029 江西省腫瘤醫(yī)院(鈄方芳)

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B

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2017-02-14

2017-03-23)

(編輯甘艷)