蛋白質組學技術在中醫藥防治糖尿病及并發癥研究中的應用進展＊

秦田雨，秦靈靈，吳麗麗，孫文，潘雅婧，宋紫臨，張程斐，劉銅華

蛋白質組學技術在中醫藥防治糖尿病及并發癥研究中的應用進展＊

秦田雨1，秦靈靈2，吳麗麗3，孫文3，潘雅婧1，宋紫臨1，張程斐1，劉銅華4＊＊

（1.北京中醫藥大學中藥學院北京100029；2.北京中醫藥大學科技處北京100029；3.北京中醫藥大學教育部中醫養生學重點實驗室北京100029；4.北京中醫藥大學研究生院北京100029）

糖尿病是以長期高血糖為主要臨床特點的全身慢性代謝疾病。蛋白質組學從整體蛋白質的水平，更深入地發現和探討糖尿病的發病機制，現在在中醫藥研究中已有較多應用。本文對蛋白質組學在中醫藥干預糖尿病及其并發癥中的研究應用進行綜述，包括糖尿病及并發癥的中醫證候蛋白質組學篩選驗證，以及相關中藥藥理機制的蛋白質組學分析，并進行了展望，以期為中醫有關糖尿病的病機理論以及中藥作用靶點提供新的線索和依據，深化中醫藥干預糖尿病研究。

蛋白質組學糖尿病中醫藥證候

1994年，澳大利亞學者Wilkins等首先提出了蛋白質組（Proteome）的概念，指一個細胞內的全部蛋白質[1]。蛋白質組學本質上是指在大范圍上研究蛋白質的特征，包括細胞內隨時間變化的蛋白質表達、翻譯后的修飾、蛋白之間的相互作用等，并且能夠從蛋白質水平上全面而整體地認識疾病發生發展的過程和機制[2]。其研究方法包括前期的樣本提取純化，中期的蛋白分離鑒定，以及后期的數據處理分析。蛋白質分離技術包括雙向電泳（2-DE），雙相熒光差異凝膠電泳（2DDIGE）以及多維液相色譜技術。2-DE是等電聚焦電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE）的組合。蛋白分離后再結合不同的質譜分析方法進行蛋白分析鑒定，目前主要應用的質譜鑒定技術主要有電噴霧串聯質譜（ESI-MS/MS），基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和表面增強激光解吸飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）等；而定量分析技術包括iTRAQ、SILAC、SWATH等。酵母雙雜交技術則利用酵母的轉錄激活因子GAL4具有兩個獨立結構域的特性來研究蛋白質之間的相互作用，具有較高靈敏度。最后以生物信息學方法輔助獲取信息、并進一步分析信息。

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）是以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，影響了全球數億人口，其早期診斷和并發癥預防對治療疾病具有重要意義。糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，中醫藥在防治糖尿病及并發癥方面積累了豐富經驗。目前中醫藥干預糖尿病及并發癥的蛋白質組學研究主要集中于中醫證候和中藥藥理研究。中醫病機的復雜性與蛋白質組表達的差異性都是機體即時動態性功能狀態的反映，蛋白質的多樣性和分子間的復雜網絡關系與中醫病機復雜多樣和開放式網絡特點也有很多相似之處[3]。下面從應用蛋白質組學的技術和方法研究糖尿病證候和藥物機制兩方面進行綜述，將有助于解讀中醫病機理論以及中藥干預糖尿病機制的本質和科學內涵。

1 糖尿病證候的蛋白質組學研究

王琪[4]等采用iTRAQ同位素標記蛋白質組學技術，對非腎虛痰瘀型和腎虛痰瘀型糖尿病患者，以及健康人的血液進行分析，篩選差異蛋白，發現腎虛痰瘀與健康對照組相比，21種蛋白上調（微管蛋白、踝蛋白、胰島素樣生長因子2等），15種蛋白下調（血清白蛋白、抗凝血酶3、血小板反應蛋白、角蛋白等）。腎虛痰瘀型與非腎虛痰瘀型組相比，13種蛋白下調（角蛋白2、角蛋白1、脂聯素等），7種蛋白上調（踝蛋白、微管蛋白等）；其中提示通過對血小板反應蛋白的關注，可以對早期腎虛痰瘀型2型糖尿病做出診斷。

糖尿病腎病常見于病史超過5年的患者，因而早期發現診斷腎損傷并依據證型辯證治療是很有必要的。柴可夫[5]等以早期糖尿病腎病患者尿液為標本，用2-DE結合質譜分析方法，進行三種證候早期糖尿病腎病的比較蛋白質組學研究，檢測出Nogo蛋白、單克隆抗體IgM在肝腎陰虛證高表達，IgKappa鏈、轉鐵蛋白、動力蛋白在氣陰兩虛證高表達，分子量52047.8白蛋白、轉甲狀腺素蛋白、ɑl-抗胰蛋白酶在脾腎陽虛證高表達。其中廣泛參與炎癥趨化，損傷修復的Nogo蛋白可以作為三種證型的鑒別依據，吻合了機體抗炎修復損傷機制與三種證型出現順序的關系，為中醫病證診斷客觀化提供了科學依據。

盧洪梅[6]等運用熒光差異雙向電泳技術分析正常人與糖尿病腎病腎陽虛證患者血漿中蛋白差異表達譜，共發現泛素化因子、載脂蛋白E、補體成分C4、細胞角蛋白、補體C3等9種差異表達蛋白，可能成為糖尿病腎病中醫證型診斷的靶向性生物標志物。盧洪梅還分析了正常人和早期糖尿病腎病腎陰虛患者血漿，篩選出表達差異大于1.5倍的蛋白斑點進行質譜分析，鑒定出11種差異蛋白質，包括結合珠蛋白、凝溶膠蛋白、載脂蛋白AI，為總結腎陰虛證的一般規律奠定了基礎[7]。

未來如能應用蛋白質組學的技術方法，建立常見的糖尿病證候圖譜，對于研究糖尿病患者的中醫體質類型分布規律以及診斷、辨證施治、預防都將很有裨益。

2 中藥干預糖尿病的蛋白質組學研究

單藥方面，有研究[8]通過蛋白組學的方法發現了瓜蔞水提物的蛋白質組的組成，包括一種全新的蛋白成分，認為瓜蔞蛋白可能是潛在的有降血糖效果的蛋白。另外有研究[9]應用SELDI-TOF-MS技術首次發現，在293個潛在生物標志中，人參皂苷通過降低CRP減輕炎癥治療糖尿病及其并發癥，并后續進行了ELISA方法驗證，提示人參皂苷通過抗炎機制在治療糖尿病血管病變方面的前景。

復方研究方面，陳紅謹[10]采用同位素標記技術，利用高效液相色譜儀及四級桿-靜電場軌道阱質譜儀，對糖尿病大鼠進行串級質譜數據分析，給藥組與對照組比較，共得到40個差異蛋白，其中上調大于1.5倍的蛋白有肉堿乙酰轉移酶等11個，下調小于0.75倍的有表皮生長因子受體等29個。從蛋白質分子水平上發現了復方益糖康能夠改善糖脂代謝的生物學基礎。

趙靜[11]應用單純高脂高糖喂養以及高脂高糖聯合腹腔注射STZ復制出兩種2型糖尿病大鼠模型，運用iTRAQ標記蛋白組學技術，比較觀察兩種模型的病理及中醫證候及血清蛋白組學特征，認為STZ聯合高脂高糖飲食模型大鼠為氣陰兩虛痰瘀證，apoBl00、apoC4和FCN2可作為潛在的2型糖尿病生物標志物，CYR61可作為潛在的氣陰兩虛痰瘀證生物標志物；并探查益氣養陰化痰祛瘀方對氣陰兩虛痰瘀證2型糖尿病大鼠模型的分子作用靶標（CDC42、RhoA、CYR61），揭示該方與該病證相關的生物學基礎。

在天芪降糖膠囊的研究中，研究者[12]應用雙向電泳結合輔助激光解吸電離質譜研究發現，天芪降糖膠囊可以恢復四氧嘧啶造糖尿病模型導致的載脂蛋白E、載脂蛋白AI、Ig gamma-2A鏈C區蛋白下調，以及轉體基因，結合珠蛋白，血清淀粉樣蛋白P-componen、凝血酶原的上調，并且后續使用ELISA方法驗證了該結果的準確性。

消渴丸為含有中草藥和格列本脲的中成藥，臨床用于治療2型糖尿病。Zhang X等[13]在一個48周、納入800名患者的臨床試驗之后，通過匹配要素選擇其中32例患者進行血清蛋白質組學分析，分為有/無低血糖的格列本脲治療組及有/無低血糖的消渴丸治療組。通過聯合運用iTRAQ、LC及MS/MS技術對血清蛋白質分別標記、分離和鑒定。研究結果顯示，25種蛋白在無低血糖的有/無消渴丸治療中表現出不同豐度；21種蛋白在有低血糖的有/無消渴丸治療中表現出不同豐度；24種蛋白在無低血糖的有/無格列本脲治療中表現出不同豐度；25種蛋白在有低血糖的有/無格列本脲治療中表現出不同豐度。在無低血糖組中，有5種蛋白質，包括ɑ型胰蛋白酶抑制劑重鏈H4，膽固醇基酯轉移蛋白，載脂蛋白C，組蛋白H2B和ɑ2巨球蛋白，對這兩種藥物表現出相同的反應豐度；在有低血糖組中，包括組蛋白H2B，載脂蛋白C，ɑ2巨球蛋白，ɑ間胰蛋白酶抑制劑重鏈H1，ɑ型胰蛋白酶抑制劑重鏈H4，補體成分C9，生物素酶和補體成分C8γ鏈這8種蛋白對兩種藥物的豐度變化相同。使用同樣藥物的有/無低血糖的患者血清蛋白差異程度大于不同藥物之間的差異。血清蛋白對兩種不同抗糖尿病藥物治療的反應可作為敏感的生物標志物來評估治療效果，并為后續機制研究鋪路。

3 中藥干預糖尿病并發癥的蛋白質組學研究

糖尿病相關認知減退是由糖尿病引起的以認知障礙為主要癥狀的腦損傷，與認知涉及的突觸中斷相關，特別在突觸后密度的區域中，存在高濃度的接收和轉導突觸信息的蛋白質。Chen J等[14]首次使用相對和絕對定量同位素標記技術（iTRAQ）聯合LC-MS/MS技術，鑒定糖尿病認知功能障礙及滋補脾陰方治療后大鼠的突觸后密度蛋白表達，每個樣本均分別進行了三個生物性和三個技術性重復?？瞻捉M與模型組比較有24個差異蛋白，模型組與治療組比較共有23個差異蛋白。其中“內質網相關蛋白”和“PI3K-Akt信號通路”在糖尿病相關認知減退中可能受損，而生長因子受體結合蛋白2可能是滋補脾陰方神經保護作用分子靶點中的重要蛋白質。

施翔等[15]研究復方滋補脾陰方對糖尿病認知下降大鼠海馬的比較蛋白質組學影響結果，發現并鑒定了滋補脾陰方藥的6個作用靶分子，為研究糖尿病相關認知下降的發病機制和藥物作用靶點提供了新的依據，也為中醫糖尿病病機理論的深化研究奠定了基礎。

Zhang T[16]等將大鼠通過注射鏈脲佐菌素建立大鼠糖尿病性周圍神經病（DPN）模型，將大鼠分為模型組、硫辛酸組合糖絡寧組，對背根神經節的線粒體蛋白進行蛋白質組學分析。結果顯示，與模型組比較，糖絡寧組有388個差異表達蛋白，其中線粒體復合物III顯著降低，谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化物酶顯著增多。與模型組比較，硫辛酸組有251個差異表達蛋白。與硫辛酸組比較，糖絡寧組線粒體復合物III增多，線粒體復合物IV減少。因此糖絡寧的抗氧化作用可能與通過調節呼吸復合體和抗氧化酶有關。

4 總結與展望

綜上所述，在中醫藥干預糖尿病的研究中蛋白質組學方法和技術已得到相對廣泛運用，并且取得了一定的成果。但其應用中還存在許多技術上的不足,如重復性不夠理想，靈敏度低，定量精度低，數據庫信息不完整，研究需大量時間并且費用昂貴等[17]。比如，雖然MALDI-TOF-MS是識別潛在疾病生物標志物的最有效和最敏感的方法之一,但是有研究[18]使用MALDITOF血清分析方法沒有發現腎陰虛證和非腎陰虛證患者之間的血漿譜中的差異峰，最可能的原因可能是等離子體分析方法不夠靈敏，表明MALDI-TOF血清分析方法的可能性和局限性。而在某些情況下[19]，使用不同的蛋白質分離方法從蛋白質組學分析中鑒定的蛋白質中僅有＜30%的重疊。因此在中醫證候研究中，應鼓勵使用多種蛋白質組學技術，比對結果互相參考。

更進一步講，雖然蛋白組學有相比于其它組學不可代替的優勢，如反映了基因與環境互動下的蛋白質實時變化，然而不可否認兩種及更多組學方法聯合使用是闡明藥物反應、生物學途徑和新型生物標志物的有力工具，可以彌補一種技術的缺陷，是未來糖尿病中醫藥研究的趨勢。另外可以進一步完善組學數據庫，具有節時、省力的長遠獲益。

目前中醫藥糖尿病的蛋白質組學研究多集中于比較糖尿病個體與正常個體樣品，篩查和鑒定其中差異表達的蛋白，分析的組織大多是尿和血清，可以進一步比較不同組織中的蛋白質組學差異。隨著蛋白質組學技術的發展完善、研究數據的豐富和系統化，未來發展的重點將集中于針對部分具有標記物功能的重要蛋白的功能進行系統研究，為了解糖尿病及其慢性并發癥的發病機制、鑒定疾病的分子標志、理解中醫整體證候的實質、尋找中醫藥干預靶點提供新的途徑。

1Abbott A.And now for the proteome.Nature,2001,409(6822):747.

2賈永森,司春富.蛋白質組學技術在中醫證候本質研究中的優勢.河南中醫,2008,28(1):9-10．

3周紅光,陳海彬,周學平,等.蛋白質組學是中醫病機研究的重要技術平臺.中國中西醫結合雜志,2012,32(7):990-993．

4王琪,哈木拉提.吾甫爾.基于蛋白質組學分析研究中醫腎虛痰瘀型2型糖尿病的生物學基礎.新疆醫科大學學報,2015,38(6):696-699.

5柴可夫,馬超,王宏獻.早期糖尿病腎病不同證候的尿蛋白組學研究.中華中醫藥學刊,2015,33(10):2311-2314.

6盧洪梅,湯水福,胡坤華.早期糖尿病腎病腎陽虛證的血漿蛋白質組學分析化.廣州中醫藥大學學報,2014,31(6):890-894.

7盧洪梅,鄒立華,湯水福,等.基于2D-DIGE技術對早期糖尿病腎病腎陰虛證型患者血漿蛋白質組學研究.中國中醫基礎醫學雜志, 2016,22(6):812-815.

8Lo H Y,Li T C,Yang T Y,et al.Hypoglycemic effects of Trichosanthes kirilowii and its protein constituent in diabetic mice:the involvement of insulin receptor pathway.BMC Complement Altern Med,2017,17(1):53.

9Cho W C,Yip T T,Chung W S,et al.Altered expression of serum protein in ginsenoside Re-treated diabetic rats detected by SELDI-TOF MS.J Ethnopharmacol,2006,108(2):272-279.

10陳紅謹,劉小溪,連捷,等.中藥益糖康治療糖尿病大鼠的蛋白組學研究.中華中醫藥刊,2017,35(2):477-481.

11趙靜.基于蛋白組學技術對2型糖尿病大鼠病證模型特點及中藥復方干預作用的研究.北京,北京中醫藥大學博士論文,2016.

12 Zhang S X,Sun H,Sun W J,et al.Proteomic study of serum proteins in a type 2 diabetes mellitus rat model by Chinese traditional medicine Tianqi Jiangtang Capsule administration.J Pharm Biomed Anal,2010, 53(4):1011-1014.

13 Zhang X,Sun H,Paul S K,et al.The serum protein responses to treatment with Xiaoke Pill and Glibenclamide in type 2 diabetes patients.Clinical Proteomics,2017,14(1):19.

14 Chen J,Zhan L,Lu X,et al.The Alteration of ZiBuPiYin Recipe on Proteomic Profiling of Forebrain Postsynaptic Density of db/db Mice with Diabetes-Associated Cognitive Decline.J Alzheimers Dis,2016,56 (2):471-489.

15 Shi X,Lu X G,Zhan L B,et al.The effects of the Chinese medicine ZiBu PiYin recipe on the hippocampus in a rat model of diabetesassociated cognitive decline:a proteomic analysis.Diabetologia,2011, 54(7):1888-1899．

16 Zhang T,Gao Y,Gong Y,et al.Tang-Luo-Ning Improves Mitochondrial Antioxidase Activity in Dorsal Root Ganglia of Diabetic Rats:A Proteomics Study.Biomed Res Int,2017:8176089.

17郭宏.糖尿病及其慢性并發癥蛋白質組學研究進展.中華中醫藥雜志,2013,28(1):11-14.

18 Jiang N,Liu H F,Li S D,et al.An integrated metabonomic and proteomic study on Kidney-Yin Deficiency Syndrome patients with diabetes mellitus in China.Acta Pharmacol Sin,2015,36(6):689-698.

19 Van Eyk J E.Overview:the maturing of proteomics in cardiovascular research.Circ Res,2011,108(4):490-498.

Application Development of Proteomic Technology in Research of Chinese Medicine Preventing and Treating Diabetes and Its Complications

Qin Tianyu1,Qin Lingling2,Wu Lili3,Sun Wen3,Pan Yajing1,Song Zilin1,Zhang Chengfei1,Liu Tonghua4
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.Technology Department of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Key Laboratory of Chinese Medicine Healthcultivation of The Ministry of Education,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 4.Graduation School of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Diabetes is the general chronic metabolic disease,with chronic hyperglycemia as the main clinical characteristic.Proteomics discusses and explores the pathogenesis of diabetes more deeply from the overall level of proteins,which has been frequently applied in Chinese medicine research.This paper summarized proteomics application in the study of Chinese medicine intervening diabetes mellitus,including screening and verification of proteomics in Chinese medicine syndromes of diabetes and its complications,as well as proteomics analysis of pharmacological mechanism of related Chinese medicine.This paper also prospected its outlook,in hope toprovide new clues and basis for the pathogenesis theory of diabetes in traditional Chinese medicine(TCM)and functioning targets,and to deepen research on Chinese medicine intervening diabetes.

Proteomics,diabetes,Chinese medicine,syndrome

10.11842/wst.2017.05.010

R587.1

A

（責任編輯：韓馥蔓，責任譯審：王晶）

2017-05-11

修回日期：2017-05-20

＊國家自然科學基金委面上項目（81373587）：糖痹康干預糖尿病周圍神經病變氧化應激及其信號通路的研究，負責人：劉銅華；科學技術部國家“十二五”科技支撐計劃課題（2014BAT10B04）：中藥干預糖調節受損臨床療效評價研究，負責人：劉銅華。

＊＊通訊作者：劉銅華，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥的臨床和基礎研究。