羊駝毛色形成分子調控研究進展

李佳晟，孫曉江，白瑞，范瑞文

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

羊駝毛色形成分子調控研究進展

李佳晟，孫曉江，白瑞，范瑞文

（山西農業大學動物科技學院，山西太谷030801）

羊駝是唯一一種毛纖維顏色豐富、含22種天然色的毛用型經濟動物。羊駝毛色表型取決于皮膚和毛囊黑色素細胞產生的黑色素以及黑色素運輸到周圍角化細胞的種類和數量，主要由遺傳基因決定。近年來，對羊駝毛色形成的分子機制進行了較為系統的研究，發現了細胞內多個毛色相關基因及其分子路徑以及細胞外對色素生成的相關作用因子。對調控羊駝毛色的關鍵基因以及miRNAs調控毛色的研究進行了綜述。

羊駝；毛色；黑色素；調控基因；miRNAs

羊駝（alpaca）源于南美洲的安第斯山脈，是駱駝科的毛用哺乳動物，毛纖維質地柔軟，長而細，彈性和韌性強，有“軟黃金”的美譽?，F在主要分布在海拔高度為4 200 m的秘魯、玻利維亞、智利、阿根廷以及澳大利亞，少數分布在厄瓜多爾、美國、加拿大、日本和中國。自2002年Huacaya羊駝被引入我國以來，其已成功進行繁育，并建立了穩定的遺傳品系。

毛色是脊椎動物最先被發現的表型特征之一，可用于鑒別動物亞種（或品種）[1]。羊駝的毛色是其重要的經濟性狀之一，具有從白色到黑色22種天然毛色。近年來，圍繞羊駝毛色形成的分子機制進行了相關研究，逐漸發現了毛色形成機制調控網絡，有助于建立羊駝等毛用型經濟動物毛色遺傳修飾新途徑。

1 毛色與黑色素的生化生成

羊駝毛色豐富，主要與其復雜的調控基因密不可分，黑色素在其中扮演關鍵角色，其主要控制黑色素細胞的發育和黑色素的生成、運輸2個途徑。黑色素是一種多功能的生物聚合物，由真黑素（不含硫原子且難溶）、褐黑素（含硫原子且易溶于堿）混合的形式表示[2-3]。羊駝毛囊內的黑色素細胞產生的黑色素的質和量決定其毛色。黑色素母細胞是原始的黑色素細胞，由胚胎神經嵴細胞發育而成，在后期向表皮移動并分化為前黑素細胞，黑色素母細胞和前黑色素細胞均不能生成黑色素。只有當黑色素細胞成熟之后才能生成黑色素。L-酪氨酸的生成在黑色素生成早期是強制性的，且有限速作用。許多研究表明，黑色素細胞內酪氨酸酶催化機體內的酪氨酸發生羥化并啟動相關反應以生成黑色素。酪氨酸酶能催化酪氨酸形成無色的多巴色素，多巴色素經過羥化、脫羧、催化氧化等反應，最后形成真黑素。在后面反應中如有半胱氨酸的參與，則產生Cys-多巴和Cys-多巴醌，同樣通過關環、脫羧等反應，最后生成褐黑素。

2 羊駝毛色關鍵調控基因

2.1 羊駝黑色素生成中的關鍵限速酶——TYR，TYRP1和DCT

酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）是黑色素生成過程中的關鍵酶，具有酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶2種活性[4]。作為黑色素生成過程中不可或缺的啟動因子，TYR的活性與表達量直接決定著黑色素的產量和生成速度[5]，較高水平的TYR有利于黑色素的生成[6]。酪氨酸酶相關蛋白-1（Tyrosinase-related protein 1，TYRP1）和酪氨酸酶相關蛋白-2（Tyrosinase-related protein 2，TYRP2，DCT）均各自催化特異性反應。研究認為，外源性的TYRP1和DCT的表達均能上調TYR的活性，促進黑色素的生成。TRR，YPRP1，TYRP2這3種蛋白存在的同源性為40%，其基因一同構成酪氨酸酶基因家族[7]。白瑞等[8]研究發現，TYR基因在第10代羊駝黑色素細胞的表達量相當于第3代細胞表達量的25倍。試驗結果表明，不同濃度的L-酪氨酸作用于羊駝黑色素細胞后，可使得TYR的mRNA的表達量顯著變化，而且發現較低濃度的L-酪氨酸會提高TYR的mRNA表達量，而較高濃度的L-酪氨酸反而會使酪氨酸酶的mRNA的表達量降低，證明L-酪氨酸對酪氨酸酶具有一定制約關系[5]。

2.2 羊駝黑色素生成的重要轉錄因子——MITF

3 調控黑色素生成的分子信號通路

3.1 cAMP信號通路

3.1.1 CREBcAMP應答元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一種真核生物細胞核內蛋白，它的功能主要是調節基因轉錄，故稱為調節轉錄的核因子。CREB具有調節轉錄功能，同時受到自身磷酸化作用的調控，該作用具有區域依賴性[14-15]。當前已知，CREB是許多蛋白激酶的磷酸化底物，在這些激酶中，最早被確認的一種是PKA。張俊珍等[16]通過實時熒光定量PCR發現，CREB1基因在棕黑色羊駝皮膚中的表達量是其在白色羊駝皮膚中的表達量的2.997倍。CREB1基因在羊駝黑色素細胞內是MITF預測分值最高的靶基因結合位點。

3.1.2 MC1R成熟黑色素細胞表面共有5種類型的黑色素皮質素受體[17]，其中，黑色素皮質素受體-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）屬于G蛋白偶聯受體超家族。MC1R具有7個跨膜結構域，被α-MSH視為天然受體[18]。任玉紅等[19]研究發現，在棕色和白色羊駝皮膚表皮、毛囊周圍外根鞘組織、毛球周圍以及真皮乳頭均有MC1R蛋白表達，但棕色羊駝主要在毛球頂部及表皮呈強陽性著色，而白色羊駝在相同部位呈弱陽性。MC1R基因在棕色羊駝皮膚中的基因表達量是白色羊駝的4.32倍，二者間差異極顯著。

3.1.3 Lpa-miR-nov-66Lpa-miR-nov-66可與sGC基因的CDS區域進行結合，升高sGC基因表達量，調控升高cGMP含量，繼而使cAMP含量降低，從而通過cAMP信號通路作用于MITF基因，下調黑色素的生成量[20]。

3.1.4 miR-324-3p曾慶寶等[21]經miR-324-3p調控MC1R基因影響黑色素形成的研究，發現通過轉染過表達miR-324-3p能夠調控MC1R的表達，下調MC1R導致下游MITF，TYR，TYRP2的基因表達下調，羊駝黑色素細胞黑色素的生成即受到抑制。

3.2 MAPK信號通路

3.2.1 KIT受體酪氨酸激酶（KIT）基因為表達黑色素細胞前體物，是干細胞生長因子受體，該受體是酪氨酸激酶受體家族成員之一。在羊駝毛囊中，有色羊駝毛囊結構中的KIT陽性強度高于白色羊駝，KIT在有色羊駝毛根成形部呈強陽性，毛根永久部有少量表達。在白色羊駝毛根永久部有較強的陽性反應，但在毛球部幾乎不表達。KIT在有色羊駝皮膚組織中的相對表達量是白色羊駝的1.2倍[22]。3.2.2miR-193b張丹麗等[23]研究了在白色和棕色羊駝皮膚中miR-193b及其靶基因KIT的表達情況，結果發現，白色羊駝中KIT顯著表達，而棕色羊駝中miR-193b顯著表達，可推斷miR-193b可能通過負調控KIT基因而促進黑色素的生成。

3.3 Wnt信號通路

步驟4：進行特征值分解，然后依據信號子空間和噪聲子空間的正交性，進行譜峰搜索，最終得到DOA估計結果.

3.3.1 β-cateninβ-連環蛋白（β-catenin）是一種廣泛分布且功能多樣的蛋白質，具有高度保守的特點，處于Wnt信號通路下游，能夠影響細胞的黏著，具有細胞內信號和調節基因轉錄的作用。β-catenin誘導毛囊形態的發生和毛囊干細胞的增生分化，影響毛發周期。于秀菊等[24]研究發現，β-catenin基因在羊駝表皮、毛乳頭和毛根鞘不同部位表達差異極顯著，并發現棕色羊駝皮膚中表達量顯著高于白色羊駝皮膚，印證了β-catenin基因在黑色素合成過程中起到了調控作用。

3.3.2 Wnt3aWnt家族基因編碼分泌性蛋白，目前主要有19種Wnt蛋白。Wnt3a蛋白屬于分泌型生長因子[25]。宋云飛等[26]研究發現，Wnt3a基因在棕色羊駝中的表達量明顯高于白色羊駝。Wnt3a在羊駝毛囊毛球部和根鞘都存在陽性反應物，不同毛色羊駝表達量差異顯著。Wnt3a基因在黑色素細胞中升高β-catenin的表達量，繼而調控MITF基因的表達量，最終調控黑色素的生成量。

3.4 TGF-β信號通路

3.4.1 TGF-β1轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β）有3個不同的家族成員，分別是TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3。TGF-β是一種多功能性的生長因子，在損傷修復、臟器纖維化、炎癥性疾病、腫瘤以及自身免疫性疾病等發生發展過程中具有顯著作用。賈小云等[27]通過qRT-PCR分析發現，TGF-β1 mRNA的表達量在白色羊駝皮膚組織中明顯低于棕色羊駝，說明TGF-β1可能與黑色素的合成具有一定關聯。

3.4.2 miR-663賈小云等[28]研究miR-633靶向TGF-β1調控羊駝黑色素細胞色素生成中發現，miR-633能夠抑制TGF-β1的表達，影響TGF-β信號通路，抑制黑色素細胞中的黑色素的生成。

4 細胞外作用因子對黑色素生成的影響

4.1 α-MSH

α-黑素細胞刺激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）是一種神經內分泌激素。α-MSH與黑色素細胞表面受體MC1R結合，可使細胞內cAMP水平升高，繼而使TYR基因的表達量升高、活性加強，最終促進黑色素的生成，并可優先刺激真黑素的生成。同時對維持和調節黑色素細胞的增殖、樹突形成起著關鍵的調控作用。于志慧等[29]研究發現，在羊駝黑色素細胞中體外添加一定濃度的α-MSH能誘導樹突增長、細胞增殖，同時細胞內MC1R，MITF和TYR基因表達量升高，促進黑色素生成。α-MSH與受體MC1R結合介導cAMP信號通路進而調節黑色素的生成。

4.2 IGF1

胰島素樣生長因子1（insulin-likegrowth factor，IGF1）是由70個氨基酸組成的單鏈性多肽，其在細胞的增殖、分化、遷移等方面發揮重要作用。后續研究證明，IGF1是影響動物毛發生長發育和毛囊周期性變化的關鍵因子，其通過與受體IGF1R結合來發揮生物學作用。IGF1R是Ⅱ型TYR激酶受體家族的成員，對黑色素調控起到關鍵作用[30-32]。研究表明，添加適當濃度IGF1在體外培養的羊駝黑色素細胞中，可使MITF，TYR，TYRP2基因的表達量顯著上調，進而促進黑色素的生成，同時提高了黑色素細胞增殖與遷移能力。當添加濃度為10 ng/mL時，作用最為顯著[33]。

4.3 END-1

內皮素（Endothelin，END）是一種由內皮細胞生成的生物活性肽，由21個氨基酸組成，其具有3種異構體（END-1，END-2，END-3）。它廣泛存在于包括皮膚在內的大部分組織，是一類促分化劑和細胞生長因子，對細胞內有絲分裂起促進作用。研究發現，內皮素可促進黑色素細胞的成熟與分化[34]。耿建軍等[35]發現適當濃度的END-1可促進羊駝黑色素細胞增殖、樹突增長，并上調細胞內TYR，TYRP1和EDNRB基因表達量，最終使黑色素生成量增加。

4.4 END-3

適當濃度的外源內皮素3（END-3）通過G蛋白偶聯內皮素受體B（ENDRB）與KIT信號通路共同作用，可使黑色素細胞中TYR和MITF的mRNA與蛋白水平的表達量上調，使黑色素生成量增加[36]。

4.5 TGF-β3

研究發現，體外培養的黑色素細胞中添加適當濃度的TGF-β3，可促進黑色素細胞突觸的形成，確保黑色素的運輸。添加不同濃度的TGF-β3，可使MITF，TYR，TYRP2基因在mRNA水平和蛋白水平均不同程度下調，導致黑色素細胞中黑色素的生成量減少[37]。

5 結語

近年來，圍繞羊駝毛色形成的分子機制進行了相關研究，先后發現了決定羊駝毛色的關鍵基因、cAMP/Wnt/TGF-β/MAPK的4條信號轉導通路中的關鍵分子以及細胞外作用因子，同時調控黑色素生成的分子網絡正在逐步形成。

隨著消費水平的逐漸提高，人們對色彩多樣的服裝的需求量也越來越大。動物毛纖維作為人類紡織業重要的原材料，對其質量和數量上均提出較高的要求。然而當今社會絢麗多彩的紡織品主要是通過化學染料的方法來實現的，這類紡織品對身體健康和社會環境均有一定影響，因此引起社會各界的關注，如今更多的人們提出純天然、多色彩毛纖維來替代化學染料。如果可以通過人工干預動物毛色基因的表達從而改變動物毛色，必將產生巨大的經濟價值和社會影響力，這也將是社會發展的趨勢。

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Research Advances of the Molecular Regulation of Hair Color Formation in Alpaca

LI Jiasheng，SUNXiaojiang，BAI Rui，FANRuiwen
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Alpacas,which are the economic hair-producing animals,have 22 natural hair colors.The phenotypes of hair colors are closely determined by the types and amount of melanins produced in melanocyte and transferred to the keratinocytes around,which are mainlydecided bythe genes.For many years,our team has been devoted to the research ofthe molecular regulation ofhair color genes of alpacas.To date,we have found a fewof hair color related genes and its pathway.This paper summarized the advance of the molecular pathwayofhair color related genes and miRNAs.

alpaca;coat color;melanin;regulation gene;miRNAs

S829.9

：A

：1002-2481（2017）06-1044-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.44

2017-03-17

山西省“三晉青年學者”人才專項

李佳晟（1995-），男，山西沁水人，在讀本科，研究方向：動物毛色的形成機制。范瑞文為通信作者。