緊密連接相關蛋白對血腦屏障通透性影響的研究進展

張楠，王思迪，涂盼春，岳英芳，楊智航

（1.沈陽醫學院基礎醫學院臨床醫學專業2013級7班，遼寧 沈陽 110034；2.麻醉學專業2013級2班；3.2012級英文2班；4.2013級6班；5.生理學教研室）

緊密連接相關蛋白對血腦屏障通透性影響的研究進展

張楠1，王思迪2，涂盼春3，岳英芳4，楊智航5*

（1.沈陽醫學院基礎醫學院臨床醫學專業2013級7班，遼寧 沈陽 110034；2.麻醉學專業2013級2班；3.2012級英文2班；4.2013級6班；5.生理學教研室）

血腦屏障作為機體中重要的組織結構，對于維持腦組織的安全及穩定具有十分重要的作用，緊密連接是血腦屏障的重要組成部分，其相關蛋白在維持緊密連接的穩定性和血腦屏障通透性方面同樣至關重要。

緊密連接；血腦屏障；緊密連接相關蛋白

血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）是人體的重要組織結構，是腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障以及由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障。BBB限制血液中的某些物質進入腦，在很大程度上維持了腦組織內環境的基本穩定，這是中樞神經系統發揮正常生理調控功能的保證。腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）及細胞間的緊密連接（tight junctions，TJs）是構成BBB的主要結構［1］，TJs是由相鄰細胞膜外層通過特異性的跨膜蛋白彼此融合構成的閉鎖結構，位于BMECs間，主要由跨膜蛋白（閉合蛋白Claudins家族、咬合蛋白Occludin家族、連接黏附分子JAMs）、胞質附著蛋白ZOs家族、細胞骨架蛋白（F-actin）等多種蛋白構成。TJs調控的細胞旁途徑和caveolae介導的跨細胞途徑可以調節BBB的通透性［2］。緊密連接相關蛋白的結構、分布和表達水平的變化，都將導致TJs的開放或關閉，從而改變BBB的通透性。本文旨在探討緊密連接相關蛋白對BBB通透性的影響。

1 緊密連接相關蛋白的分類及組成

1.1 跨膜蛋白

1.1.1 閉合蛋白Claudins Claudins蛋白是含有4個跨膜區域和2個細胞外環的跨膜緊密連接蛋白，相對分子質量為20～27 kDa，其跨膜或胞質部分決定緊密連接絲的構建，與細胞外結構域無關，相鄰細胞膜中Claudins的細胞外環可以相互作用，從而封閉細胞間隙，這也是TJs的形成和離子通透選擇性的原因之一［3］。Claudins蛋白在維持組織結構和功能中起到關鍵作用，它的異常表達可能造成TJs的改變，從而導致各種相關疾病的發生發展［4］。

目前至少已發現Claudin家族的24個成員，其中Claudins-3、5、12在腦毛細血管內皮細胞中高表達［5］，Claudin-5/TMVCF參與形成TJs，進而構成BBB，這在維持中樞神經系統穩態方面是至關重要的，但是這種高度選擇性分子界面也限制了藥物對神經退行性變性和神經系統疾病的干預治療［6］。在體實驗和體外實驗證明，特定產氣莢膜梭菌腸毒素的突變片段綁定到Claudin-5，可以調制的大腦血管滲透性［3］。

1.1.2 咬合蛋白Occludin Occludin是緊密連接相關蛋白中最具有代表性的蛋白質之一，直接參與TJs的屏障功能和柵欄功能。它的相對分子質量約60 kDa，有2個細胞外環和4個跨膜區域，其中第1個細胞外環和羧基端在不同種屬間有高度同源性，相鄰細胞間的環狀結構可彼此作用于封閉細胞旁空間。Occludin的氨基端和羧基端均位于胞質內，氨基端對TJs的裝配和屏障功能的保持起重要作用，羧基端與ZO-1蛋白直接相連，與ZO-1一起調節TJs的結構變化，對Occludin蛋白在TJs間的定位及細胞間的通透性調節具有重要作用。Occludin蛋白的移動范圍主要是在細胞內，在細胞黏附和細胞調節等方面具有關鍵作用。有研究表明作為 BBB典型結構的Claudin、ZO-1、Occludin均勻分布在腦實質和腦血管的不同部分［7］。目前大多數學者認為Occludin的表達水平下降可能引起TJs的開放，增加BBB通透性。Diaz等［8］研究發現，局部缺血缺氧可以誘導Occludin表達水平下降，同時伊文思藍溢出進入大腦實質，證實了BBB功能障礙，通透性增加。

1.1.3 連接黏附分子JAMs JAMs屬于免疫球蛋白超家族成員，不僅在TJs部位上表達，也可以表達于白細胞和血小板。JAMs有JAM-1、2、3、4等4種類型，其中血管內皮細胞主要表達JAM-1、JAM-2和JAM-3，而JAM-1在BMECs高表達［9］。

JAM-1是細胞連接形成過程中首先出現在細胞間接觸位點的分子，能募集其他蛋白以啟動TJs形成［10］，在穩定細胞連接結構和降低旁細胞通路通透性方面發揮作用，且TJs完整性被破壞與JAM-1表達的降低有關［9，11］。此外，JAM-1還可以調節TJs的重裝。研究發現在使用抗JAMs單克隆抗體后，不僅難以將JAM-1組裝到TJs上，同時也阻斷了Occludin的重新分布，從而阻礙了上皮屏障功能的恢復［11］。

1.2 胞質附著蛋白ZOs ZOs屬于膜相關鳥苷酸激酶（membrane-associated guanylate kinase，MA GUK）家族，是第1個被證實的TJs附著蛋白，主要有ZO-1、ZO-2和ZO-3 3個亞型，3個亞型所含區域相同，均有3個PDZ區域，1個SH3區域和1個GUK區域。ZOs家族在胞質內具有多個結合位點，并與Occludin的羧基端及Claudins相互作用，將跨膜蛋白和細胞骨架連接起來，進而發揮傳遞信號的作用，形成穩定的連接系統。

1.2.1 ZO-1 ZO-1是構成TJs的主要蛋白之一，沿著細胞膜連續分布，其表達水平的高低與BBB的開放程度相關，其相對分子質量約220～225 kDa，在胞漿內具有許多結合位點，多數位于上皮細胞和內皮細胞的細胞膜相接觸的TJs處，少數存在于非上皮細胞黏附連接內層的細胞質中。ZO-1蛋白作為細胞間TJs復合體的重要結構蛋白之一，一方面連接跨膜蛋白，另一方面與TJs細胞內的細胞骨架連接，起到細胞間連接樞紐作用。ZO-1的磷酸化調控是決定BBB血管通透性的至關重要的因素［12］。

1.2.2 ZO-2 ZO-2與ZO-1以復合物的方式定位于TJs的胞漿側，共同參與組成基因表達和細胞功能的信號傳導通路［13］，相對分子質量約為160 kDa，具有一個含有豐富精氨酸的區域，存在于PDZ1和PDZ2之間。ZO-2與ZO-1兩者具有較高同源性，尤其在MAGUK保守區域，但是ZO-2僅存在于TJs部位，而ZO-1則廣泛分布。

1.2.3 ZO-3 ZO-3相對分子質量約130 kDa，定位于TJs部位，在PDZ1和PDZ2部位富含精氨酸，在PDZ2和PDZ3之間存在一個富含脯氨酸區域。有研究表明，抑制Src活性可以降低Occludin的酪氨酸磷酸化，通過與ZO-1和ZO-3的相互作用提高BBB的通透性［14］。

1.3 細胞骨架蛋白F-actin F-actin蛋白相對分子質量約42 kDa，通過與胞質附著蛋白連接，進而與TJs跨膜蛋白結合，即ZO-1蛋白連接F-actin與Occludin蛋白及Claudins-5蛋白，是TJs復合體不可缺少的部分，是TJs形成胞旁屏障的重要因素之一，對于維持TJs的穩定性具有重要作用。有研究表明冰片能夠通過下調ZO-1和F-actin表達水平，選擇性的開放血腫瘤屏障，增加其通透性［15］。另有研究表明，氧化應激能導致F-actin重新聚合形成張力絲，從而增強BBB的通透性［16］。

上述緊密連接相關蛋白之間彼此存在復雜聯系，不僅作用于TJs，維持其完整性，還為腦內皮組織提供結構支持，如果這些蛋白發生表達紊亂將直接影響TJs的完整性，從而改變BBB的功能。

2 緊密連接相關蛋白的功能

TJs構成了離子與分子通過細胞旁途徑跨膜轉運的屏障，是保持BBB完整性的重要因素之一，功能主要為屏障作用與柵欄作用，即形成極窄的細胞間粘連，以遮擋細胞外空間和創建可調的分子選擇性篩孔。緊密連接相關蛋白在其作用功能中發揮至關重要的作用。

2.1 屏障功能 上皮細胞和（或）內皮細胞屏障的關鍵成分就是細胞間的連接點，即TJs，其通透性與不同物質的大小、脂溶性及離子所帶電荷有關。BBB細胞排列緊密，常用跨膜電阻（transepithelial electrical resistance，TER）作為衡量其通透性的敏感指標，還能用來比較和監視屏障細胞層的形成和調控［17-18］。TJs鏈是阻塞細胞外空間的基本結構單位，TJs平行鏈的數目與TER之間也存在著密不可分的聯系。

2.2 柵欄功能 Occludin蛋白和Claudins蛋白像柵欄一樣鑲嵌在脂膜上，在脂膜的頂膜和底側膜區域形成邊界，限制該區域的脂質和蛋白的橫向移動，調節細胞旁途徑的通透性［19］。TJs沒有完全的密封，具有選擇透過性，在細胞外的連接部分包含著一定數量的離子選擇性孔，發揮選擇性運輸功能。

3 TJs的調節

3.1 滲透壓對TJs的調節 甘露醇是臨床上常用的滲透性利尿劑和脫水劑，可以有效地降低顱內壓，其作用機制是增加滲透壓，使BMECs暫時脫水，構成BBB的細胞體積縮小，間距增寬，其結果是TJs開放，BBB通透性升高。有臨床研究表明，應用25%的甘露醇，利用其高滲作用，促進干細胞通過BBB，進而治療慢性腦卒中［20］。

3.2 PKA對TJs的調節 有研究胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）對BBB體外模型的作用發現：GLP-1能夠增加Occludin和Claudin-5的含量，屏障作用增強；而應用GLP-1受體阻斷劑exendin-3（9-39）和PKA阻斷劑H89時，屏障作用顯著降低，提示GLP-1可能通過cAMP/PKA信號傳導，上調緊密連接相關蛋白，穩定BBB的完整性［21］。

3.3 PKC對緊密連接相關蛋白的表達及屏障功能的調節 蛋白質的功能可以通過結構域的不同修飾產生特異性的變化，磷酸化修飾是其中重要的一種形式，主要集中在肽鏈中的絲氨酸、酪氨酸、蘇氨酸殘基上，可使上述殘基上不帶電荷游離的羥基帶電荷，引起結構改變，調節蛋白質的活性和功能。PKC是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究表明PKC參與ZO-1、Occludin和Claudin-5的磷酸化修飾，誘導其由細胞膜上向細胞質內重新分布，調節TJs的通透性［22］。

3.4 RhoA-ROCK對TJs的調節 Rho蛋白屬于小G蛋白超家族的亞家族成員，有RhoA、RhoB、RhoC三種異構體。ROCK即Rho激酶，屬于絲/蘇氨酸激酶的一種，有ROCK1和ROCK2兩個亞型，其中ROCK1主要參與機體的免疫調節，ROCK2則參與調節內皮和血管平滑肌的功能。研究發現，人類免疫缺陷病毒-1型反式轉錄激活因子（HIV-1 Tat）可使Occludin蛋白和mRNA表達下調，導致BBB破壞，而阻斷Rho/ROCK信號傳導通路可抑制HIV-1 Tat誘導BBB破壞作用［23］。膜聯蛋白A1可以通過抑制RhoA-ROCK信號通路，修復Aβ1-42誘導的BBB破壞［24］。可見，RhoAROCK信號通路的激活，能夠引起TJs蛋白磷酸化反應，使TJ開放，破壞BBB的完整性。

4 問題與展望

TJs作為維持體內BBB完整性的重要結構和功能基礎，在應用藥物后，緊密連接相關蛋白含量的下降、緊密連接通道的開放對于中樞神經系統疾病的治愈具有重要作用，但目前尚未發現能夠有效應用于臨床治療的此類藥物。雖然在緊密連接相關蛋白調節開放BBB的過程中還存在許多未知，但相信在未來，通過人們的不斷實驗和探索，緊密連接相關蛋白影響BBB的研究能夠進一步完善。

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（文敏編輯）

Research Progress of Roles of Tight Junction Proteins Involved in the Permeability of Blood-Brain Barrier

ZHANG Nan1，WANG Sidi2，TU Panchun3，YUE Yingfang4，YANG Zhihang5*

（1.Grade 2013，Class 7，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Grade 2013，Class 2；3.Grade 2012，Class 2；4.Grade 2013，Class 6；5.Department of Physiology）

As one of the important organization structure，the blood-brain barrier（BBB）is essential for maintaining brain homeostasis.Tight junctions form the basis structure of BBB to limiting paracellular permeability.This review summerizes the constituentsoftightjunction proteins and its role in the regulation oftightjunction.

tight junctions；blood?brain barrier；tight junction proteins

R338.25

A

1008-2344（2017）01-0072-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.01.023

2016-08-01

遼寧省科技廳自然科學基金項目（No.2015020370）；遼寧省大學生創新創業訓練計劃項目（No.乙類1163）；沈陽醫學院科技基金項目（No.20131001）

楊智航（1976—），男（漢），博士，副教授.研究方向：選擇性開放血腦屏障的病理機制.E-mail：18940209532@163.com