雙孢蘑菇培養料微生物的研究概況*

郭仲杰

（福建省農業科學院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州350014）

雙孢蘑菇培養料微生物的研究概況*

郭仲杰

（福建省農業科學院食用菌研究所 特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福建 福州350014）

文章對國內外學者對雙孢蘑菇培養料發酵過程中微生物及其活動狀況的研究成果進行了綜述，總結了各種研究技術的優缺點。

雙孢蘑菇；培養料；微生物

雙孢蘑菇[Agaricus bisporus (J.E.Lange) Imbach]，又稱雙孢菇、蘑菇，是世界上人工栽培、消費最廣泛的食用菌，具有重要的經濟價值[1-3]。雙孢蘑菇是一種草腐生食用菌，沒有葉綠體，生長慢，菌絲不能直接利用纖維素，農作物秸桿必須經過堆制發酵才能被利用。培養料堆制發酵是在一定的環境條件下，由原料自身或空氣中所帶有的微生物的生長代謝而引發的一種高溫、好氧的固體發酵過程[4-5]。在該過程中，通過培養料中微生物的生長代謝活動，培養料發生了降解、轉化，改變了培養料的理化性質和生物學特性，從而制造出一個高度適合雙孢蘑菇菌絲生長的選擇性基質[6-7]。雙孢蘑菇培養料發酵過程中，微生物的生長繁殖活動是培養料發酵質量檢測的一個重要指標[8]。多年來，國內外學者對于培養料中微生物進行了比較詳細的研究。

1 微生物情況

1962年，Bels-koning在實驗室及商業蘑菇栽培過程中首先觀測到了嗜熱霉菌與培養料的關系，發現凡長有較多的黑腐質霉菌H. nigrescens的培養料有較高的產量，提出用黑腐質霉菌作為判定培養料發酵成熟度的指示性霉菌。緊接著Pope等用從培養料中分離的菌株嗜熱真菌作堆制能力試驗，結果發現：青霉（Penicillium），Anixia和毛霉（Mucor）具有很好的堆制發酵能力，色串孢屬、腐質霉屬、Monotospora和毛殼霉屬也具有一定的堆制發酵能力，從而提出：可以選用一些嗜熱真菌應用到培養料的堆制發酵中，以縮短堆制的時間，提高發酵的質量[9]。Wiegant以嗜熱色串孢為模型，研究了嗜熱真菌對蘑菇生長的促進機制，發現嗜熱色串孢代謝為蘑菇生長提供了一個合適的CO2濃度，可刺激菌絲盡早萌發吃料，提高在培養料中的分布面積并抑制病原菌滋生。Gribbe指出，馬廄肥在發酵期間，通過嗜熱微生物把很高比例的總氮固定在腐殖質和木質素的碎片上，在堆制結束時，這2種碎片占總有機質的60%～70%，是蘑菇生長的重要營養來源[10]。

1980年，Eicker從堆肥中分離出44種中溫菌、藻狀菌、柱孢犁頭霉、大毛霉、美麗枝霉、牟勒氏接霉（Zygorynchus moelleri）構巢曲霉（Aspergilus nidulans）和酵母等。短梗帚霉（Scopulaviopsis brevia）、頂孢霉屬（Acremonium spp.）匍匐曲霉（Aspergillus repens）、皺曲霉（A. rugulosus）、枝孢霉屬（Cladosporium spp.）、彎孢霉（Curoulaia lunata）等發現的頻率很高。1989年曾云中等、2000年、2003年姜成等分別從雙孢蘑菇培養料中分離到放線菌和絲狀真菌，研究表明它們對增進培養料發酵作用。2010年劉燦等發現雙孢菇培養料中的微生物數量大小順序依次為：細菌＞放線菌＞霉菌，并且都呈先減少后增加的趨勢。

培養料發酵過程中發揮作用的微生物主要是細菌、放線菌，絲狀真菌等。培養料中微生物的來源是來自原料農作物秸桿、禽畜糞中依附的大量的微生物種群，如在稻草莖葉表面，每克干稻草有高溫細菌105個。培養料發酵開始后，一些中溫型的微生物開始生長繁殖，在新陳代謝過程中產生熱量使料溫逐漸升高，其后一些嗜熱型的微生物又開始繁殖。在培養料溫度為40～60℃，這時起作用的是嗜中溫型產芽孢和不產芽孢的細菌。隨著料溫的升高，演變成嗜熱的放線菌、單孢菌和假單孢菌在起作用。二次發酵期間，主要是嗜熱鏈霉菌屬(Streptomyces)和耐腐殖霉菌屬等占主導地位。

在整個培養料發酵過程中，不同類群微生物相互之間發生著密切的聯系。它們之間相互影響，相互作用。這些在Stanek培養料微生物試驗研究中得到了充分的驗證。Stanek在以纖維素或葡萄糖為唯一碳源的分離培養基上進行的試驗中發現：能分解纖維素的放線菌總伴隨著耐熱細菌。這些耐熱細菌不能分解纖維素或者分解的能力很弱，但它們的存在能加強放線菌的分解能力，2者相互促進生長，2者混合物又能刺激蘑菇菌絲的生長。單獨使用放線菌進行培養料的堆制發酵試驗易污染，而用2者混合物進行培養料的堆制發酵則蘑菇的菌絲生長發育良好，不易受其他競爭性真菌的污染。

不同微生物參與不同原料的分解，使大分子化合物降解轉化為簡單的小分子化合物，消耗掉易被競爭性所雜菌利用的簡單糖類，同時釋放出料內有利于蘑菇生長發育的無機鹽，留下死亡的菌體。微生物在其生長繁殖過程中產生很多次級代謝產物，是雙孢蘑菇生長所需要的生長因子，如已經發現腐質霉菌產生VB1，嗜熱放線菌產生泛酸、生物素、煙酸和硫胺素等。1981年Carapiet發現，嗜熱真菌和細菌能把氨態氮轉化為有機蛋白，其死亡菌體可以作為一種天然的緩釋營養物質，是雙孢蘑菇生長的重要生物養料來源。

2 研究方法

微生物形態簡單、個體微小、種類繁多，缺乏明顯外部特征的微生物由于缺少明顯的表型特征，且其表型會因培養條件或其他處理方法而變化，各種研究獲取的信息十分有限。微生物的研究方法通常分為兩大類:傳統研究方法及現代生物化學和分子生物學研究方法。近幾十年，國內外學者通過傳統研究方法，雖然從雙孢蘑菇培養料分離鑒定了不少菌株，但是仍然無法全面了解發酵過程中微生物活動機理。近年來，由于現代科研裝備和技術的發展，特別是分子生物學研究領域的飛速進步，更多、更先進的微生物生態學研究方法被發明創造出來，極大地推進了微生物系統的研究。

微生物的傳統研究方法，直到現在仍然是微生物學研究中常用的、不可或缺的方法。傳統方法主要采用一定配比的培養基和固定的培養溫度，通過分離純化和培養選育，對微生物的種群與群落多樣性進行研究。微生物傳統培養方法的缺點是操作繁瑣，受到微生物分類的限定且有較大誤差，不能檢測到那些尚未能培養的微生物。分離、培養的方法采用一定配比的培養基和固定的培養溫度，忽略了環境變化和生物相互作用的影響，具有明顯的人工選擇性。由于分離、培養法具有選擇性，這種人工環境與原生境的偏差使得可培養的種類大大減少，很有可能遺漏一些有意義的微生物，制約了人們對微生物學機理的深入了解。

現代生物化學和分子生物學的方法，可以揭示微生物種類和遺傳的多樣性，并給出關于群落結構的直觀信息。現代生物化學方法，如細胞壁、脂類、醌類和ATP分析等；分子生物學技術是通過檢測樣品中微生物特定的DNA或RNA片段來判斷某種微生物的存在與否。自從Muyzer等首次報道了16SrDNA應用，該技術現已成為微生物多樣性研究的重要工具[11]。

生物醌技術，微生物醌是能量代謝過程的電子傳遞體，不同的微生物含有不同種類和分子結構的醌。因此，樣品中微生物醌的組成，即醌指紋可在一定程度上反映微生物的群體結構。在一定條件下，微生物醌的含量相對穩定，故可利用微生物醌測定環境中的活性微生物的濃度。同時，根據微生物醌的摩爾組成還可計算出微生物的多樣性和微生物種分布均勻性2個指標。

生物標志物方法，生物標志物通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應生物量呈正相關。由于特定結構的標記物標志著特定類型的微生物，因此一些生物標記物的組成模式可作為指紋估價微生物群落結構。測定時，首先使用合適的提取劑提取環境微生物樣品中的這些化合物并加以純化，然后用合適的溶劑制成合適的樣品用GC或LC檢測，最后用統計方法對得到的生物標記物譜圖進行定性定量分析。

磷脂脂肪酸譜圖分析方法，原理基于磷脂幾乎是所有生物細胞膜的重要組成部分，細胞中磷脂的含量在自然條件下(正常的生理條件下)恒定，其長鏈脂肪酸的形式—磷脂脂肪酸可作為微生物群落的標記物。此外，磷脂不能作為細胞的貯存物質，在細胞死亡后會很快降解，可以代表微生物群落中“存活”的那部分群體。磷脂脂肪酸譜圖分析方法適合跟蹤研究微生物群落的動態變化。

16S/18S rRNA/DNA序列分析技術，由環境微生物樣品總DNA的提取、引物與探針的設計、聚合酶鏈式反應（PCR）擴增、遺傳指紋技術、16S rRNA基因（rDNA）克隆文庫的構建、序列測定、序列分析與系統樹構建、核酸雜交等一系列技術組成，包括了單鏈構象多態性、限制性片段長度多態性、隨機擴增多態性DNA技術、擴增片段長度多態性和變性梯度凝膠電泳等方法。16S/18S rRNA/DNA序列分析技術不需要微生物進行分離培養，能夠動態地研究微生物群落的多樣性，真實反映微生物的生存狀態。隨著核酸序列數據庫的不斷補充和完善，可以實現對復雜環境微生物快速、微量、準確、簡便的分類和檢測。

基于16S/18S rRNA/DNA序列分析技術的PCRDGGE/TGGE法，變性梯度凝膠電泳，1993年，Muyzer首次將其就用于微生物群落研究，后來又發展出溫度梯度凝膠電泳（TGGE），現在被廣泛用于微生物分子生態學研究的各個領域，是主要的分子生物學方法之一。該技術具有可靠性、可重復性、快速和容易操作等特點，缺陷是在PCR過程會產生偏差，分離的DNA片段小，反映的信息少；條件不適宜，就不能保證將有一定差異的DNA片段完全分開，產生錯誤的信息。國內有何麗鴻等運用采用變性梯度凝膠電泳研究雙孢蘑菇培養料后發酵過程中的細菌群落結構，雙孢蘑菇培養料中的細菌組成要遠遠豐富于人們用傳統的分離方法所獲得的類群，恒溫階段的培養料中不僅檢測到了前人用經典培養方法獲得的Bacillus屬嗜熱細菌,還發現了一些未曾報道的Bacilli門的成員。

原位雜交技術，以熒光染料標記的16S rDNA和16S rRNA寡核苷酸序列作為探針，按照2個核酸的堿基序列互補原則，將標記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上，由于與熒光素分子偶聯的單克隆抗體和探針分子特異性結合，能激發雜交探針的熒光信號，通過熒光檢測系統和圖形分析技術對染色體或DNA纖維上的DNA序列進行定位、定性和相對定量分析，就能實現原位樣品中的目標微生物的探測。

目前，雙孢蘑菇培養料微生物的研究仍然主要依賴于分離、培養的傳統方法。通過先進的現代分子生物學技術的應用，可以深入地了解雙孢蘑菇培養料發酵過程中微生物群落的變化規律，推動培養料中有機物降解轉化的理論研究，為堆制發酵技術的發展提供支持。今后雙孢蘑菇培養料中微生物的研究主要內容是進一步掌握培養料中微生物生長的規律，傳統方法與現代分子生物學先進技術并舉，多種分析研究手段組合運用，結合培養料發酵動力學模型研究出雙孢蘑菇培養料發酵的最優化控制參數，為雙孢蘑菇產業持續穩定發展作出新的更大貢獻。

[1] P.J.C.維德. 現代蘑菇栽培學[M]. 北京：輕工業出版社，1984.

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10.3969/j.issn.1007-550X.2017.02.002

S646.9

A

1007-550X（2017）02-0043-04

福建省科技廳公益類項目（2014R1020-6），“十二五”國家科技支撐計劃“東南地區農牧廢棄物多級循環利用技術集成與示范”(2012BAD14B15-401)。

2017-01-17

郭仲杰（1974-），男，高級工程師，主要從事食用菌遺傳育種及栽培技術的研究，E-mail：550410857@qq.com