單細胞測序技術及其在腫瘤研究和臨床診斷中的應用

周瑩黃華藝，2★

單細胞測序技術及其在腫瘤研究和臨床診斷中的應用

周瑩1黃華藝1，2★

腫瘤組織的異質性是腫瘤的一個重要特征。腫瘤細胞均一性的缺乏使得腫瘤靶向治療的難度加大。因此，鑒別腫瘤細胞的異質性是一個重要工作。單細胞測序技術（single-cell sequencing，SCS）是通過下一代測序手段觀察單個細胞的基因組序列信息，從而獲得細胞間遺傳物質和蛋白質信息的差異，因此能夠更好地理解單個細胞在其微環境中的功能。通過對單個腫瘤細胞全基因組、轉錄組以及細胞表觀遺傳基因進行測序，瘤內異質性的復雜機制可被揭示，從而改善腫瘤診斷、轉歸預測和治療效果的監測。本文對單細胞測序技術的發展、檢測原理和檢測流程、存在的問題及其在腫瘤研究中的應用以及該技術在臨床上的潛在價值進行了概述。

單細胞測序；下一代測序；基因組；腫瘤；異質性

腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，遺傳物質受損導致對特定細胞失去正常生長調控，繼而引起其克隆性異常增生。惡性腫瘤細胞通過對自身不斷“改良”，可以產生許多基因突變和致病性表型，以適應宿主體內復雜的腫瘤微環境，甚至腫瘤內的單個細胞組織表現出獨特的表型，即瘤內異質性（intratumoral heterogeneity）［1］。這代表著不同的腫瘤細胞之間致病潛力存在差異，其中某些細胞可能造成更大的威脅，具有更強的轉移或侵襲能力或者更容易產生耐藥性。然而，對于腫瘤細胞亞群分子層面的數據，尤其是對細胞異質性的信息挖掘和認識仍然非常有限。

細胞異質性是腫瘤研究和診斷治療中亟待解決的關鍵問題，單細胞測序技術（single cell sequencing，SCS）是一種理想的研究腫瘤復雜性的方法。通過獲取特定階段的單個腫瘤細胞的動態基因組（deoxyribonucleic acid，DNA）、轉錄組（ribonucleic acid，RNA）數據以及細胞表觀遺傳信息，可用于構建與腫瘤發生、發展和轉移以及產生耐藥性等機制相關的遺傳圖譜，為臨床探索有價值的診斷或預后生物標志物以及分子治療靶標［2］。在這篇文章中，我們將對SCS技術進行介紹，并對其在單個細胞的腫瘤活檢以及液體活檢中的應用進行總結。

1 單細胞測序技術簡況

測序技術經歷了低通量到高通量的時代變革，能夠對幾十萬到幾百萬條DNA分子同時測序，每個運行可精確讀出數以千億計的堿基，從而實現快速、高效、低成本的基因組測序。受益于測序技術的發展，對細胞的分子研究逐漸由混合細胞群樣本發展到單個細胞樣本。下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術的發展為實現全基因組單細胞測序（genome-wide single-cell sequencing）提供了新的可能［3］。2009年研究人員采用mRNA全轉錄組測序方法（mRNA-Seq wholetranscriptome analysis）對小鼠單個四細胞期胚胎的卵裂球轉錄組進行單細胞水平分析，其技術革新使全長互補DNA序列（complementary DNA，cDNA）的捕獲率提高到64%，同時在cDNA擴增時放寬對片段長度的限制［4］。2011年由Cold Spring Harbor實驗室和MD Anderson癌癥中心開發并報道的一種腫瘤研究新方法SCS技術，能夠對一個單細胞核中基因拷貝數目進行準確定量［5］。腫瘤細胞基因組部分被刪除或者擴增，可以引起關鍵基因的缺失或者表達過量，繼而干擾正常細胞生長。利用SCS技術能分析基因拷貝數目，從而進一步了解惡性腫瘤的細胞生物學機制。同時該方法解決了傳統癌癥基因組研究的一系列問題，如混合樣品測序無法判斷具體突變的來源及發生頻率；無法解釋腫瘤發生、發展以及演化過程中的細節；難以辨別主動突變或被動突變；目的細胞系測序時無法排除體外培養所導致的新突變干擾等［5］。2013年，研究人員首次利用腫瘤病人單個外周血循環腫瘤細胞（circulation tumor cell，CTC）進行全基因組、外顯子組測序，為無創腫瘤診斷和監測提供了一種新的技術手段［6］。

2 單細胞測序技術的原理

單細胞測序主要包括單細胞基因組測序、轉錄組測序和表觀遺傳測序，這3種測序類型各具特點和優勢，可以從不同角度揭示細胞各個階段的功能和特性。全基因組測序是對目的細胞的全部基因組序列進行非選擇性、均勻擴增，隨后利用外顯子捕獲技術進而使用高通量測序的過程。轉錄組測序則是獲取特定器官或組織在某一狀態下的幾乎所有轉錄本，尤其適用于具有高度異質性的干細胞及胚胎發育早期的細胞群體的研究。以NGS為基礎的各種表觀遺傳學測序可揭示基因調控的不同方面，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質結合結構和調節蛋白、染色體的空間結構與空間相互作用形成轉錄復合物的組分［7-9］。表觀遺傳改變是可逆的，并決定基因表達和負責細胞的異質性。

3 單細胞測序技術的流程

細胞測序主要涉及4大步驟，包括單細胞分離、核苷酸序列（DNA或RNA）擴增、基因測序和數據分析。

3.1 單細胞分離

進行單個細胞研究，首先要將目的細胞從生長環境中完整分離。第一類是基于細胞培養的分離法，此類方法無需特殊設備、成本低廉，屬于非直觀下分離細胞。但存在操作耗時、低通量，易造成分離錯誤或細胞丟失、不能靶向篩選細胞等弊端。第二類則是基于儀器的分離法，儀器方法可到達更高的精確度和細胞獲取率，目前在科研和實際工作中普遍采用此類方法進行細胞分選。

我們對一些比較成熟的和新發展的儀器分離技術進行介紹，并概述其優點和局限性，實際工作中可根據具體的需求來選擇適合的方法進行單細胞分離。顯微操作法是應用較普遍的直視分選細胞技術，成本較低。但受通量低、人力投入大、容易對目的細胞造成機械性損傷等因素的制約，不利于大規模應用和商品化。另一個直視分離技術是激光捕獲顯微切割術（laser capture microdissec-tion，LCM）通過利用激光束使覆蓋于組織切片上的透明膜熔化，冷卻后目的細胞被固定于黏附膜上，從而實現細胞分離。該方法的優勢在于能夠在顯微鏡下準確而快速地獲取單一細胞亞群或者單個細胞，解決了組織中細胞異質性的問題。但是存在成本較高、通量低、不能自動化的缺點。此外，LCM的技術缺陷還包括操作過程中細胞核容易被刨切而導致染色體片段丟失；精確度有限，切割過程中可能會摻入相鄰細胞的原生質組分或損傷細胞核，而且其RNA多已降解，因此不適用于轉錄組學分析［10］。

目前單個腫瘤細胞分離通常是通過磁珠激活細胞分選（magnetic-activated cell sorting，MACS）或熒光激活細胞分選（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技術進行。這兩種分離方法的成本較高，但是能滿足高通量、自動化的要求。免疫磁珠分離法（immunomagnetic separation，IMS）屬于MACS技術，即利用細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結合。在外加磁場中，與磁珠相連的帶有表面抗原的細胞被吸附而滯留在磁場中，不能與磁珠連接的細胞不在磁場中停留，從而使目的細胞得以快速分離［11］，但操作方法相對復雜。

熒光激活細胞分選技術是目前應用最多的單細胞分離方法，可對單個細胞進行高效和快速分離。FACS平臺通過依靠熒光標記信號結合光散射分析參數，對具有異質性的腫瘤組織的單個細胞進行挑選和分析。該法不僅具備高通量的優勢，而且可對具有不同表征（如大小、粒度、特異性抗原標記、同位素標記等）的靶細胞進行識別和分離［12］。其最大的缺陷是分選時需要大量的細胞，因此在制備大量細胞懸液的過程中可能降低低豐度細胞的獲取率；同時FACS所檢測的熒光信號相對較低，部分低表達的標記可能檢測困難，存在特定細胞類型丟失的風險；此外，細胞的高速流動可能造成機械性損傷。

另一個新發展的微流控技術（microfluidics）則是通過人為控制流體流動來實現在微尺度上對目的細胞進行分離，主要利用流控通道具備的多種功能對細胞進行分選，如通道本身具有可調節的直徑（10～100 μm）和多種功能性修飾（如捕獲分子、抗體、電極等）。同時微流控裝置的細胞污染率低，對樣本和試劑損耗少，并且在降低單細胞測序的噪聲以及提高基因組擴增一致性方面具有優勢，已有相應的商業化平臺在推廣應用［13］。

3.2 核苷酸序列（DNA或RNA）擴增

一個正常的二倍體人體細胞的DNA和RNA含量為匹克（picogram，pg）水平［14］，因此SCS技術面臨的主要技術挑戰是單個細胞的DNA或RNA含量遠遠低于目前任一可用測序平臺的檢測閾值。為了克服這種局限性，必須對要檢測的單細胞中分離的核酸進行放大。同時在建庫時的文庫分子僅有少量可在Floecell表面生成簇，并被測序檢測到，因此至少要有上萬倍到幾十萬倍的擴增效率，才能保證大部分的片段可被檢測到，并且滿足覆蓋度高和低偏倚的要求。因此在測序之前，需要進行全基因組核苷酸擴增（genome-wide nucleotide amplification），包括全基因組擴增（wholegenome amplification，WGA）和全轉錄組擴增（whole-transcriptome amplification，WTA）。

3.2.1 全基因組擴增（WGA）

其目標是在沒有序列偏向性的前提下大幅增加DNA的總量。一些基于PCR的方法可用于WGA，主要包括：基于熱循環以PCR為基礎的擴增技術，如退行性寡核苷酸PCR（degenerative-oligonucleotide PCR，DOP-PCR）；基于等溫反應不以PCR為基礎的擴增技術，如多重置換擴增法（multiple-displacement-amplification，MDA）以及基于多重退火環狀循環擴增法（multiple annealing-and looping-based amplification cycles，MLBAC）。

DOP-PCR是SCS最初常用的技術，由于會產生非特異擴增且擴增效率不高（15%），因而應用受限［15］。MDA作為最常用的技術一直沿用至今，能對全基因組進行高保真的均勻擴增，擴增出10～100 kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。主要依賴于兩種類型的DNA聚合酶，包括phi29 DNA聚合酶和Bst大片段DNA聚合酶。不僅可以結合由單引物啟動的滾環擴增反應所產生的串聯產物，也可以使新合成DNA片段位移替換之前的DNA片段，形成一種反復分支結構，進而引起鏈位移擴增出大段的DNA。MDA與基于PCR的傳統WGA方法相比，其優勢包括Phi29DNA聚合酶具有在較低和恒定的溫度條件下催化DNA延伸反應、可加工較長擴增產物和高效率擴增的能力。MDA采用的是指數擴增法，可以實現從單個細胞基因組或外顯子組中獲得較高的覆蓋度（＞90%）。但是MDA也存在一些缺點，特別是顯著的非特異性擴增。另外就是全基因組覆蓋度不均勻；等位基因丟失率高（可高達65%）；污染或干擾；隨機引物與模板結合能力差異導致的擴增偏倚［16-17］。針對MDA潛在的污染問題（包括外源性或交叉污染），目前主要采取的改進措施是將熒光標記（例如SYBR Green）摻入反應體系中，以便對擴增過程進行可視化的熒光監測。該技術已成功應用于腫瘤單細胞測序［16-18］；另一項極具創新性的技術MALBAC是由哈佛大學謝曉亮團隊研發［3，19］。與以前的技術相比，MALBAC的最大優勢是采用線性擴增方式。其核心技術在于通過五輪MDA預擴增得到完整擴增產物；增加退火步驟達到鏈內雜交自我鎖定，形成閉合的環狀分子，避免指數擴增；再通過常規PCR進行擴增。由于此時的模板更加均一，則可達到低偏倚的目的。MALBAC技術將單細胞全基因組測序的精確度大幅度提高，以至于能夠發現個別細胞之間的遺傳差異。在25×測序深度下，MALBAC的覆蓋度可達93%，而MDA覆蓋度為73%，因此其在WGA中顯示出擴增一致性好、偏倚少、效率高的特點。另外，MALBAC對單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）等位基因檢出率高（可達70%），能精確地檢測拷貝數變異（copy number variations，CNVs）、單核苷酸變異（single nucleotide variations，SNVs）、插入/缺失（insertions and deletions，INDELs）變異等。其缺點則是可能出現較高的假陽性率［20］。MDA和MALBAC技術各有特點，MDA擴增效率更高，實驗方法簡單，而MALBAC則擴增均一性更好，但擴增DNA的量相對較少，即擴增效率相對較低。

3.2.2 全轉錄組擴增（WTA）

多聚腺苷酸化mRNA在WTA初始階段反轉錄，以Oligo-dT引物連接到一個接頭序列去進行選擇性擴增。通過Oligo-dT錨定法和模板轉換法產生cDNA為下一步測序做準備。目前采用的WTA主要基于傳統PCR、改良PCR（modified PCR）、體外轉錄（in vitro transcription，IVT）以及Phi29 DNA聚合酶介導的RNA擴增方法［21-22］。

3.3 基因測序數據的生物信息分析

對高通量數據的精準解讀是基因測序和精準醫療的關鍵。單細胞數據分析的基本流程與傳統序列分析相似，數據分析前首先要移除接頭序列（adapter）、連接序列（linker）、標簽序列（barcodes）、低質量堿基和污染DNA。然而兩者間具有顯著差異，傳統拼接方法是建立在一定的假設之上，如嵌合序列比例較少，讀取深度隨基因組呈泊松分布等。而單細胞數據由于表現出不均勻的覆蓋度和高比例的嵌合序列，則需要采用不同的分析方法進行數據預處理。一種方法是通過實驗方法或計算機算法將核酸文庫“標準化”，以降低擴增偏倚性；另外一種方法是將親緣關系很近的單細胞測序數據進行混合分析。從偏倚性的角度來看，混合分析可以顯著地提高樣品的平均覆蓋度。同時生物信息學分析軟件也為數據分析提供了極大的便利，如SmashCell、Velvet-SC和SPAdes軟件等都能在一定程度上克服單細胞數據覆蓋度不均的問題，高效地完成序列拼接與測序數據分析［23］。

4 單細胞測序技術在腫瘤研究中的應用

迄今為止使用的測序材料無一例外都是數百萬甚至更多細胞的混合DNA樣本。因此測序結果通常表現出這些細胞“整體”表征，是一群細胞中信號的平均值，或者只代表其中占優勢數量的細胞信息。然而，由于細胞異質性的存在，表型相同的細胞遺傳信息可能存在顯著差異。很多低豐度的信息，如只存在于少數細胞（如早期癌細胞）中的突變，將會在“整體”表征的平均化過程中稀釋或丟失［24］。與傳統的全基因組測序相比，SCS不僅測量基因表達水平更加精確，而且還能檢測到微量的基因表達或罕見非編碼RNA，其優勢是全方位和多層次的。因此利用SCS技術深入地研究惡性腫瘤，可發現導致惡性腫瘤發生和演變的各種基因變異、腫瘤異質性、耐藥性等，從而幫助我們在個體水平上認識惡性腫瘤的發生、發展及進化。

5 單細胞測序技術在腫瘤檢測中的臨床應用

5.1 SCS技術與腫瘤相關基因變異的檢測

腫瘤的發生是一個多基因異常表現的疾病過程，最終導致一個正常的細胞表型轉變為一種異常的細胞表型，即腫瘤細胞。識別具有不同遺傳變異性的腫瘤類型和不同的腫瘤分期（即腫瘤發生、轉移、化療抵抗），有助于我們更好地理解腫瘤的發展和演化的機制以及為腫瘤的預防與治療提供新策略和分子靶點［25］。

轉錄組和表觀基因組測序數據對于腫瘤相關畸變的發現也很重要，例如，結直腸癌CTCs的轉錄組分析表明，由于腫瘤相關的轉錄下調與發揮“stemness”作用的基因（如CD166和CD26）具有相關性，CTCs可能代表一種休眠狀態。此外，結直腸癌CTCs的基因組分析發現，一些在腫瘤細胞中低表達的基因往往在調控細胞間接觸（cellcell contact）和動力方面起作用，而高表達的基因如CD47可協助腫瘤細胞逃避免疫殺傷［26］。一些基因組分析還發現在正常細胞功能中發揮重要作用的基因，如Septin 9（SEPT9）、POU4F1和核仁蛋白4（nucleolar protein 4，NOL4）等存在腫瘤表觀遺傳修飾成分，如CpG島甲基化譜的改變［27-28］。

5.2 SCS技術與腫瘤細胞譜系樹的重建

腫瘤的演化通常涉及遺傳變異的積累，可以擾亂正常細胞的功能并促進正常表型向腫瘤表型轉化［29］。獲取這些遺傳變異信息，包括時間和空間表達方面的數據，將可以重建腫瘤細胞譜系樹。以此用于分析腫瘤演化的過程并且為疾病的診斷和治療提供新的見解。目前通過利用SCS平臺以及其他測序數據，已經開發了各種模型來構建腫瘤細胞譜系樹。但是，這種生物信息學方法受到現有的SCS技術精確度的局限，包括現用的測序數據運算方法以及測序過程中產生的高錯誤率［30］。

5.3 SCS技術與腫瘤的診斷和治療

在腫瘤發生發展過程中積累的遺傳變異也可以影響腫瘤細胞對治療的反應。SCS技術可以識別腫瘤診斷和個性化治療相關的標志物［31-32］。各種腫瘤相關的基因突變已在臨床應用，并作為特定類型腫瘤診斷的生物標志物，包括黑色素瘤BRAF基因突變、結腸癌的KRAS基因突變、非小細胞肺癌的EGFR基因突變［32］。但是，這些生物標志物僅僅用于提示存在發生相關腫瘤的風險，對于明確診斷則需要建立更詳細和全面的分析。因為迄今為止尚沒有發現某個單一突變與某個特定的腫瘤類型、發展階段或者預后存在絕對的關聯。例如，已在許多宮頸癌患者中觀察到NOL4基因和脂肪瘤HMGIC融合伴侶蛋白4（lipoma HMGIC fusion partner-like protein 4，LHFPL4）基因存在高頻甲基化［33］，但是仍有少數患者是沒有檢測到甲基化修飾的，如果僅依靠這些標記做為診斷依據就會導致漏診。

此外，我們除了關注SCS技術為精確診斷帶來的益處，還關注它在精準治療中的重要作用。SCS技術可以為靶向藥物的選擇提供參考。從理論上說，修復腫瘤相關的遺傳變異可以使腫瘤表型重新恢復成正常表型。多數靶向藥物可以抑制異常基因的功能，因此可能給個體化腫瘤治療帶來益處。如，治療惡性血液病的組蛋白去乙酰化酶抑制劑、治療黑色素瘤的BRAF抑制劑以及治療乳腺癌的PARP抑制劑等［32］。但由于腫瘤異質性的問題，不同靶向藥物針對的腫瘤類型不同，甚至相同的腫瘤類型的靶向藥物也不盡相同。而且在治療中可能產生原靶向位點產生耐藥性或出現新變異的問題。因此，基于精準檢測下的靶向藥物選擇可以為患者帶來最大益處，體現個性化治療的價值［34］。

通過SCS技術可以揭開不同的腫瘤類型和階段的遺傳變異的差異，有助于制定個性化治療方案和及時調整治療策略。NUC-Seq是一種可以基本實現對單個細胞完整基因組進行完全測序的新的測序方法［35］。當細胞準備分裂時，細胞核內DNA會進行復制。通過篩選從而僅僅對新生的“雙”核進行測序。NUC-Seq可以利用此類復制，獲得比之前大部分的測序技術更低的測序錯誤率，可以將腫瘤的基因組異質性檢測出來。研究人員運用NUC-Seq技術對乳腺癌患者進行單細胞基因組測序時發現，不同亞型的乳腺癌存在遺傳變異的差異。在腫瘤進化中，三陰乳腺癌患者的腫瘤細胞變異率較高，而雌激素受體（ER）陽性患者的變異則相對穩定，因此ER陽性患者的治療效果相對較好［36］。研究還發現基因重組等結構改變主要出現在乳腺癌早期且保持相對穩定的狀態，而點突變則伴隨整個腫瘤進化過程并導致大量基因多樣性出現［35，36］。

5.4 SCS技術與外周血單個CTC在預測腫瘤轉移和進展中的應用

SCS技術除了在腫瘤組織的檢測上具有優勢，還在CTCs研究方面顯示出重要作用。CTCs是指由實體瘤病灶（原發灶或轉移灶）釋放進入外周血循環的腫瘤細胞，在外周血中檢測到腫瘤細胞提示腫瘤遠處轉移的可能性［36］。但腫瘤患者血液中腫瘤細胞數量很少，傳統研究往往需要建立在大量細胞的基礎上才能進行。CTCs的全基因組測序可作為腫瘤診斷和評估預后的一種非侵入性的方法［37］；WGA及全基因組測序技術可對原發性腫瘤、CTCs、轉移性腫瘤細胞進行分離，并揭示細胞之間基因組的聯系。與腫瘤組織相比，血液樣本易于獲取、創傷性小、可反復采集，因此可作為腫瘤“液體活檢”樣本。

全基因組轉錄水平的單細胞RNA測序方法（single-cell RNA sequencing，Smart Seq）已應用于單個黑色素瘤細胞的不同的基因表達方式的分析，促進CTCs基因生物標志物的鑒定［38］。采用靶DNA測序（targeted DNA sequencing）方法觀察到結腸癌的原發性腫瘤細胞和CTCs中存在不少類似的驅動突變，這表明CTCs的基因組分析可以代表腫瘤進化的突變方式［39］。而運用MABLC技術對肺腺癌和小細胞肺癌患者的單個CTC進行WGA和深度測序，檢出特征性的與腫瘤相關的SNVs和INDELs等變異［6］。同一患者的不同CTCs的全基因組CNV具有高度一致性，且與其轉移瘤的CNV一致，提示CNV與腫瘤的轉移密切相關；在不同的肺腺癌患者中CTCs的CNV具有高度的相似性，說明特定的CNV與腫瘤的形成與轉移有關。此外，小細胞肺癌患者與肺腺癌患者之間的CNV明顯不同，提示不同的腫瘤來源是不同的變異造成的。另外，在肺腺癌患者的肝臟轉移灶中觀察到腫瘤表型轉變為小細胞肺癌，以此為依據采用標準化的小細胞肺癌方案療效顯著，這提示治療方案可基于CTCs中CNV的改變而調整。在治療過程中，還觀察到CTCs中的SNVs/INDELs會改變，而CNV模式保持相對穩定［6］。因此，SCS技術可以為腫瘤診斷和治療以及預后觀察提供分子層面相對明確的數據信息。

6 小結

單細胞測序技術提供了一個前所未有的腫瘤研究方法，允許對存在異質性的腫瘤細胞群之間的進行單細胞水平分析。單細胞測序數據將提高我們對腫瘤發病機制的認識，并改進診斷和治療的方法。此外，單細胞測序所需試劑、設備和生物信息學算法等，均在不斷完善，使得SCS平臺的力量和功能逐漸增強。改進的SCS技術將減少甚至消除這些挑戰從而獲得更精確的測序數據，測序數據與病理特征之間的關系將更加明確。

目前單細胞測序技術還在發展階段，而且因為其涉及到NGS技術，故有些技術問題仍需解決：①目標細胞的提取問題：要能夠準確篩選目標細胞，如正常細胞或腫瘤細胞不被周圍細胞污染；②擴增失敗和等位基因脫扣；③PCR產生的非特異產物問題；④NGS的重復性問題等。此外，雖然基因組測序的成本一直在不斷下降，但是單個細胞基因組測序以及由此對復雜生物信息進行分析的成本依然是驚人的。同時，對個體細胞進行分析的新技術不斷涌現，但技術缺陷仍然存在。例如，MALBAC等所得到的檢測結果的可信度有多高（假陽性率高）。例如，由于染色體數目異常導致很多腫瘤細胞是非整倍體細胞，而NUC-Seq技術可能只局限用于檢測不含非整倍體細胞的腫瘤。

在研究腫瘤發生發展的道路上，單個細胞測序技術的出現無疑是一個里程碑。借助這一技術，我們可以對不同患者的腫瘤細胞基因組進行比較，或者對同一患者在解剖學上相互獨立的器官、組織的腫瘤細胞進行比較，甚至可以比較同一腫瘤組織內的個體細胞間的差異，不斷揭示腫瘤發展過程中的基因變異及其變異率、追溯關鍵基因的克隆起源、腫瘤各亞型之間的基因序列差異、不同級別或不同類別的腫瘤細胞之間的差異、某種基因在不同腫瘤中的不同地位、對表觀遺傳學的影響以及長期難以攻破的腫瘤異質性和出現藥物抗性等問題。隨著測序技術的不斷發展，測序技術成本的降低，測序人群數量的不斷上升，我們可逐步從“單個細胞”全面認識腫瘤“整體”，以完善腫瘤診療體系，進而從個體水平實現有效的靶向治療。

［1］ Lipinski KA，Barber LJ，Davies MN，et al.Cancer evolution and the limits of predictability in precision cancer medicine［J］.Trends Cancer，2016，2（1）：49-63.

［2］ Eberwine J，Sul JY，Bartfai T，et al.The promise of single-cell sequencing［J］.Nat Methods，2014，11 （1）：25-27.

［3］ Zong C，Lu S，Chapman AR，et al.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell［J］.Science，2012，338 （6114）：1622-1626.

［4］ Tang F，Barbacioru C，Wang Y，et al.mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell［J］.Nat Methods，2009，6（5）：377-382.

［5］ NavinN，Kendall J，Troge J，et al.Tumour evolution inferred by single-cell sequencing［J］.Nature，2011，472（7341）：90-94.

［6］ Ni X，Zhuo M，Su Z，et al.Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients［J］.Proc Natl AcadSci USA，2013，110（52）：21083-21088.

［7］ Zhang X，Marjani SL，Hu Z，et al.Single-cell sequencing for precise cancer research：progress and prospects［J］.Cancer Res，2016，76（6）：1305-1312.

［8］ Guo H，Zhu P，Guo F，et al.Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing［J］.Nat Protoc，2015，10（5）：645-659.

［9］ Buenrostro JD，Wu B，Litzenburger UM，et al.Singlecell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation［J］.Nature，2015，523（7561）：486-490.

［10］ Shapiro E，Biezuner T，Linnarsson S.Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize wholeorganism science［J］.Nat Rev Genet，2013，14（9）：618-630.

［11］ Sethsmith HM，Harris SR，Scott P，et al.Generating whole bacterial genome sequences of low-abundance species from complex samples with IMS-MDA［J］. Nat Protoc，2013，8（12）：2404-2412.

［12］ Galler K，Br?utigam K，Gro?e C，et al.Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis［J］.Analyst，2014，139（6）：1237-1273.

［13］ Bose S，Wan Z，Carr A，et al.Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing［J］.Genome Biol，2015，16：120.

［14］ Yong W，Navin NE.Advances and applications of single-cell sequencing technologies［J］.Mol Cell，2015，58（4）：598-609.

［15］ Huang L，Ma F，Chapman A，et al.Single-cell wholegenome amplification and sequencing：methodology and applications［J］.Annu Rev Genomics Hum Genet，2015，16：79-102.

［16］ Hou Y，Song L，Zhu P，et al.Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-Negative myeloproliferative neoplasm［J］.Cell，2012，148 （5）：873-885.

［17］ Xu X，Hou Y，Yin X，et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor［J］.Cell，2012，148（5）：886-895.

［18］ Yu C，Yu J，Yao X，et al.Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing［J］.Cell Res，2014，24（6）：701-712.

［19］ Chen M，Song P，Zou D，et al.Comparison of multiple displacement amplification（MDA）and multiple annealing and looping-based amplification cycles （MALBAC）in single-cell sequencing［J］.PloS One，2014，9（12）：e114520.

［20］ Lovett M.The applications of single-cell genomics ［J］.Hum Mol Genet，2013，22（1）：22-26.

［21］ Macaulay IC，Voet T.Single Cell genomics：advances and future perspectives［J］.PLoS Genet，2014，10 （1）：e1004126.

［22］ Kolodziejczyk A，Kim JK，Svensson V，et al.The technology and biology of single-cell RNA sequencing ［J］.Mol Cell，2015，58（4）：610-620.

［23］ Olson ND，Lund SP，Colman RE，et al.Best practices for evaluating single nucleotide variant calling methods for microbial genomics［J］.Front Genet，2015，6：235.

［24］ Shirai M，Taniguchi T，Kambara H.Emerging applications of single-cell diagnostics［J］.Top CurrChem，2014，336：99-116.

［25］ Wang K，Kan J，Yuen ST，et al.Exome sequencing identifies frequent mutation of ARID1A in molecular subtypes of gastric cancer［J］.Nat Genet，2011，43 （12）：1219-1223.

［26］ Steinert G，Sch?lch S，Niemietz T，et al.Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer［J］.Cancer Res，2014，74 （6）：1694-1704.

［27］ Gao F，Ji G，Gao Z，et al.Direct ChIP-bisulfite sequencing reveals a role of H3K27me3 mediating aberrant hypermethylation of promoter CpG islands in cancer cells［J］.Genomics，2014，103（2-3）：204-210.

［28］ Wasserkort R，Kalmar A，Valcz G，et al.Aberrant septin 9 DNA methylation in colorectal cancer is restricted to a single CpG island［J］.BMC Cancer，2013，13（1）：1-11.

［29］ Newburger DE，Kashefhaghighi D，Weng Z，et al. Genome evolution during progression to breast cancer ［J］.Genome Res，2013，23（7）：1097-1108.

［30］ Kim KI，Simon R.Using single cell sequencing data to model the evolutionary history of a tumor［J］.BMC Bioinformatics，2014，15（1）：1-13.

［31］ M?bert K，Cojoc M，Peitzsch C，et al.Cancer biomarker discovery：current status and future perspectives［J］.Int J RadiatBiol，2014，90（8）：659-677.

［32］ Normanno N，Rachiglio AM，Roma C，et al.Molecular diagnostics and personalized medicine in oncology：challenges and opportunities［J］.J Cell Biochem，2013，114（3）：514-524.

［33］ Murphy PJ，Cipriany BR，Wallin CB，et al.Singlemolecule analysis of combinatorial epigenomic states in normal and tumor cells［J］.Proc Natl AcadSci USA，2013，110（19）：7772-7777.

［34］ Prahallad A，Sun C，Huang S，et al.Unresponsiveness of colon cancer to BRAF（V600E）inhibition through feedback activation of EGFR［J］.Nature，2012，483（7387）：100-103.

［35］ Wang Y，Waters J，Leung ML，et al.Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing［J］.Nature，2014，512（7513）：155-160.

［36］ Massagué J，Obenauf AC.Metastatic colonization by circulating tumour cells［J］.Nature，2016，529（7586）：298-306.

［37］ Morimoto A，Mogami T，Watanabe M，et al.Highdensity dielectrophoretic microwell array for detection，capture，and single-cell analysis of rare tumor cells in peripheral blood［J］.PloS One，2014，10（6）：e0130418.

［38］ Ramsk?ld D，Luo S，Wang YC，et al.Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells［J］.Nat Biotechnol，2012，30（8）：777-782.

［39］ Heitzer E，Auer M，Gasch C，et al.Complex tumor genomes inferred from single circulating tumor cells by array-CGH and next-generation sequencing［J］.Cancer Res，2013，73（10）：2965-2975.

Single-cell sequencing technology and its application in cancer research and clinical diagnosis

ZHOU Ying1，HUANG Huayi1，2★
（1.Department of Laboratory Medicine，The People's Hospital of Guangxi Autonomous Region，Nanning，Guangxi Autonomous Region，China，530021；2.Department of Surgical Oncology，Roswell Park Cancer Institute，Buffalo，New York，USA，14263）

The heterogeneity of tumors is an important feature of cancer.Tumor cells that lack homogeneity increase the difficulty of targeting therapeutics.Therefore,identifying tumor heterogeneity is an important task.The single-cell sequencing(SCS)technology utilizes next generation sequencing methodology to examine the genomic sequence of a single cell,and obtain the variability of genetic and protein information among tumor cells,allowing for a better understanding of the cellular function and the surrounding microenvironment.By sequencing the whole genome,transcriptome,and epigenetic genes of a single cell,the complex mechanisms of heterogeneity in tumors can be uncovered,thus improving cancer diagnosis and prognosis prediction,as well as monitoring of therapeutic response.Here,we have summarized the advancement of SCS technology,the principle and procedures of its analysis,the shortcomings of the technology,and its usage in cancer research and potential application value in clinical diagnosis.

Single-cell sequencing；Next generation sequencing；Genome；Tumor；Heterogeneity

1.廣西壯族自治區人民醫院檢驗科，廣西，南寧530021

2.美國羅斯威爾帕克癌癥研究所腫瘤外科，美國，紐約，布法羅14263

★通訊作者：黃華藝，E-mail：Huayi.Huang@Roswellpark.org