循環游離DNA的定量檢測及面臨的問題

李鐵軍張孝衛

循環游離DNA的定量檢測及面臨的問題

李鐵軍★張孝衛

循環游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）與人類疾病之間存在著密切聯系。近年來，cfDNA做為一種無創檢測生物標志物，展現出臨床應用前景。人們針對其含量較低的特點，進行了大量研究，開發出了各種較為可靠的定量檢測方法。但目前cfDNA的定量檢測仍然面臨問題及爭議，缺乏規范和標準化的流程。本文對cfDNA的來源組成、定量檢測及存在的問題進行了歸納整理及分析，希望能對提高cfDNA的定量檢測的可靠性提供有益的參考。

循環游離DNA；標準化；PCR

循環游離DNA（circulating cell free DNA，cfDNA）是指循環血中游離于細胞之外的DNA。由于近年來DNA提取、檢測、測序等分子生物學技術的飛速發展，使得cfDNA的研究取得了長足進步，與疾病之間的關系逐漸被揭示出來。cfDNA做為生物標志物，在疾病篩查、診斷、治療監控、預后、疾病復發等方面表現出令人振奮的應用潛力。特別是對突變及甲基化循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的研究，在腫瘤的防控中開始顯現重要作用［1］。

cfDNA檢測的可靠性是其后續應用的基本保障，關系到其做為生物標志物的應用前景，然而目前cfDNA的檢測仍然存在諸多問題，從采用血清還是血漿標本的爭議，到標本采集流程、檢測方法、結果判讀、正常值等均缺乏統一標準，各實驗室之間的結果沒有可比性。對cfDNA檢測的規范和標準化，是cfDNA走向實際應用的必然選擇。cfDNA，其英文名稱也并不統一，有cell-free DNA （cfDNA）、Circulating DNA、Circulating Cell Free DNA（CCFDNA）、Free circulating DNA（fcDNA）、cell-free circulating DNA等。目前cfDNA檢測的常用方法有實時熒光定量PCR（qPCR）法、熒光染料法、bDNA技術等。下面本文對cfDNA的來源組成、定量檢測（標本選擇、DNA提取和多種檢測方法）及存在的問題進行了歸納探討，希望能對提高cfDNA的定量檢測的可靠性提供有益幫助。

1 cfDNA的來源、組成大小及代謝

一般認為，細胞凋亡是血清或血漿cfDNA的主要來源。其他來源有壞死腫瘤細胞的溶解、白細胞的分解、新合成核酸的自主釋放、細菌病毒等病原體的分解等［1］。cfDNA在血液與蛋白質或膜結合顆粒形成天然復合物，能抵抗核酸酶的降解。

cfDNA凝膠電泳分析顯示，主要條帶在180 bp左右，其次分布在360 bp附近。與纏繞在單核小體和雙核小體的DNA長度相符。提示我們cfDNA源于細胞凋亡［2-4］，細胞壞死釋放出的DNA由于被不完全和非特異性消化，其片段大小約10 000 bp［5］。小鼠肝細胞凋亡時，血漿cfDNA增加的現象也支持了凋亡為cfDNA的來源這一說法［6］。

近年來，不同實驗室利用DNA測序技術，對血漿cfDNA大小進行了更精確的分析，分辨率達1個堿基。測序研究顯示［7-8］：cfDNA大小主要分布在166 bp。測序分析與電泳結果基本保持了一致。cfDNA的大小是我們利用PCR技術檢測時需要考慮的因素。

研究表明，癌癥患者與健康個體相比有較高的cfDNA水平。這些升高的cfDNA主要來自癌細胞［9-11］。正常健康人群的cfDNA水平較低，但在某些病理情況下會顯著升高。比如惡性腫瘤、手術和創傷、中風、心衰、自身免疫性疾病、胰腺炎、重癥監護相關狀況、運動員大量訓練后等［12］。

cfDNA不僅來自于人類細胞，還含有人類微生物組的DNA。有研究證實細菌16S rRNA基因存在于患者與健康對照的人群的血液循環中［13-14］。雖然細菌或病毒DNA屬于外源性DNA，但在研究cfDNA的總濃度、組成、與疾病的關系等方面，必須考慮到這一因素。

值得注意的是，cfDNA的濃度及組成始終是一個動態過程。cfDNA是蛋白質結合DNA，其半衰期較短，文獻報道的半衰期從幾分鐘到2 h不等［1，15，19］。在大鼠模型中，cfDNA的清除主要在肝臟和腎臟，肝臟是主要的攝取部位［16］。肝臟攝取單鏈DNA比雙鏈DNA快。腎臟清除并不是cfDNA的主要清除機制［17］，慢性腎病、透析患者的cfDNA水平并沒變化。但循環突變KRAS DNA可通過腎臟排出，并在尿液中檢測出［18］。

2 cfDNA的定量檢測

cfDNA的檢測大致可分為cfDNA總濃度的檢測和其中一部分DNA的檢測，比如ctDNA的檢測。特別是對突變或甲基化ctDNA的檢測，將極大地提高游離DNA作為疾病生物標志物的特異性和敏感性，增加游離DNA檢測的應用前景。

2.1 標本選擇

血漿或血清均可做為cfDNA提取及檢測的樣本，但兩者的cfDNA濃度存在差異，選擇哪一個并沒有統一標準。一般認為，由于凝血過程中白細胞溶解，釋放DNA入血，因此血清cfDNA總濃度高于血漿。從避免白細胞基因組DNA混入待測標本的角度考慮，采用血漿標本似乎是更加合理的選擇。選擇血漿為標本的研究也相對較多。

血液存放時間會對cfDNA濃度產生影響。有研究顯示，血漿cfDNA在8 h內沒有變化，但血清cfDNA濃度在4 h時增加，并隨時間延長持續增加［4］。因此血漿分離前血液在4°C的最大存放時間是8 h，而血清應立刻分離以避免基因組DNA的污染。還有研究認為［20］，腫瘤患者血漿cfDNA的濃度經歷了一個由高到低，再由低到高的過程。2 h時血漿中cfDNA的濃度較高，放置6 h時游離DNA的濃度明顯下降，30 h時又有所增加。

EDTA抗凝全血在加入細胞膜穩定劑的情況下，室溫放置0、3、6 d后離心取血漿，cfDNA濃度未見明顯變化。在未加細胞穩定劑時，3、6 d的cfDNA水平顯著增高。但加入的外源標準DNA對照（standard external DNA control，EDC）在加與不加細胞膜穩定劑時未見明顯變化，說明cfDNA濃度變化與提取方法無關，而與細胞穩定劑相關。細胞膜穩定劑的加入可以有效抑制血細胞溶解，釋放DNA入血［21］。

可以看出，血液存放的時間長短確實對cfDNA水平產生影響。因此，在條件允許的情況下，采血后最好立刻分離血漿或血清，避免外源DNA的混入及濃度波動，最大程度地反映cfDNA的原貌。

另外，采血部位對cfDNA濃度也可能造成影響。采用直接qPCR法測定血漿cfDNA的濃度時發現，肘前靜脈的血漿cfDNA的濃度（17.6 ng/mL）顯著高于指尖毛細血管cfDNA濃度（8.7 ng/mL）［22］。可見，采血部位也是cfDNA檢測標準化需要考慮的因素之一。

2.2 cfDNA提取

目前，血漿或血清cfDNA的提取基本全部采用商業化試劑盒。由于cfDNA濃度極低，提取困難，不同方法提取效率差異明顯。比較常用的試劑盒為微柱吸附式的QIAamp?DNA blood mini kit （DBM），其次是磁珠式DNA純化試劑盒。但這些試劑盒主要用于從血細胞提取高度完整性的基因組DNA，而不是用于高度碎片化的cfDNA，因此可能導致提取效率較低。Devonshire AS等［23］將3種cfDNA專用提取試劑盒與DBM試劑盒進行了詳細研究比較，認為QIAamp?circulating nucleic acid （CNA）kit試劑盒在提取率和提取小片段方面均優于DBM試劑盒。Repiská G等［24］的研究也得出了相似結論，認為CNA或DSP Virus Kit（DSP）可以取代普遍使用的DBM試劑盒。還有研究表明，磁珠法提取效率高于DBM法，對質粒DNA的提取效率也僅為69.2%，其余幾種方法提取率均未超過50%［25］。隨著cfDNA研究的不斷深入，cfDNA的提取技術也在不斷提高，提取率、DNA片段大小的覆蓋范圍、提取試劑對后續濃度測定的影響都是需要改進提高的方面。

2.3 cfDNA定量方法

2.3.1 qPCR

qPCR是目前cfDNA定量的主流方法。通過檢測DNA中看家基因或穩定出現的某些非編碼重復序列，達到cfDNA定量的目的。常用的靶序列有：β-actin、β-globin、GAPDH、TERT、RPPH1、ERV3、MSTN、ALU、L1PA2等。

目前，采用qPCR定量仍然存在不少問題：首先，定量時，測量的數據是cfDNA總濃度還是靶基因的濃度，很多文獻在這一點上表述不清，極易造成誤導。我們知道，qPCR實際測量的是靶基因的Ct值，然后再用標準曲線計算cfDNA的量。一般以ng/mL或拷貝數表示。那么，參考基因的量能不能代表cfDNA的總量呢？這要看制作標準曲線時采用的標準品是什么，通常有兩種不同做法：①采用提純的靶基因或重組質粒，這樣計算出來的實際上就是靶基因的量，而不是cfDNA總量。只是以靶基因的量來“代表”cfDNA的量。②采用人基因組DNA為標準品。這樣看似計算出的是cfDNA總量，但這是以“看家基因在基因組中的含量穩定且分布均勻”這一論斷為前提的。而cfDNA中是否含有相同比例的看家基因，答案并不明確。雖然兩種方法在表述上都是測的cfDNA的量，顯然，采用不同標準品測出的數據是沒有可比性的。理論上，以人類基因組DNA為標準品測得的數值應遠高于純靶基因質粒為標準品的數值。也就是說，測量看家基因只能“大致反映”cfDNA的水平。基于上述原因，采用單一靶基因檢測cfDNA，雖說可以進行同一研究的橫向比較，但在cfDNA絕對定量的準確性和標準化上仍需探討。

不同參考基因測定同一標本的cfDNA濃度，是否可以得出一致結果呢？Devonshire AS等［23］比較了7個不同參考基因的qPCR定量并用數字PCR（digital PCR，dPCR）進行驗證，一些參考基因（比如TERT）測得的cfDNA的量平均高于其他內參基因（比如ERV3）2倍以上。研究認為使用多內參基因的分析及取平均值可對cfDNA總量給出更加可靠的估計。此外，在cfDNA定量時，在待測血漿中加入所謂外源性標準DNA對照（EDC），可評估提取效率、提取產物的線性度、共純化抑制物的存在以及cfDNA片段大小對定量的影響［21］。

qPCR定量cfDNA時的另一個問題是，定量前是否需要血漿或血清DNA的提取。多數qPCR的定量研究均為先提取cfDNA，后qPCR定量。毫無疑問，這樣會造成cfDNA的損失。損失的DNA量可能比提取量還要大。Umetani等［26］嘗試不需DNA純化直接定量cfDNA：進行qPCR之前，血漿或血清用備好的緩沖液和蛋白酶K處理，以去掉蛋白質，通過擴增兩種長度的ALU序列對cfDNA定量。Sarah Breitbach等［22，27］在反應混合物中加入一種用于困難模板擴增的特殊聚合酶（velocity polymerase），該酶每10 s可延伸1 kb堿基，血漿1∶40稀釋后，不需其他處理，直接加入反應體系進行qPCR測定血漿cfDNA濃度。結果顯示，未經提純的血漿中cfDNA的濃度是DBM試劑盒洗脫液（eluate）中cfDNA的2.79倍，在棄掉的流出液（flow-throug）中，發現了cfDNA總量的36.7%。可見，直接qPCR法操作更加簡便，避免了cfDNA的損失，但其可靠性仍需更多的相似研究和對比研究加以驗證。

2.3.2 熒光染料法

采用PicoGreen［14，28］、SYBR Green I等熒光染料法檢測血漿cfDNA，取得了不錯的效果。該法靈敏度高（可達pg水平），線性范圍寬。常用的PicoGreen是一種新型熒光染料，廣泛用于基因組DNA、病毒DNA、PCR擴增產物等微量雙鏈DNA（dsDNA）的檢測。可將血漿稀釋后直接與Pico-Green染料1∶1混合，在熒光酶標儀、熒光計等設備檢測熒光即可。2010年版中國藥典三部提出，熒光染料法檢測的線性范圍為1.25～80 ng/mL［29］。有商業化試劑盒稱可檢測低至25 pg/mL的dsDNA。由于熒光染料法靈敏度高、操作簡便，有學者認為［30］，此法為檢測cfDNA的最佳方法。

2.3.3 bDNA技術

近年來，bDNA信號放大的定量檢測技術被用于cfDNA的定量檢測。bDNA技術是一種建立在DNA雜交基礎上的檢測技術，類似于Southern blot 或ELISA法，針對選定的靶序列，比如ALU序列，設計專門的捕獲輔助探針（capture extender，CE），CE兩端分別與靶序列和捕獲探針結合，靶序列再與一系列標記輔助探針（1abeled extender，LE）、信號放大探針、酶標記探針等相連，最后檢測酶與底物的反應強弱［31］。該法的最低檢出限可達0.86 ng/mL［32］。bDNA技術不需DNA提取步驟，具有靈敏度、特異性較高、操作簡便的優點，但該法目前在國內應用不多。

bDNA技術與qPCR技術在檢測cfDNA上有相似點，都是對某一靶序列的量進行檢測，來定量cfDNA總量。可能也會存在qPCR上出現的類似問題，比如單靶基因、不同靶基因帶來的定量差異，標準品的選擇等。而且不同靶序列，需要設計專門的捕獲輔助探針。bDNA技術與qPCR法的比較研究顯示［33］，兩法的血清游離DNA水平呈正相關，但bDNA技術測得的cfDNA濃度中位數（252.2 ng/mL）是qPCR法（65.5 ng/mL）的近4倍。qPCR法中cfDNA的提取損失應該是其濃度低于bDNA法的主要原因之一。

2.4 甲基化cfDNA的定量方法

cfDNA中的甲基化DNA的檢測主要是指甲基化ctDNA的檢測。由于ctDNA具有含量極低這一不利于檢測的特性，因此，甲基化ctDNA的檢測基本上是基于PCR技術和測序技術上的檢測。PCR主要用于cfDNA中某特定基因或序列的甲基化檢測，而測序可對整個cfDNA的甲基化狀況進行檢測。

甲基化ctDNA的定性檢測可通過甲基化特異性 PCR（methylightion specific PCR，MSP）來實現。之后，Eads等［34］將MSP與qPCR技術相結合，實現了甲基化DNA的定量檢測，即經典的Methylight法，或稱qMSP法。這種定量是一種相對定量，通過計算PMR（percentage of methylated reference）值對目的基因甲基化水平進行量化。但問題來了，PMR的計算方式并不統一。其一：PMR=該公式實際是2-ΔΔCT的一種百分化形式，是以全甲基化陽性對照為100%計算出的甲基化百分數，PMR值應在0～100%之間，代表甲基化基因占全部靶基因的百分比。陽性對照甲基化不完全，樣品與對照拷貝數的差異可能會導致PMR值＞100%。其二：PMR=2-（Ct樣本靶基因-Ct樣本內參）×100%。這種是以內參基因的量為對照標準計算出的甲基化靶基因的相對量。PMR值上限不固定，取決于基因組中靶基因與參考基因之間的相對量。第一種PMR計算方法更易于理解和相互比較。不管哪種計算方式，必須考慮靶基因和內參基因擴增效率是否一致的問題。

Methylight法與最近發展起來的數字PCR （dPCR）相結合，產生了數字Methyligh或稱為Methyligh dPCR。Methyligh dPCR比qPCR具有更高的敏感性［35］。dPCR可直接對拷貝數進行絕對定量而不需制作標準曲線。dPCR由于單鏈模板進入分區并被擴增，可能產生拷貝數被高估的情況。

另一類定量方法是基于甲基化依賴限制性內切酶（MDRE）或甲基化敏感的限制性內切酶（methylation sensitive restriction endonuclease，MSRE）的PCR分析。MSRE或MDRE消化含數個CpG位點的靶序列，通過qPCR擴增，計算甲基化的相對量。MSRE或MDRE法的局限性在于靶序列中必須含有相應的含CpG的酶切位點，且酶切消化能否達到100%，也是影響結果的重要因素。

重亞硫酸鹽轉化的DNA，還可通過測序評估全cfDNA的甲基化狀態［5］。測序技術的發展，提供了更大的基因組覆蓋和測序深度。測序可通過單分子定量，大范圍高通量的識別所有甲基化胞嘧啶。

Redshaw等［36］使用系列梯度的甲基化DNA標準樣本，對Methylight、Methyligh dPCR、MSRE/ MDRE-qPCR和-dPCR以及測序法進行了對比評估。Methylight qPCR表現出最好線性。測序分析精密度較高，但準確性不如qPCR和dPCR，高估了甲基化含量。當甲基化＜25%時，qPCR和dPCR法的精密度降低。

測序并未如我們期待的那樣，成為精密度和準確性最高的方法。測序要想成為甲基化定量的金標準，技術上仍有改進的空間。而且測序設備昂貴，臨床普及應用尚有難度。

3 展望

cfDNA做為新興的生物標志物，由于各種內、外因素的影響，其組成及濃度變化較大，且含量較低，不易檢測。根據檢測目的和靶標的不同，每種檢測方法各有其優勢和局限性。當今主流的檢測方法，基本是基于PCR技術的各種擴展延伸，熒光染料法等方法由于自身的優勢，也逐漸得到認可。盡管存在缺乏檢測流程的規范和標準化等諸多問題，但這只是前進道路中必然遇到的問題，相信通過更多的、更大樣本量的研究以及檢測技術的改良進步，這些問題都將逐步得到解決。

［1］ Elshimali YI，Khaddour H，Sarkissyan M，et al.The clinical utilization of circulating cell free DNA（CCFDNA）in blood of cancer patients［J］.Int J Mol Sci，2013，14（9）：18925-18958.

［2］ Jahr S，Hentze H，Englisch S，et al.DNA fragments in the blood plasma of cancer patients：quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells［J］.Cancer Res，2001，61（4）：1659-1665.

［3］ Suzuki N，Kamataki A，Yamaki J，et al.Characterization of circulating DNA in healthy human plasma［J］. Clin Chim Acta，2008，387（1-2）：55-58.

［4］ Warton K，Lin V，Navin T，et al.Methylation-capture and next-generation sequencing of free circulating DNA from human plasma［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：476.

［5］ Lo YM，Chan KC，Sun H，et al.Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profile of the fetus［J］.Sci Transl Med，2010，2（61）：61ra91.

［6］ Jahr S，Hentze H，Englisch S，et al.DNA fragments in the blood plasma of cancer patients：quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells［J］.Cancer Res，2001，61（4）：1659-1665.

［7］ Jiang P，Chan CW，Chan KC，et al.Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2015，112 （11）：E1317-E1325.

［8］ Stroun M，Lyautey J，Lederrey C，et al.About the possible origin and mechanism of circulating DNA apoptosis and active DNA release［J］.Clin Chim Acta，2001，313：139-142.

［9］ Newman AM，Bratman SV，To J，et al.An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage［J］.Nat Med，2014，20 （5）：548-554.

［10］ Singh N，Gupta S，Pandey RM，et al.High levels of cell-free circulating nucleic acids in pancreatic cancer are associated with vascular encasement，metastasis and poor survival［J］.Cancer Invest，2015，33（3）：78-85.

［11］ Sikora K，Bedin C，Vicentini C，et al.Evaluation of cell-free DNA as a biomarker for pancreatic malignancies［J］.Int J Biol Markers，2015，30（1）：e136-141.

［12］ Vietsch EE，van Eijck CH，Wellstein A.Circulating DNA and micro-RNA in patients with pancreatic cancer ［J］.Pancreat Disord Ther，2015，5（2）：156.

［13］ Moriyama K，Ando C，Tashiro K，et al.Polymerase chain reaction detection of bacterial 16S rRNA gene in human blood［J］.Microbiol Immunol，2008，52（7）：375-382.

［14］ Dinakaran V，Rathinavel A，Pushpanathan M，et al. Elevated levels of circulating DNA in cardiovascular disease patients：metagenomic profiling of microbiome in the circulation［J］.Plos One，2014，9（8）：e105221.

［15］Diehl F，Schmidt K，Choti MA，et al.Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics［J］.Nat Med，2008，14（9）：985-990.

［16］ Holdenrieder S，Stieber P，Chan LY，et al.Cell-free DNA in serum and plasma：comparison of ELISA and quantitative PCR［J］.Clin Chem，2005，51（8）：1544-1546.

［17］ Kirsch C，Weickmann S，Schmidt B，et al.An improved method for the isolation of free-circulating plasma DNA and cell-free DNA from other body fluids ［J］.Ann N Y Acad Sci，2008，1137：135-139.

［18］ Su YH，Wang M，Brenner DE，et al.Human urine contains small，150 to 250 nucleotide-sized，soluble DNA derived from the circulation and may be useful in the detection of colorectal cancer［J］.J Mol Diagn，2004，6（2）：101-107.

［19］ Lo YM，Zhang J，Leung TN，et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma［J］.Am J Hum Genet，1999，64（1）：218-224.

［20］ 于韶榮，史美祺，劉寶瑞，等.全血分離時間對腸癌患者血漿游離DNA濃度的影響［J］.成都醫學院學報，2014，9（5）：554-557.

［21］ Eini M，Behzad-Behbahani A，Takhshid MA，et al. Chimeric external control to quantify cell free DNA in plasma samples by real time PCR［J］.Avicenna J Med Biotechnol，2016，8（2）：84-90.

［22］ Breitbach S，Sterzing B，Magallanes C，et al.Direct measurement of cell-free DNA from serially collected capillary plasma during incremental exercise［J］.J Appl Physiol，2014，117（2）：119-130.

［23］ Devonshire AS，Whale AS，Gutteridge A，et al.Towards standardisation of cell-free DNA measurement in plasma：controls for extraction efficiency，fragment size bias and quantification［J］.Anal Bioanal Chem，2014，406（26）：6499-6512.

［24］ Repiská G，Sedlá?ková T，Szemes T，et al.Selection of the optimal manual method of cell free fetal DNA isolation from maternal plasma［J］.Clin Chem Lab Med，2013，51（6）：1185-1189.

［25］嚴子禾，潘世揚，陳丹，等.4種血漿游離DNA提取方法的比較［J］.臨床檢驗雜志，2006，24（5）：363-365.

［26］ Umetani N，Kim J，Hiramatsu S，et al.Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer：direct quantitative PCR for ALU repeats［J］.Clin Chem，2006，52（6）：1062-1069.

［27］ Breitbach S，Tug S，Helmig S.Direct quantification of cell-free，circulating DNA from unpurified plasma ［J］.Plos One，2014，9（3）：e87838.

［28］張思功，王國春，彭清林，等.血漿游離DNA水平升高源于NETosis并與活動性狼瘡腎炎相關［J］.中華風濕病學雜志，2014，18（5）：336-340.

［29］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.3部，北京：中國醫藥科技出版社，2010.

［30］ Szpecheinski A，Struniawska R，Zaleska J，et a1. Evaluation of fluorescence-based methods for total vs．amplifiable DNA quantification in plasma of lung cancer patients［J］.J Physiol Pharmaeol，2008，59Suppl 6：675-681.

［31］趙麗，景蓉蓉，張魯榕，等.分支DNA技術檢測血漿游離DNA方法的建立及在急性心肌梗死患者中的初步應用［J］.基礎醫學與臨床，2014，34（2）：172-175.

［32］楊益梅，邵雪峰，張玉泉，等.血清游離DNA定量檢測對宮頸癌臨床診斷的價值［J］.中華檢驗醫學雜志，2013，36（110）：992-996.

［33］施維，戚菁，申嫻娟，等.兩種游離DNA檢測方法的比較研究［J］.交通醫學，2014，28（6）：579-580.

［34］ Eads CA，Danenberg KD，Kawakamik，et al.Methylight：a high-throughtout assay to measure DNA methylation［J］.Nucleic Acids Res，2000，28（8）：E32.

［35］Weisenberger DJ，Trinh BN，Campan M，et al.DNA methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital Methylight［J］.Nucleic Acids Res，2008，36（14）：4689-4698.

［36］ Redshaw N，Huggett JF，Taylor MS，et al.Quantification of epigenetic biomarkers：an evaluation of established and emerging methods for DNA methylation analysis［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：1174.

Quantification of circulating cell free DNA and the existing problems

LI Tiejun★,ZHANG Xiaowei
（Jinan health science exchange and service center,Jinan,Shandong,China,250013）

Circulating cell free DNA(cfDNA)are closely related to human disease.In recent years, as a noninvasive biomarkers,cfDNA showed great prospect for clinical application.Because of its extremely low content,a large number of studies have been done to develop various methods for quantitative detection.At the moment cfDNA quantitative detection still faces problems such as the lack of specification and standardization in detection processes.In this paper,we reviewed the source of cfDNA,quantitative methods and existing problems of detection,and hope to give a beneficial reference for improving the reliability of the quantitative detection.

Circulating cell free DNA;Standardization;PCR

濟南市衛生科技交流服務中心,山東,濟南250013

★通訊作者：李鐵軍，E-mail：ltj6902@sina.com