Ki—67、Bcl—2、Bax和Caspase—3在腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義

于澤奇++++++程世翔++++++涂悅++++++王婧怡++++++茍莞苓++++++張賽

[摘要] 目的 探討腦膠質瘤患者瘤組織中Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達水平及臨床意義。方法 選取2014年10月～2016年10月武警后勤學院附屬醫院手術切除的65例腦膠質瘤組織切片。根據神經系統腫瘤分類將其分為低級別膠質瘤組34例和高級別膠質瘤組31例，另取18例正常腦組織切片標本作為對照組，比較3組標本組織中Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3表達水平，并分析其與膠質瘤惡性程度的相關性。 結果 隨著膠質瘤病理級別的升高，Ki-67表達水平逐漸增強，在正常腦組織、低、高級別膠質瘤組中的表達陽性率分別為0、20.6%、77.4%，差異有統計學意義（P < 0.05），二者呈正相關性（Spearman相關系數為0.645，P < 0.05）。Bcl-2表達水平隨著膠質瘤級別的升高而逐漸升高（6.2%、73.5%、100.0%），差異有統計學意義（P < 0.05），二者呈正相關性（Spearman相關系數為0.711，P < 0.05）。Bax表達水平隨著腦膠質瘤級別的升高而逐漸降低（100.0%、82.4%、16.1%），差異有統計學意義（P < 0.05），二者呈負相關性（Spearman相關系數為-0.706，P < 0.05）。Caspase-3表達水平在低級別膠質瘤組最高（0、100.0%、80.6%），隨病理級別的升高而逐漸降低（P < 0.05），二者呈負相關性（Spearman相關系數為-0.334，P < 0.05）。 結論 Ki-67與Bcl-2表達水平的上調，Bax與Caspase-3表達水平的下調，提示膠質瘤病理級別越高。同時，根據Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達水平可對膠質瘤惡性程度進行判斷，在一定程度上對患者預后評估具有重要指導意義。

[關鍵詞] 膠質瘤；Ki-67；Bcl-2；Bax；Caspase-3

[中圖分類號] R739.41 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the expression levels of Ki-67， Bcl-2， Bax and Caspase-3 in patients with brain glioma and its clinical significance. Methods 65 cases with brain glioma in Affiliated Hospital of Logistics College of PAP from October 2014 to October 2016 were selected and divided into low grade glioma group （34 cases） and high grade glioma group （31 cases） according to the classification of tumors of the nervous system. Another 18 cases with normal brain tissue specimens were selected as the control group. The expression levels of Ki-67， Bcl-2， Bax and Caspase-3 were detected and compared. Besides， their correlations with the malignant degree of glioma were analyzed. Results As the pathological grade of glioma increasing， the expression level of Ki-67 increased. The positive rates in normal brain tissue， low and high grade glioma group were 0， 20.6% and 77.4%， respectively， with statistically significant difference （P < 0.05）， and had a positive correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was 0.645， P < 0.05）. The expression level of Bcl-2 increased with the increase of glioma grade （6.2%， 73.5%， 100%）， which showed a positive correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was 0.711， P < 0.05）. The expression level of Bax decreased with the increase of glioma grade （100.0%， 82.4%， 16.1%）， which showed a negative correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was -0.706， P < 0.05）.The expression level of Caspase-3 in low grade glioma group was the highest among groups， which decreased with the increase of pathological grade and showed a negative correlation with pathological grade （Spearman correlation coefficient was -0.334， P < 0.05）. Conclusion It shows the higher pathological grade of glioma is caused by the rising of the Ki-67 and Bcl-2 expression levels， as well as the decreasing of Bax and Caspase-3 expression levels. Meanwhile， it is very important in certain degree for the patients prognostic evaluation according to the judge the degree of glioma based on the Ki-67， Bcl-2， Bax and Caspase-3 expression levels.

[Key words] Glioma； Ki-67； Bcl-2； Bax； Caspase-3

膠質瘤是人類神經系統中最常見的一種原發惡性腫瘤[1]。膠質瘤患者死亡率高，其原因與膠質瘤侵入性生長方式有關[2]。Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤生長緩慢，病程長，但手術治療后復發率高。Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤生長迅速，病程短，且瘤體占位性效應可引發患者嘔吐、視神經萎縮和癲癇等[3]。膠質瘤起病機制復雜，常與多種因素相關聯[4]。隨著醫療技術的不斷發展，對膠質瘤的檢查、確診更為快捷。為了解Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達水平與膠質瘤間的相互聯系，本文通過免疫組化法對其進行檢測，來探討是否可以根據Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達水平來指示患者的預后情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年10月～2016年10月武警后勤學院附屬醫院（以下簡稱“我院”）腦膠質瘤患者經外科手術治療后切除的膠質瘤標本65例。將65例患者根據WHO 2007 年中樞神經系統腫瘤分類標準[5]分為2類：①低級別膠質瘤，腫瘤分級Ⅰ～Ⅱ級，其中星形細胞瘤15例，少枝膠質細胞瘤19例。②高級別膠質瘤，腫瘤分級Ⅲ～Ⅳ級，其中9例間變性星形細胞瘤，12例膠質母細胞瘤，10例髓母細胞瘤。除此之外，取18例因外傷或者腦出血而進行顱內減壓的正常腦組織標本作為對照。本次研究已獲我院倫理委員會的審批與認可，所有標本均取自有完整病歷資料并經我院病理科證實的患者，且患者手術前未進行放化療。

1.2 試劑與儀器

Ki-67兔抗人單克隆抗體、Bcl-2兔抗人單克隆抗體、Bax兔抗人單克隆抗體、Caspase-3兔抗人單克隆抗體（美國Abcam），免疫組化染色試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），石蠟切片機（德國Leica），倒置相差顯微鏡（日本Nikon）。

1.3 免疫組織化學染色

所有標本經4%中性甲醛固定，脫水后石蠟包埋，將石蠟組織標本行5 μm厚連續切片，經脫蠟，EDTA抗原修復，3%雙氧水消除內源性過氧化物酶，血清封閉1 h后，分別滴加Ki-67、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗（稀釋濃度分別1∶100、1∶250、1∶100、1∶100）4℃孵育過夜，PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育1 h。DAB顯色，沖洗，蘇木精復染細胞核，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS液代替一抗做陰性對照。

1.4 陽性結果判定標準

Ki-67陽性判定：細胞核中出現棕黃色著色；Bcl-2細胞陽性判定：細胞核和細胞質中出現黃色顆粒；Bax蛋白陽性判定：細胞質中出現棕黃色顯色；Caspase-3陽性判定：細胞質中發現棕黃色顆粒。標本采用光學顯微鏡進行觀察，由兩名資深病理科醫師采用雙盲法對結果進行判定。每個腦組織切片隨機選擇5個不同的高倍視野，取200個腫瘤細胞，計算陽性細胞數及檢測陽性細胞染色程度。表達程度分為4級：①細胞呈現無顯色或出現陽性細胞數0%，表達程度為（-）；②細胞呈現淺顯色或出現陽性細胞數<50%，表達程度為（+）；③細胞呈現深顯色或出現陽性細胞數≥50%，表達程度為（++）；④細胞呈現明顯或出現陽性細胞數≥85%，表達程度為（+++）。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數據進行分析，組間Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3陽性率比較采用卡方檢驗，相關性分析采用Spearman法，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ki-67在不同病理級別腦膠質瘤組織及正常腦組織中的表達

Ki-67在正常腦組織中無表達，陽性率為0%；在低級別膠質瘤中表達水平升高，陽性率為20.6%；在高級別膠質瘤中Ki-67表達水平最高，陽性率為77.4%，差異有統計學意義（P < 0.05）。Ki-67表達水平與膠質瘤級別呈正相關性（Spearman相關系數為0.645，P < 0.05）。見表1。

2.2 Bcl-2在不同病理級別腦膠質瘤組織及正常腦組織中的表達

Bcl-2在正常腦組織中表達陽性率為6.2%，在低級別膠質瘤中陽性率為73.5%；在高級別膠質瘤中的陽性率為100%，差異有統計學意義（P < 0.05）。Bcl-2表達水平與膠質瘤惡性程度兩者存在正相關性（Spearman相關系數為0.711，P < 0.05）。見表2。

2.3 Bax在不同病理級別腦膠質瘤組織及正常腦組織中的表達

Bax在正常腦組織中廣泛表達，陽性率為100%；在低級別膠質瘤中陽性率為82.4%；在高級別膠質瘤中表達水平最低，陽性率為16.1%，差異有統計學意義（P < 0.05）。Bax表達水平與膠質瘤級別呈負相關性（Spearman相關系數為-0.706，P < 0.05）。見表3。

2.4 Caspase-3在不同病理級別腦膠質瘤組織及正常腦組織中的表達

Caspase-3在正常腦組織中陽性率為0%，在低級別膠質瘤中陽性率為100.0%，在高級別膠質瘤中陽性率為80.6%，差異有統計學意義（P < 0.05）。隨惡性程度的增高，Caspase-3表達水平有所降低（Spearman相關系數為-0.334，P < 0.05）。見表4。

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，常呈浸潤性生長，與周圍正常腦組織無明顯分界，術后易復發，患者生存率低，危害性大[6]。研究表明，膠質瘤不僅存在細胞增殖與分化障礙，同時還存在凋亡受阻，細胞增殖與凋亡的不平衡狀態是導致膠質瘤惡性生長的基礎[7]。鑒于此，控制其生長速度成為治療膠質瘤的關鍵。

Ki-67是存在于增殖細胞核內的一種非組蛋白性核內蛋白，在1983年由Scholzen等[8]研究Hodgkin淋巴瘤L428細胞系時發現。Ki-67定位于人類第10號染色體長臂上，由分子量為345 kD和395 kD的兩條多肽鏈組成，位于近核仁區[9]。它能識別G1晚期、S期和G2/M期細胞核的抗原，而處于靜息狀態的G0期和G1早期細胞缺乏此抗原。因此，臨床上常以此作為細胞增殖的標記蛋白[10]。同時，多數研究表明Ki-67能夠可靠而迅速地反映腫瘤增殖率，與多種腫瘤的發生、進展、轉移及預后相關[11]。本研究對65例膠質瘤標本及18例正常腦組織標本進行免疫組化，發現Ki-67表達水平隨膠質瘤惡性程度的升高而表達明顯，與膠質瘤病理級別呈正相關性（P < 0.05）。

近年來，隨著對膠質瘤研究的不斷深入，人們發現Bcl-2和Bax是與細胞凋亡密切相關的蛋白，主要位于細胞質內[12]。Bcl-2為凋亡抑制因子[13]，是從淋巴瘤中分離出來的原癌基因，Bcl-2基因定位于人類染色體18q21上；Bax為凋亡誘導因子[14]，定位于人類染色體19q13上，其蛋白主要存在細胞質中。當受到凋亡信號刺激時，Bax便從細胞質轉移至線粒體，再與線粒體膜上的Bcl-2相互作用從而發揮促凋亡作用。當Bcl-2/Bax比值低時，形成Bax-Bax同源二聚體，促進細胞凋亡[15]；當二者比值高時，可形成更穩定的Bax-Bcl-2異源二聚體，抑制細胞凋亡[16]，這種比率的變化是由于Bcl-2與Bax蛋白間競爭性二聚化作用的結果。在本研究中，Bcl-2與Bax均有明顯表達，但隨膠質瘤病理級別的升高，Bcl-2表達逐漸升高（P < 0.05），Bax表達逐漸降低（P < 0.05），Bcl-2/Bax比值相對升高，其抗凋亡活性增強。即膠質瘤病理分級程度越高，癌細胞抗凋亡能力越強。由此可見，Bcl-2/Bax比值的測定對于臨床上膠質瘤惡性程度的判定具有重要的參考價值。此外，Bcl-2還可調控線粒體滲透性轉換孔的開啟，抑制細胞色素色C，從而抑制Caspase-3的活化，同時Caspase-3的合成也受Bcl-2的調節抑制[17]。

Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，它通常以非活化的酶原形式存在于細胞質中，在凋亡信號的刺激作用下被激活，可對多種蛋白底物進行降解，從而在細胞凋亡過程中起重要作用[18]。研究發現，Caspase-3可通過阻滯細胞周期，裂解細胞結構物質，破壞平衡狀態及修復機制等促進細胞凋亡的發生[19]。此外，Caspase-3還可降解凋亡抑制蛋白Bcl-2，使Caspase家族成員激活并被水解后發生級聯反應，最后在核小體連接處切割DNA鏈接片段，促進細胞凋亡的發生[20]。在本研究中，Caspase-3蛋白表達陽性率在高級別膠質瘤組明顯低于低級別膠質瘤組，差異有統計學意義（P < 0.05），提示Caspase-3表達下調與膠質瘤的惡性進展密切相關。

綜上所述，Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表達與膠質瘤的惡性進展密切相關，Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平上調，Bax、Caspase-3蛋白表達水平下調，提示膠質瘤病理級別越高。同時，Ki-67、Bcl-2、Bax和Caspase-3有可能成為膠質瘤治療的有效靶點，為臨床上治療膠質瘤提供新的思路。然而膠質瘤發生、發展的根本原因可能還涉及多種凋亡基因，原癌基因及抑癌基因等，因此對膠質瘤的調控機制還有待進一步研究。

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