抑制EphA4受體活性對少突膠質前體細胞發育影響的研究

辛伽倫++++++黃冬++++++夏冬東++++++劉之榮

[摘要] 目的 探討抑制EphA4受體活性對少突膠質前體細胞（OPC）發育的影響。 方法 將分離純化的OPC隨機分為正常組、EphA4受體抑制劑處理組（EphA4-FC組）。EphA4-FC組加入250 nmol/L EphA4-FC，培養至第2天。免疫細胞化學染色法觀察正常組OPC特異性標志物NG2與EphA4受體的共表達情況；通過細胞計數觀察兩組OPC數量變化情況；通過Western blot檢測兩組細胞蛋白樣品中OPC特異性蛋白血小板源性生長因子α受體（PDGFαR）的表達變化情況。 結果 免疫細胞化學染色顯示，正常體外培養OPC高表達EphA4受體；與正常組比較，EphA4-FC組的NG2+陽性細胞數量明顯增多（P < 0.05）。Western blot顯示，與正常組比較，EphA4-FC組細胞蛋白中PDGFαR的表達顯著增高（P < 0.05）。 結論 培養的OPC上高表達EphA4受體，通過抑制EphA4受體可以促進OPC的增殖。

[關鍵詞] EphA4受體；少突膠質前體細胞；慢性腦缺血；腦白質損傷

[中圖分類號] R743.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（b）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of inhibit EphA4 receptor on oligodendrocyte progenitor cell （OPC）. Methods The purified OPC was randomly divided into normal group and EphA4-FC group （250 nmol/L， 2 d）. Immunofluorescence staining was used to observe the co-expression of NG2 （a marker for OPC） and EphA4 receptor. Cell counting was used to observe the change of OPC. Western blot was used to examine the expression of platelet-derived growth factor α receptor （PDGFαR， a marker for OPC） in two groups. Results Immunofluorescence staining showed that the high expression of EphA4 receptor on OPCs in vitro， and compared with normal group， more NG2+ cells were observed in the EphA4-FC group （P < 0.05）. Western blot showed that PDGFαR expression was significantly increased， compared with normal group （P < 0.05）. Conclusion EphA4 receptor is express highly on OPC in vitro， and inhibition of EphA4 receptor can promote OPC proliferation.

[Key words] EphA4 receptor； Oligodendrocyte progenitor cell； Chronic cerebral ischemia； White matter lesion

隨著人口老齡化進程發展，超過一半的老年人有不同程度的腦白質損傷（WML）[1]，慢性腦灌注不足是導致WML的主要原因[2-3]。腦白質的組成成分少突膠質細胞（OLs）、軸突和髓鞘對缺血高度易損，OLs的死亡丟失、軸突的變性壞死及髓鞘的脫失是WML的主要病理改變[4]。OLs來源于腦白質原位的OPC以及室管膜下區的多潛能神經干細胞[5-6]，腦白質脫髓鞘損傷后，損傷原位的OPC可通過增殖分化補充死亡丟失的OLs[7]。研究表明，Eph-Ephrin信號通路可影響OLs系的發育，如脊髓損傷后OPC和OLs上均有Eph受體表達[8]；OPC與軸突間可通過Eph-Ephrin相互作用進行遷移[9]；阻滯EphA4可促進小鼠脊髓損傷后軸突再生[10]；阻滯EphA4信號通路，可改善阿爾茲海默病小鼠模型中海馬的突觸功能障礙[11]。本課題組前期研究發現WML過程中存在OLs系的減少，同時伴隨EphA4表達變化，兩者呈負相關[12]。為此，設計本實驗探討抑制EphA4受體是否對OPC發育有影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SD仔鼠[新生3 d，SPF級，40只，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（軍）2012-0007；遵循第四軍醫大學有關實驗動物保護和使用的指南，并經第四軍醫大學實驗動物倫理委員會批準進行]。EphA4受體抑制劑EphA4-FC（R&D Systems），小鼠源性抗NG2抗體（Abcam），兔源性抗EphA4抗體（Abcam），兔源性抗PDGFαR抗體（Abcam），小鼠源性抗GAPDH抗體（康為世紀）。

1.2 方法

1.2.1 OPC細胞培養 采用本課題組前期研究的改良法培養OPC[13]，將其接種至事先包被過的含玻片的24孔培養板或培養皿中。

1.2.2 免疫細胞化學雙標記染色 取出放置于24孔板內的細胞爬片，4%PFA固定20 min；PBS沖洗5 min×3次；一抗孵育（NG2=1∶500；EphA4=1∶250），4℃冰箱內孵育過夜；次日，PBS沖洗5 min×3次；二抗孵育（Rb-biotin=1∶250；Ms-cy3=1∶250），室溫下避光孵育1 h；PBS沖洗5 min×3次；三抗孵育（avidin-cy2=1∶250），室溫下避光孵育1 h；PBS沖洗5 min×3次，甘油封片、采圖。

1.2.3 免疫細胞化學染色后細胞計數 將放置有細胞爬片的24孔板隨機分成兩組：正常組、EphA4-FC組。抑制劑處理組加入250 nmol/L EphA4-FC，培養至第2天后處理。染色方法同前，做3次以上進行數據分析，每次實驗每組細胞至少選取3張細胞爬片，每張爬片不少于20個視野，用來觀察并計數統計NG2/Hoechst+細胞，計數按雙盲原則進行。

1.2.4 Western blot 將培養有OPC的培養皿隨機分為兩組：正常組、EphA4-FC組。抑制劑處理組加入250 nmol/L EphA4-FC，培養至第2天后處理。用細胞膜蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術）提取各組細胞膜蛋白；測定蛋白濃度后制備蛋白樣品；然后依次進行制膠，上樣，電泳，轉膜，封閉；孵育一抗（PDGFαR=1∶500，GAPDH=1∶3000），4℃過夜；孵育二抗（HRP標記的山羊抗兔IgG=1∶10 000，HRP標記的山羊抗小鼠IgG=1∶10 000，康為世紀）室溫1 h；洗膜后放入化學發光儀中顯影、采圖。

1.3 統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行分析和處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 培養OPC上EphA4受體表達情況

免疫細胞化學雙標記染色法觀察培養OPC中EphA4受體的表達結果，見圖1。在正常培養的OPC細胞中，可見NG2+（紅色）細胞與EphA4+（綠色）細胞共存。Merge結果顯示，NG2+標記OPC細胞上大量表達EphA4受體，共標完全。

2.2 抑制EphA4受體活性對OPC增殖的影響

免疫細胞化學染色后通過細胞計數觀察EphA4-FC對OPC增殖的影響結果，見圖2。與正常組比較，EphA4-FC組的NG2+/Hoechst+雙標陽性細胞數量明顯增多（P < 0.05）。

2.3 抑制EphA4受體活性對OPC標記蛋白PDGFαR表達的影響

Western blot結果見圖3。與正常組比較，EphA4-FC組的PDGFαR蛋白表達量明顯升高（P < 0.05）。

3 討論

研究表明，防治WML的關鍵是補充死亡丟失的OLs[14]。OLs主要來源于SVZ區的Type-B細胞，其分化產生OPC，OPC繼續增殖后遷移至各白質區域，然后分化為成熟的OLs[15]。有研究發現，Eph受體家族成員EphA4在脊髓損傷修復中扮演了重要角色，可影響脊髓白質損傷修復及軸突再生過程[16]。本課題組在前期實驗中發現，WML存在OPC及EphA4受體表達變化[12]。為此本研究通過EphA4-FC抑制OPC上EphA4受體活性，觀察EphA4受體活性改變對OPC發育的影響。通過上述研究結果可以看出，正常培養的OPC細胞上有大量EphA4受體表達。對培養的OPC給予EphA4抑制劑處理后發現，與正常組相比，EphA4-FC組OPC細胞數量明顯增多；同時，OPC特異性標志蛋白PDGFαR表達量的增多也反映了OPC細胞數量增多。由此表明，抑制OPC上的EphA4受體活性可以促進其增殖。雖然本實驗發現EphA4受體對OPC發育有影響，但其作用機制尚不明確，通過查閱文獻發現，Eph受體下游信號通路有ERK/MAPK、Rho-GTP等[17-18]。有研究表明，ERK/MAPK是調控細胞增殖分化的重要信號通路[19]；而RhoA信號通路是神經細胞軸突再生、導向，細胞骨架重塑等的關鍵環節[20]。Eph-Ephrin信號通路的激活可抑制ERK/MAPK，但激活RhoA[21]。由此可作出推測，OPC上存在的EphA4受體可通過Eph-Ephrin信號通路激活下游的RhoA并抑制ERK，最終發揮影響OPC發育的作用，這一過程還有待進一步探討闡釋?，F有研究階段表明，抑制EphA4受體活性可促進OPC的增殖，從而補充死亡丟失的OLs，達到防治WML的目的，這為WML的防治提供了新的理論依據。

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