基于QbD理念的安宮牛黃丸整體混合終點評價方法研究

劉曉娜+鄭秋生+車曉青+吳志生+喬延江

[摘要]大品種中藥安宮牛黃丸混合終點判斷是關鍵的技術問題。基于質量源于設計（QbD）理念的控制策略，研究提出一種整體混合終點的判斷方法，為含礦物質中藥混合提供方法學。采用激光誘導擊穿光譜（LIBS）技術獲得安宮牛黃丸混合中間體的光譜數據。結合移動窗相對標準偏差法（MWRSD）法，朱砂、雄黃和珍珠粉為整合研究指標，通過比較相鄰混合時間光譜的差異，快速評價整體混合過程。雄黃、朱砂和珍珠粉3個藥味的混合過程并非完全一致，但在混合的最后一個階段，3個藥味均達到了混合均勻；得到建議混合終點。采用LIBS過程技術建立的微區時序分析方法，實施過程控制。所建立的方法無需標準光譜庫，具有分析快速、近似無損、無需復雜的樣品前處理的等特點，為大品種中藥制劑的質量研究提供新思路。

[關鍵詞]安宮牛黃丸； 混合終點； 激光誘導擊穿光譜； 質量源于設計； 過程分析技術

[Abstract]The blending endpoint determination of Angong Niuhuang Wan （AGNH） is a key technology problem The control strategy based on quality by design （QbD） concept proposes a whole blending endpoint determination method， and provides a methodology for blending the Chinese materia medica containing mineral substances Based on QbD concept， the laser induced breakdown spectroscopy （LIBS） was used to assess the cinnabar， realgar and pearl powder blending of AGNH in a pilotscale experiment， especially the whole blending endpoint in this study The blending variability of three mineral medicines including cinnabar， realgar and pearl powder， was measured by moving window relative standard deviation （MWRSD） based on LIBS The time profiles of realgar and pearl powder did not produce consistent results completely， but all of them reached even blending at the last blending stage， so that the whole proposal blending end point was determined LIBS is a promising Process Analytical Technology （PAT） for process control Unlike other elemental determination technologies such ICPOES， LIBS does not need an elaborate digestion procedure， which is a promising and rapid technique to understand the blending process of Chinese materia medica （CMM） containing cinnabar， realgar and other mineral traditional Chinese medicine This study proposed a novel method for the research of large varieties of traditional Chinese medicines

[Key words]Angong Niuhuang Wan； whole blending endpoint； laserinduced breakdown spectroscopy； quality by design； process analytical technology

安宮牛黃丸是中醫治療高熱癥的“溫病三寶”之一[1]，歷來是中醫用于治療各類急證的必備要藥。安宮牛黃丸處方的組分比較復雜，其中雄黃、朱砂比例均為10%，藥味的比重差異較大，從而影響藥效和安全性。粉末混合過程為動態變化的時間序列，其主要目的是確定混合終點，指導混合工藝優化[23]。大品種中藥安宮牛黃丸混合終點判斷是關鍵的技術問題。馬群[4]應用近紅外在線分析技術檢測安宮牛黃丸原粉混合終點，運用相似度匹配法判斷混合終點；劉珊珊等[5]采用近紅外光譜結合移動窗標準偏差法對安宮牛黃丸的中試混合過程進行在線監測；并采用高效液相色譜法驗證中間體中有效成分黃芩苷等成分的變化，驗證了近紅外在線分析技術指導混合終點判斷的可靠性。目前尚未有針對礦物質中藥的混合過程的研究，缺乏質量控制的有效方法，難以保證含礦物質中成藥質量的穩定、均一。21世紀初，美國推出了Quality by Design“QbD（質量源于設計）”理念。QbD 是一種系統的研究方法，強調對產品和工藝的理解，以及對工藝過程的控制[67]。在制藥行業，QbD的初始設計決定產品質量的理念已逐漸被業界認可。“質量可控、安全有效”是藥品研發過程須遵循的首要原則。其中，質量可控又是安全有效的前提條件。激光誘導擊穿光譜技術（laserinduced breakdown spectroscopy，LIBS）是新興的微區多元素檢測技術，是以激光脈沖作為激發源誘導產生激光等離子體的原子發射光譜[810]。在解決多指標、多成分的中藥分析時，LIBS區別于傳統的元素分析技術，具有諸多的優勢：快速、綠色、多元素檢測及近似無損的特點[11]。本研究基于QbD理念，采用LIBS過程分析技術評價安宮牛黃丸的整體混合過程，以朱砂、雄黃和珍珠粉3個藥味為研究載體，通過LIBS技術在若干時間點代表性的采樣獲得混合過程的微區光譜。以特定元素砷（As）、汞（Hg）、鈣（Ca）分析結果為斷面，快速評價安宮牛黃丸的混合過程的微區時序特征，了解含礦物質中藥粉末混合過程的規律，建立合理的質量評價方法，指導整合終點判斷；確保含礦物質中藥混合的均一性，為保證生產過程的工藝可控性提供了基礎。

1材料

黃芩、黃連、梔子、郁金、牛黃、水牛角濃縮粉、朱砂、雄黃、冰片和珍珠粉等藥材均由北京同仁堂股份有限公司科學研究所提供。安宮牛黃丸混合中間體由北京中醫藥大學馬群教授提供。模擬安宮牛黃丸的混合過程，并得到44個安宮牛黃丸混合中間體樣品（0，15，2，3，4，5 min，每隔1 min取樣至43 min）。

激光誘導擊穿光譜采用LIBS實驗系統，由北京市農林科學院，國家農業信息化工程技術研究中心友情提供；系統由激光器、光譜儀、三維精密運動平臺、CCD探測器、信號延時器組成。光譜儀采用海洋光學公司（Ocean Optics）的HR 2000+，波長范圍198～876 nm。FW4/A紅外壓片機，天津市新天光分析儀器技術有限公司。

2方法

21安宮牛黃丸混合中間體的LIBS 光譜采集

為防止激光擊打時的粉末飛濺現象，分別取安宮牛黃丸混合中間體適量，采用紅外壓片機壓制呈直徑13 mm、厚度約1 mm的錠片，共制備44個錠片樣品。光譜采集方式見圖1，計算6個采樣位點的平均光譜，即得到混合過程的微區時序光譜。

22LIBS差譜法

珍珠的主要成分有碳酸鈣。由于鈣信號同時來自其他藥味，故采用差譜法歸屬珍珠粉中Ca特征譜線。

23安宮牛黃丸混合終點判斷方法

采用移動窗標準相對偏差（moving window relative standard deviation，MWRSD）[1213]進行中間體整合終點判斷。MWRSD選擇混合中間體的n張連續的光譜，計算n張連續光譜中待測元素的特征譜線強度的相對標準偏差（RSD），剔除原n 條光譜中時間最早的光譜，補充一條新光譜，重新計算標準偏差，以此類推計算所有時序光譜數據，計算公式如下。

Ai，Aij分別為i，ij時混合中間體的LIBS光譜中砷元素或汞元素的相對信號強度。此處選擇移動窗口n=3；每次增加1個樣品，連續移動。最終得到混合過程中不同取樣點中間體樣品光譜的標準偏差。以RSD為縱坐標，混合時間為橫坐標作圖。RSD越小，表明元素的特征譜線信號強度變化小，混合越均勻，提示混合終點。

劉曉娜等：基于QbD理念的安宮牛黃丸整體混合終點評價方法研究24數據處理和軟件

采用OOILIBS （Ocean Optics） 軟件讀取光譜數據；采用ORIGIN 8軟件畫圖。

3結果

31安宮牛黃丸混合中間體的LIBS光譜

混合過程中15 min混合中間體的LIBS 光譜見圖2。混合中間體的特征譜線除了Ca，鉀（K），鈉（Na），鎂（Mg），鋰（Li），碳（C），氫（H），氧（O），氮（N），等；同時出現As（228816，234984，616979 nm）和Hg（253651，296732，313123 nm）。譜中590～610 nm處受到基質效應影響，但并未影響As，Hg的特征譜線。225～260 nm的局部放大圖見圖3，As 228816 nm，Hg 253651 nm處特征譜線未受到其他元素的干擾[1415]。因此，選擇此處特征譜線，研究安宮牛黃丸混合過程中礦物藥雄黃、朱砂的變化規律。

32Ca的LIBS差譜

Ca的特征譜線有315839，370627，373668，393379，396829，422640，430228，487704，534970，558842，585802，612715，616231，643965，646284，649403，714852，720267，732426，849760，849760，854172 nm [1618]。Ca同時來自于植物藥材和珍珠粉，故將30 min 混合中間體LIBS 譜與0 min 譜做差譜，然后比對0 min 樣本與差譜之間的光譜差異，見圖4，最終選定特征譜線393379，585746，643965，854172 nm為珍珠粉中Ca的光譜信號。

33安宮牛黃丸整體混合終點判斷

331朱砂和雄黃混合終點判斷采用MWRSD法對LIBS實驗數據進行處理，設定10%為閾值。將混合過程進行劃分時段，As和Hg在不同的特征譜線處的MWRSD變化趨勢圖見圖5。圖5 （a） 劃分4個階段，在混合的前20 min，Hg 53651 nm處的MWRSD變化劇烈；隨著混合的進行，B段（20～27 min）MWRSD相對較平穩，且MWRSD小于10%；進一步混合，C段（27～37 min）中MWRSD出現較大幅度波動；D段（37～43 min）MWRSD呈相對平穩階段且MWRSD小于10%，提示到達混合終點到達。與Hg相似，As 228816 nm的混合可以劃分了4個階段，見圖5 （b）。A段（0～27 min）和C段（32～38 min）過程中MWRSD變化劇烈；B段（21～28 min）和D段（38～43 min）過程中MWRSD保持相對平穩，且MWRSD小于10%。雖然As和Hg在B段均出現相對平穩顯現，但混合并不完全，并非混合終點。綜合考慮，As和Hg的混合終點D段，建議混合終點為38 min。

332珍珠粉的混合終點判斷珍珠粉是安宮牛黃丸的組成成分之一，其主要成分是碳酸鈣。珍珠粉的混合是否與朱砂、雄黃的混合過程一致，混合終點是否一致？研究探討安宮牛黃丸混合過程中，珍珠粉的混合過程變化特點和規律。混合過程中Ca在不同的特征譜線處的MWRSD變化趨勢圖見圖6。圖6 （a） 劃分了4個階段，在混合的前20 min，Ca 393379 nm處的MWRSD變化劇烈；隨著混合的進行，B段（20～29 min）MWRSD相對平穩，MWRSD小于10%；進一步混合，C段（29～38 min）中MWRSD出現波動；D段（38～43 min）MWRSD呈相對平穩階段且MWRSD小于10%，提示到達混合終點。圖6 （b） 顯示2個混合階段，A段 在混合開始的前13 min，Ca 585746 nm處的MWRSD變化劇烈，提示激烈混合的過程；B段在混合13～43 min過程中MWRSD相對平穩，且均小于10%，表明在此階段混合較平穩。圖6（c）中Ca 643965 nm處的MWRSD變化趨勢圖與圖6 （a） Ca 393379 nm處的MWRSD變化趨勢圖相似，混合分為4個階段；A段（0～21 min）和C段（27～38 min）過程中MWRSD變化劇烈；B段（21～28 min）和D段（38～43 min）過程中MWRSD保持相對平穩，而且MWRSD小于10%。與圖6 （a）、圖6（c）相似，圖6（d）中Ca 854172 nm處的MWRSD變化同樣呈現4個階段，在混合開始的13 min，MWRSD變化劇烈，隨著混合的進行，B段（13～27 min）內MWRSD變化平穩，進一步混合，在混合的27～38 min 時MWRSD出現微小波動，在38 min 后（D段）MWRSD相對平穩且小于10%。Ca在4個特征譜線處處特征譜線的建議混合終點為38 min。

3333個藥味整體的混合終點判斷LIBS技術結合MWRSD的朱砂、雄黃和珍珠粉在B段和D段的微區時序混合分析結果見圖 7。對比發現在B段 Hg與Ca共同時間段為21～27 min；但是As即雄黃在B段混合相對均勻時間段為27～31 min；表明在B段雄黃與朱砂和珍珠粉的混合并非同步。在D段（Ca 585746 nm為D段），其他元素共同時間段為38～43 min，表明3個藥味同時達到了混合均勻；故朱砂、雄黃和珍珠粉的共同混合終點為38 min。

4討論

QbD理念正推動著藥品生產模式從傳統的以檢驗為主到以科學地研究生產過程為主。ICH發布

的Q8（pharmaceutical development，Q8）藥物研發中指出，質量是通過設計賦予的。獲得合格的質量，必須加強對產品的理解和對成產的全過程控制。ICH Q8的控制策略為“源于對現行產品和工藝的理解，制定一系列有計劃的控制，用于確保工藝性能與產品質量的[6]。所有產品的質量屬性和工藝參數，均屬于ICH Q8控制策略范疇。QbD理念，要求生產過程中對工藝過程進行“實時質量保證”，保證每個步驟工藝的輸出均符合質量要求。關鍵工藝參數合格即可保證產品質量達到要求。

粉末混合過程是中藥固體制劑生產的重要操作單元之一，也是時序過程。藥物混合均勻度直接影響藥品的療效。藥物混合均勻度直接影響藥品的療效。安宮牛黃丸是一種完全以藥材原粉入藥的中藥丸劑，其處方的組分比較復雜，植物性藥材、動物性藥材和礦物性藥材同時出現在處方中，導致藥味的比重差異較大，尤其是含重金屬礦物質如朱砂、雄黃等中藥制劑的混合均勻與否不僅影響其療效，而且嚴重影響其用藥安全。對于中藥的混合過程的評價多采用離線液相色譜法、氣相色譜法等對其判斷。這些方法雖然準確度高，但樣品處理復雜，且多以研究有機化合物為主，未考慮礦物質中藥的混合特征。

本文基于QbD控制策略，將LIBS過程技術應用于安宮牛黃丸的整體混合過程，結合MWRSD法研究雄黃、朱砂和珍珠粉3個藥味的微區時序特征。構建的金屬元素快速檢測方法，實現整體混合終點的快速判斷，確保混合均勻。結果表明：在混合的整個時序過程中，初始階段物料混合相對劇烈，混合效率高，到達最佳的混合狀態后反方向變換，出現偏析或分料現象；隨著進一步混合，顆粒以擴散混合為主。在整個混合過程中物料的混合和分離同時發生，當二者達到動態平衡的狀態即混合終點。研究發現物料混合均勻的時間不是一個固定的時間點，而且是一個時間段，超過此時間段，粉末會出現過混合現象。雄黃、朱砂和珍珠粉的混合過程并非完全一致，但在混合的最后一個階段，3個藥味均達到了混合均勻；得到建議混合終點，且無過混合現象發生。所建立的方法無需建立標準光譜庫，通過比較時間序列中相鄰混合時間的光譜差異，實現了朱砂、雄黃和珍珠粉混合終點的快速判斷。

過程分析技術（PAT）屬于第三級控制策略，其目的在于增加過程理解、提高生產效率和產品質量，其優勢在于實時分析、監測、控制。LIBS技術屬于PAT技術，在微區時序分析研究方面彰顯了其快速、實時、近似無損等優勢，有望用于中藥混合過程的回饋控制，有效避免過度混合和資源浪費。將PAT技術應用于中藥材粉末的混合過程，研究混合過程時序變化的特點和規律，對過程理解具有重要的意義，同時為含礦物質中藥制劑混合的在線監測提供了技術支持。

[參考文獻]

[1]王欣美， 張甦， 王枚博， 等 安宮牛黃丸體外安全性評價方法的研究[J] 光譜學與光譜分析， 2015， 35（1）： 238

[2]薛忠， 徐冰， 張志強， 等 藥物粉末混合過程在線監控技術研究進展[J] 中國藥學雜志， 2016， 51（2）： 91

[3]楊嬋， 徐冰， 張志強， 等 基于移動窗F檢驗法的中藥配方顆粒混合均勻度近紅外分析研究[J] 中國中藥雜志， 2016， 41（19）： 3557

[4]馬群 安宮牛黃丸生產過程質量評價方法研究[D] 北京： 北京中醫藥大學， 2007

[5]劉倩. 中藥粉末混合過程分析和中試放大效應研究[D]. 北京：北京中醫藥大學， 2014.

[6]徐冰， 史新元， 喬延江， 等 中藥制劑生產工藝設計空間的建立[J]中國中藥雜志， 2013， 38（6）： 1001

[7]劉倩 中藥粉末混合過程分析和中試放大效應研究[D] 北京：北京中醫藥大學， 2014

[8]Hahn D W， Omenetto N Laserinduced breakdown spectroscopy （LIBS）， part I： review of basic diagnostics and plasmaparticle interactions： stillchallenging issues within the analytical plasma community[J] Appl Spectrosc， 2010， 64（12）： 335

[9]Hahn D W， Omenetto N Laserinduced breakdown spectroscopy （LIBS）， part Ⅱ： review of instrumental and methodogical approaches to material analysis and applications to different fields[J] Appl Spectrosc， 2012， 66（4）： 347

[10]Singh V K， Rai A K Prospects for laserinduced breakdown spectroscopy for biomedical applications： a review[J] Laser Med Sci， 2011， 26 （5）： 673

[11]Cremers D A， Chinni R C Laserinduced breakdown spectroscopy—capabilities and limitations[J] Appl Spectrosc Rev， 2009， 44（6）： 457

[12]Blanco M， GozálezBaó R， Bertran E Monitoring powder blending in pharmaceutical processes by use of near infrared spectroscopy[J] Talanta， 2002， 56： 203

[13]Scheibelhofer O， Balak N， Wahl P R， et al Monitoring blending of pharmaceutical powders with multipoint NIR spectroscopy[J] AAPS Pharm Sci Tech， 2013， 14（1）： 234

[14]Kwak J H， Lenth C， Salb C， et al Quantitative analysis of arsenic in mine tailing soils using double pulselaser induced breakdown spectroscopy[J] Spectrochimica Acta Part B， 2009， 64： 1105

[15]Fang X， Ahmad S R Detection of mercury in water by laserinduced breakdown spectroscopy with sample preconcentration[J]. Appl Phys B， 2012， 106： 453

[16]Anzano J， Lasheras R J Strategies for the identification of urinary calculus by laser induced breakdown spectroscopy [J] Talanta， 2009， 79（2）： 352

[17]Kurniawan K H， Tjia M O， Kagawa K Review of laserinduced plasma， its mechanism， and application to quantitative analysis of hydrogen and deuterium [J]Appl Spectrosc Rev， 2014， 49（5）： 323

[18]Bahreini M， Ashrafkhani B， Tavassoli S H Elemental analysis of fingernail of alcoholic and doping subjects by laserinduced breakdown spectroscopy[J] Appl Phys B Lasers Opt， 2014， 114（3）： 439

[19]Liu Xiaona， Ma Qun， Liu Shanshan， et al Monitoring As and Hg variation in AnGongNiuHuang Wan （AGNH） intermediates in a pilot scale blending process using laserinduced breakdown spectroscopy[J] Spectrochim Acta Pt A Mol Bio， 2015， 15： 1547[責任編輯孔晶晶]