基于QbD理念的三七總皂苷定量分析方法持續改進研究

戴勝云++徐冰+史新元+徐翔+孫英強+喬延江

[摘要]該文提出基于質量源于設計（QbD）的中藥分析方法持續改進策略。以三七總皂苷（PNS）5種皂苷類成分的超高效液相色譜（UPLC）定量分析方法開發為例，完成分析方法從HPLC到UPLC的轉換。在UPLC開發中，采用PlackettBurman設計和BoxBehnken設計理解關鍵方法參數（CMP）與關鍵方法屬性（CMA）之間的關系，建立貝葉斯概率設計空間；優選穩健色譜條件為初始乙腈20%，等度時間10 min，梯度變化速率6 %·min-1，分析時間17 min，采用Accuracy profile進行方法學驗證。在相同的分析目標（ATP）下，從色譜條件、CMP辨識結果、CMPCMA關系模型、系統適用性等方面對PNS 的HPLC和UPLC定量分析性能的一致性進行比較，結果表明UPLC可縮短分析時間、提高關鍵峰對分離度、色譜系統適用性滿足要求，UPLC可替代HPLC進行PNS定量分析。

[關鍵詞]質量源于設計； UPLC； 持續改進； 貝葉斯設計空間； 三七總皂苷

[Abstract]This study is aimed to propose a continual improvement strategy based on quality by design （QbD） An ultra high performance liquid chromatography （UPLC） method was developed to accomplish the method transformation from HPLC to UPLC of Panax notogineng saponins （PNS） and achieve the continual improvement of PNS based on QbD， for example PlackettBurman screening design and BoxBehnken optimization design were employed to further understand the relationship between the critical method parameters （CMPs） and critical method attributes （CMAs） And then the Bayesian design space was built The separation degree of the critical peaks （ginsenoside Rg1 and ginsenoside Re） was over 20 and the analysis time was less than 17 min by a method chosen from the design space with 20% of the initial concentration of the acetonitrile， 10 min of the isocratic time and 6%·min-1 of the gradient slope At last， the optimum method was validated by accuracy profile Based on the same analytical target profile （ATP）， the comparison of HPLC and UPLC including chromatograph method， CMA identification， CMPCMA model and system suitability test （SST） indicated that the UPLC method could shorten the analysis time， improve the critical separation and satisfy the requirement of the SST In all， HPLC method could be replaced by UPLC for the quantity analysis of PNS

[Key words]quality by design； UPLC； continual improvement； bayesian design space； Panax notogineng saponins

三七Panax notoginseng（Burk）FHChen為五加科植物，具有散瘀止血、消腫止痛之功效[1]。三七總皂苷（Panax notogineng saponins，PNS）為三七主根或根莖經加工制成的總皂苷提取物，已收錄在《中國藥典》2015 年版一部[2]。藥典中PNS 5種皂苷類成分的含量測定采用HPLC，乙腈水梯度洗脫，流速15 mL·min-1。該法分析時間長，流速大、流動相消耗大，系統背壓偏高，峰型也不盡理想。筆者曾嘗試采用質量源于設計（quality by design，QbD）方法提高PNS分析方法性能。第1次方法改進時采用色譜柱（46 mm×150 mm，5 μm），將流速降低到1 mL·min-1，但分析時間沒有變化[3]。第2次方法改進選擇色譜柱（46 mm × 75 mm，25 μm），流速為08 mL·min-1，分析時間縮減到36 min，關鍵分離度為160，基本達到色譜分離的要求[4]。

超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）具有高效、靈敏、快速的優點。本次研究中以三七總皂苷UPLC開發為例，完成分析方法從HPLC到UPLC的轉換，期望縮短分析時間，減少有機溶劑消耗，并實現PNS分析方法的持續改進。在PNS的UPLC開發中，首先定義分析目標（analytical target profile，ATP），然后采用風險評估（risk evaluation）辨識關鍵方法屬性（critical method attributes，CMAs）和鍵方法參數（critical method parameters，CMPs），采用回歸模型建立CMAs和CMPs關系模型，基于模型開發分析方法設計空間（design space，DSp），最后基于DSp優化分析條件。方法開發完成后，以CMPsCMAs關系模型的準確性和系統適用性是否改變為判斷標準，為評價分析方法改進的有效性，為新分析方法的應用提供參考。

1材料

11儀器與試劑

Acquity UPLC HClass 超高效液相色譜儀，包括四元泵處理器、樣品處理器、柱溫箱、TUV 檢測器及Empower 色譜工作站（Waters 公司）；AG135型電子分析天平（1/1萬，Sartorius公司）；BT25S型電子分析天平（1/10萬，Sartorius公司）；KQ100型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，100 W，40 KHz）。

三七總皂苷提取物（批號ZL20141208，質量分數>80%）購自南京澤朗生物科技有限公司；三七皂苷R1（批號10745201318，純度≥98%）；人參皂苷Rg1（批號110703201530，純度≥98%）；人參皂苷Re（批號110754201525，純度≥98%）；人參皂苷Rb1（批號110704201424，純度≥942%）和人參皂苷Rd（批號111818201302，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜級，乙腈為質譜級（賽默飛世爾科技有限公司）；水為屈臣氏蒸餾水。

12數據分析軟件

DesignExpert V 80 （StatEase公司），Sigmplot 125（Aspire Software Intl，Ashburn，VA，USA），Matlab 2009a（Mathworks公司），數據處理程序自行編寫，JMP（SAS公司）。

2方法與結果

21色譜條件

采用Acquity UPLC BEH色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm）；流動相為乙腈水先等度后梯度洗脫，檢測波長203 nm，進樣量2 μL，流速、柱溫、梯度洗脫程序由試驗設計確定。

22供試品溶液的制備

稱取三七總皂苷提取物約25 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度線，搖勻，022 μm微孔濾膜過濾，續濾液備用。

23對照品溶液的制備

分別精密稱取三七總皂苷中5種對照品適量，加70%甲醇溶解，分別從5種對照品中取一定量配制混合對照品，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的質量濃度分別為0251 7，1266，0232 3，1260 1，0293 4 g·L-1。

24PlackettBurman設計

PlackettBurman設計是部分析因設計用于篩選的備選設計。主要針對因素數較多且未確定眾因素相對于響應變量的顯著性時采用的試驗設計方法，能用最少實驗次數篩選出因素的主效應，從眾多考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素供進一步研究。

241參數設定選取柱溫（A）、梯度變化速率（B）、流速（C）、等度時間（D）、初始乙腈濃度（E）為考察因素。根據預試驗結果，為每個因素設定2個水平進行，見表1。梯度洗脫見表2。

242PlackettBurman設計結果與分析將設定的參數水平輸入JMP軟件的DOE篩選試驗設計中，選擇PlackettBurman設計，共12次，得到一個設計表。響應變量選取人參皂苷Rg1和人參皂苷Re的分離度和分析時間共2個指標進行考察。根據試驗設計進行，并將結果輸入響應中，見表3。

采用最小二乘法進行效應篩選模型擬合，分別得到2個關鍵方法屬性與5個潛在關鍵方法參數Pareto分析圖，見圖1。圖中黑色條框代表參數與響應成負相關關系，白色條框代表參數與響應成正相關關系，當P<005時說明參數對響應值影響明顯，該參數為關鍵方法參數。對分析時間而言，初始乙腈濃度、梯度變化速率和等度時間模型P<005，故可作為關鍵方法參數；同樣，梯度變化速率為關鍵分離度的關鍵方法參數。

此外，通過最小二乘法模型運算得到因素刻畫圖，見圖2。該圖為動態演示圖，主要體現2個方面，一方面是因素之間是否存在相互作用，通過移動其中任何一個因素，若其他因素斜率發生改變則表明涉及因素間的交互作用，這一部分是Pareto圖分析不能體現的內容；另一方面是參數對響應值影響的重要程度，主要通過觀察預測跡的斜率。本實驗中，未發現各因素間存在交互作用，而等度時間和梯度變化速率對2個響應值具有一定的斜率且均較明顯，初始乙腈濃度對2個響應值具有一定的斜率但不及前2個因素明顯，流速和溫度對2個響應值影響不明顯。因此，綜合考慮5個因素對各響應值的影響，等度時間、初始乙腈濃度和梯度變化速率為關鍵方法參數進行進一步的考察，而影響較小的因素則選擇一個常用值，如柱溫選擇室溫25 ℃，流速04 mL·min-1進行后續實驗。

25BoxBehnken試驗設計

BoxBehnken設計與析因設計相比，可以明顯減少實驗次數，提高實驗效率，降低實驗的成本。

251參數設定根據PlackettBurman設計考察結果，選擇梯度變化速率、等度時間、初始乙腈濃度為因素進行實驗。因素水平、BoxBehnken因素設計見表4。

252BoxBehnken設計結果與分析將表4中的內容輸入Design Expert806軟件的BoxBehnken響應面試驗設計中，共17次實驗，見表5。以人參皂苷Rg1和人參皂苷Re間的分離度、分析時間為關鍵方法屬性進行優化。

根據結果，分別以分析時間和分離度為響應值，建立響應值與3個關鍵影響參數梯度變化速率、初始乙腈濃度和等度時間之間的二項式模型，模型P<005，具有顯著性，并且模型決定系數R2分別為0999 9，0878 1，表明模型擬合程度良好，可以解釋關鍵影響因素與關鍵方法屬性之間的相互關系。

26設計空間開發及其可靠性研究

BoxBehnken試驗設計是響應面設計中的一種，而設計空間又是在BoxBehnken試驗設計數據上建立的，故可認為設計空間的建立是基于預測響應面[5]。由于建立色譜方法時往往會牽涉到多個色譜參數和多個響應，因而設計空間應該是多個響應面的綜合。然而Peterson[6]提出，這樣由多個響應變量建立的設計空間有2個主要缺點，將直接導致設計空間的不可靠，其中一個缺點是模型參數

不確定性，另一個缺點是沒有考慮多元回歸模型誤差向量的相關結構。因此，在建立設計空間時，有必要同時考慮這2個缺點來確保設計空間的可靠性，這樣才能滿足ICH Q8指南中對設計空間定義中的“保證質量”這一項要求，Bayesian理論恰好能同時考慮模型參數的不確定性和數據結構的相關性。根據Bayesian理論，Bayesian后驗預測概率可以通過下式來計算[7]。

Pr（yA|x，data）（1）

其中，x是過程參數向量，y是響應值向量，A是具有規定閾值的可接受范圍，data是實驗數據，Pr代表響應值在可接受范圍內的概率，故設計空間可以用下式表示。{x：Pr（yA|x，data）≥π}（2）其中，π表示能“確保質量”的設計空間預定義可靠性的概率。那些不確定因素對模型響應的影響應用Monte Carlo仿真模擬來估計。

在建立貝葉斯設計空間之前，首先要確定分析目標。本實驗中，選擇2個分析目標：①實現三七總皂苷中5種皂苷的基線分離，尤其是人參皂苷Rg1和人參皂苷Re；②縮短分析時間，提高分析效能，基于貝葉斯概率可建立一個多目標設計空間。

根據分析目標，選擇關鍵分離度（Rcrit）和分析時間（t）作為三七總皂苷色譜分離的關鍵方法屬性，該多變量設計空間可以用下式表示。

DS={x0X|Eθ[Pr（Rcnt>λ1，t>λ2）|θ]≥π（3）

其中，x0是整個實驗區域X中的一個點，λ1和λ2是關鍵分離度與分析時間的可接受閾值，π為要求達到的質量水平的貝葉斯概率值，θ為模型評估參數的數據集，Pr和E代表概率的估計值和數學期望值。

一般而言，關鍵分離度Rcrit至少應該大于15，而對于分析時間t，考慮到中藥的復雜性和UPLC特點，將其設置為17 min，設計空間就是理論上的穩健區域，區域中預測標準值高于可接受閾值并且盡可能至少達到此閾值[8]。此外，利用網格搜索法在整個實驗范圍內進行貝葉斯聯合后驗概率的計算，滿足2個分析目標的貝葉斯后驗預測概率通過對每個網格進行1萬次的Monte Carlo仿真模擬計算得到[810]。

目前并沒有一個針對色譜分析公認的概率閾值，故在本研究中選擇88%作為π的基本標準建立設計空間，見圖3，圖中設計空間用黑線條描繪出來，設計空間內表示同時滿足關鍵分離度和分析時間2個目標要求的概率至少大于88%，顏色越深，概率越大。

通過對三七總皂苷色譜分析過程的優化，采取Bayesian概率評價設計空間的可靠性，最后優化得到的分析方法的預測結果為10 min的等度時間，6 %·min-1的梯度變化速率和20%的初始乙腈濃度，此時可以實現三七總皂苷中5個成分的完全分離，見圖4。

27方法驗證

選擇Accuracy profile[11]進行方法驗證，分3 d進行，選擇4個樣品濃度，每個濃度進行3次重復，一共進行3×4×3次，即36次實驗。三七總皂苷樣品的4個質量濃度分別是125，25，30，50 g·L-1。每個濃度分別重復3次，實驗分3 d考察方法的中間精密度。根據全析因設計和β期望容許區間計算Accuracy Profile中各個參數的值，驗證試驗采用matlab自行編寫的程序進行計算。

271真實性真實性代表總誤差理論中的系統誤差，分別用每個濃度3 d重復3次數據的相對偏差表示。5個成分相對偏差都小于5%，這說明優化后方法的真實性可接受，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd方法驗證的結果見表6～10。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 4個成分的相對偏差都小于3%，而人參皂苷Re前2個濃度水平的相對偏差分別為35%，32%，這可能因為人參皂苷Re含量較低，測量時存在偏差會比其他4個成分稍大。

272精密度精密度與總誤差理論中的偶然誤差有關，包括2個方面，分別是重復性和中間精密度，二者都用RSD表示。5個成分在4個濃度水平的重復性和中間精密度的RSD都小于2%，意味著優化后方法的偶然誤差在可接受范圍內，見表6～10。

273準確性準確性代表著誤差理論中偶然誤差與系統誤差值之和，即總誤差。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5個成分在90%β容許區間內并且可接受限

為5%的準確性，見表6～10，輪廓圖見圖5。除人參皂苷Rd以外，其他4個成分在設置的4個濃度水平都分布在可接受范圍內，說明優化后的方法其準確性在設定的樣品濃度范圍內是可以接受的。但人參皂苷Rd則在第4個濃度水平處超過了5%可接受限，說明其濃度范圍比其他4個成分濃度范圍窄。此外，優化后方法在對三七總皂苷中5個成分進行分析時，不同成分的分析范圍不一樣，但方法準確性可接受。三七皂苷R1的分析范圍為0094 61～0378 4 g·L-1，人參皂苷Rg1為0374 2～1497 g·L-1，人參皂苷Re為0039 16～0156 6 g·L-1，人參皂苷Rb1為0448 7～1795 g·L-1，人參皂苷Rd為0132 4～0493 2 g·L-1。

a 三七皂苷 R1；b人參皂苷 Rg1；c人參皂苷 Re；d人參皂苷 Rb1；e人參皂苷 Rd；綠色點為每個濃度每次試驗的相對誤差，紅色實線為相對偏差，藍色折線表示90%β期望容許區間，黑色點直線為±5%可接受限。

274最低定量限每個成分的最低定量限（limit of qualification，LOQ）也可從準確性輪廓圖中看出，準確性輪廓限制線與90% β容許區間限制線的交叉點即為最低定量限。從試驗設計的濃度來看，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5個成分的最低定量限分別為0094 61，0374 2，0039 16，0448 7，0132 4 g·L-1。

275線性為了考察方法的線性，對36次實驗數據采取線性回歸模型擬合方式得到5個成分的線性方程，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd的線性方程分別為Y=4928+1510×106X，Y=-1359+1706×106X，Y=-0479 5+1849×106X，Y=0917 9+1313×106X和Y=1907×104+1570×106X，此5個成分線性方程對應的相關系數均大于0999 5，表明方法的線性良好。

28方法持續改進前后定量分析性能比較

在相同的分析目標（ATP）下，從色譜條件、CMP辨識結果、CMPCMA關系模型、系統適用性等方面對筆者前期建立的三七總皂苷HPLC分析[34]和UPLC分析的性能進行比較，見表11。UPLC中選擇色譜柱（21 mm × 100 mm，17 μm）進行方法開發，人參皂苷Rg1和Re之間的分離度有較大改善，達到210以上，同時分析時間縮短到17 min，見圖6。從CMPCMA關系模型角度來看，采用的試驗設計方法一致，關鍵影響參數一致，模型R2符合要求，而設計空間的閾值更高，說明改進以后方法的穩健性更高，更能夠滿足預定義目標。本次改進方法同樣經過accuracy profile方法學驗證，真實性、中間精密度、重復性、分析總誤差和線性均符合要求。因此，改進后的分析方法同樣滿足藥典中PNS的定量分析要求，利于三七總皂苷質量控制，應用QbD工具提高了分析方法開發的效率和可靠性。

3總結

本研究建立了UPLC測定三七總皂苷中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd 5種皂苷的Bayes概率設計空間，該方

法一改常規單因素考察建立操作條件單一的色譜方法，而是基于科學和風險管理原則開發色譜方法的設計空間，增加了對三七總皂苷色譜分析過程的理解，設計空間內色譜條件的改變不會引起分析性能的改變，提高了色譜方法的穩健性。

QbD希望在藥品監管和藥品分析中取得一個平衡，實現監管者、分析者和使用者三者之間共贏[12]。本研究在前期研究基礎上對分析方法進行持續改進，提出采用CMPsCMAs關系模型的擬合和預測指標，以及關鍵分離度、選擇性、塔板數等系統適用性指標，評價持續改進效果和改進前后分析性能的一致性，更大程度提高方法的可靠性和可維護性，既滿足監管要求，又有利于新技術的應用。

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