川麥冬高效液相色譜指紋圖譜研究

郭明里，張加余，王 冰，李 寧，，董婷霞，詹華強(qiáng)，屠鵬飛

（1．香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2．北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100029；3．上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203； 4．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

·實(shí)驗(yàn)研究·

川麥冬高效液相色譜指紋圖譜研究

郭明里1，張加余2，王 冰3，李 寧1，4，董婷霞1，詹華強(qiáng)1，屠鵬飛4

（1．香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057； 2．北京中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，北京 100029；3．上海中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203； 4．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

目的建立一種新的川麥冬高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析方法。方法以HPLC法對(duì)10批川麥冬藥材的指紋圖譜進(jìn)行分析，采用8個(gè)對(duì)照品對(duì)部分共有峰進(jìn)行指認(rèn)，利用相似度分析、相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分析進(jìn)一步對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析。結(jié)果10批川麥冬藥材的相似度均大于0．900，各批次藥材共有峰的相對(duì)峰面積在較寬范圍內(nèi)波動(dòng)，RSD＝7．1% ～71．9%(n＝10）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、實(shí)用，便于工業(yè)化生產(chǎn)，可用于麥冬藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

麥冬；高效液相色譜；指紋圖譜；質(zhì)量評(píng)價(jià)

麥冬為百合科（Liliaceae）沿階草屬（Ophiopogon）植物麥冬 Ophiopogon japonicus（L．f．）Ker－Gawl．的干燥塊根，具有養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心之功效，用于肺燥干咳、陰虛癆嗽、喉痹咽痛、津傷口渴、內(nèi)熱消渴、心煩失眠、腸燥便秘等癥[1]。麥冬為常用中藥，用藥歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》始載并將其列為上品，歷代重要本草均有記載，亦為《中國(guó)藥典》所收載。麥冬的傳統(tǒng)主產(chǎn)地為浙江和四川兩省，分別稱(chēng)之為浙（杭）麥冬和川麥冬。浙（杭）麥冬主產(chǎn)于杭州東南慈溪、蕭山等地，生產(chǎn)周期通常為2～3年，栽培面積及產(chǎn)量隨市場(chǎng)行情波動(dòng)較大。川麥冬集中栽培于四川省綿陽(yáng)市三臺(tái)縣等地，其栽培期僅1年，具有生長(zhǎng)期短、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，曾為我國(guó)最大的麥冬產(chǎn)地[2]。目前，川麥冬是市場(chǎng)主流的麥冬商品藥材。

麥冬含有甾體皂苷、高異黃酮、多糖及其他多種類(lèi)型的化學(xué)成分[3]。有關(guān)川麥冬的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，近年來(lái)學(xué)者們從多成分含量測(cè)定[4－7]、指紋圖譜[8－9]、有害物質(zhì)檢測(cè)[4，10]等諸多方面開(kāi)展了研究。前期研究報(bào)道，對(duì)川麥冬的化學(xué)成分進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，并從中分離鑒定了一系列甾體皂苷及高異黃酮類(lèi)化合物[11－12]。在此基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜－紫外光－蒸發(fā)光散射器檢測(cè)（HPLC－UV－ELSD）法建立了一種麥冬化學(xué)指紋圖譜的分析方法，結(jié)合相似度分析、聚類(lèi)分析、主成分分析等方法可實(shí)現(xiàn)川麥冬和浙（杭）麥冬的區(qū)分鑒別[9]。該方法側(cè)重于綜合運(yùn)用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，對(duì)不同產(chǎn)地藥材進(jìn)行真實(shí)性鑒定。

中藥注射劑是在口服方劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代新劑型，它改變了傳統(tǒng)的給藥方式，有效成分經(jīng)提取精制后直接進(jìn)入人體，不僅保留了中醫(yī)藥傳統(tǒng)的治療特色，也具備化學(xué)藥生物利用度高、起效迅速的優(yōu)勢(shì)[13]。目前，麥冬已廣泛用于中藥注射劑的生產(chǎn)，代表性品種參麥注射液已列入國(guó)家基本藥物目錄。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年參麥注射液在全國(guó)城市公立醫(yī)院中成藥市場(chǎng)份額排名中位于第13位，在全國(guó)縣級(jí)公立醫(yī)院中成藥市場(chǎng)份額排名中居第7位，是臨床常用的中藥注射劑大品種[14－15]。隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)麥冬相關(guān)的中藥注射液的安全性、有效性和可控性提出了更高要求。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局將參麥注射液列為中藥注射劑安全性再評(píng)價(jià)的首批評(píng)價(jià)品種[16]。中藥注射劑的質(zhì)量與藥材質(zhì)量密切相關(guān)，研究中藥成分從藥材到制劑的質(zhì)量傳遞規(guī)律，針對(duì)主要移行成分開(kāi)發(fā)適用于工業(yè)生產(chǎn)的指紋圖譜分析方法，以此對(duì)藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，對(duì)于提高制劑質(zhì)量具有重要意義。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究中對(duì)川麥冬的指紋圖譜進(jìn)行了進(jìn)一步研究，建立了新的分析方法。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

1200型高效液相色譜儀，配置四元泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)Agilent公司）；BP221S型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；Sedere Sedex 75型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD，法國(guó)Sedere公司）；R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；Bransonic 2510E－MTH型超聲波清洗機(jī)（美國(guó)Branson公司）。

1．2 試藥

龍腦－2－O－β－D－呋喃芹糖基－（1→6）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－1），麥冬皂苷元 －3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－2），麥冬皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－3）、偏諾皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基 －（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－4），14－羥基薯蕷皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－5），14－羥基薯蕷皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－6）、麥冬皂苷 D（S－7）和薯蕷皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－8），共8個(gè)對(duì)照品均為自制，其結(jié)構(gòu)經(jīng)質(zhì)譜、1HNMR及13C－NMR確證，純度經(jīng)HPLC－ELSD峰面積歸一化法檢測(cè)不低于98%；乙腈（德國(guó)默克股份兩合公司）為色譜純；甲醇（德國(guó)默克股份兩合公司）為色譜純；試驗(yàn)用水為超純水；其余試劑均為分析純；C18固相萃取柱（500 mg／4 mL，Alltech公司）。10批麥冬藥材，編號(hào)分別為 OJ－1～OJ－10（產(chǎn)地均為四川省，2014年12月購(gòu)于成都荷花池中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)）。所有樣品均經(jīng)李寧博士鑒定，標(biāo)本保存于香港科技大學(xué)深圳研究院。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈－甲醇（3∶1）為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相 B，進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，30%A；10～25 min，30% ～48%A；25～45 min，48%A；45～50 min，48% ～55%A；50～65 min，55% ～65%A；65～85 min，65% ～100%A；85～100 min，100%A）；流速：1 mL／min；柱溫：30℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)漂移管溫度：40℃，氣體壓力：2．5 bar；進(jìn)樣量：20 μL。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱(chēng)取對(duì)照品S－1、S－2、S－3、S－4、S－5、S－6、S－7、S－8適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL分別含上述對(duì)照品 0．10，0．05，0．10，0．05，0．10，0．05，0．05，0．05 mg的混合對(duì)照品溶液，即得。

供試品溶液：取麥冬藥材粉末約2．0 g，精密稱(chēng)定，置100 mL三角瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，搖勻，密封，超聲提取30 min（功率100 W，頻率40 kHz），濾過(guò)，濾液50℃減壓蒸干。殘?jiān)? mL水溶解，過(guò)固相萃取柱，依次用水、40%甲醇、甲醇各5 mL洗脫，收集甲醇洗脫部分，50℃減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0．45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2．3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為OJ－5）樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定6次，將所得色譜圖輸入國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012．130723版，以下簡(jiǎn)稱(chēng)相似度評(píng)價(jià)軟件）進(jìn)行相似度比較，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計(jì)算各色譜圖的相似度。結(jié)果各色譜圖的相似度均大于0．980，且RSD＜0．5%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為OJ－5）樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將所得色譜圖輸入相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行相似度比較，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計(jì)算各色譜圖的相似度。結(jié)果各色譜圖的相似度均大于0．980，且 RSD＜0．5%(n＝6)，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為OJ－5）樣品，按2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，3，6，9，12，24 h時(shí)按2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，將所得色譜圖輸入相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行相似度比較，采用中位數(shù)法生成參照指紋圖譜，以參照指紋圖譜計(jì)算各色譜圖的相似度。結(jié)果各色譜圖的相似度均大于 0．980，且 RSD＜0．5%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2．4 分析與評(píng)價(jià)

2．4．1 川麥冬藥材樣品指紋圖譜的測(cè)定

取10批川麥冬樣品（批號(hào)為OJ－1～OJ－ 10），按 2．2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2．1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得10批川麥冬藥材指紋圖譜(圖1)。

圖1 10批川麥冬藥材的指紋圖譜

圖2 10批川麥冬藥材指紋圖譜的共有模式

圖3 對(duì)照品溶液色譜圖

2．4．2 共有模式指紋圖譜的建立與共有峰指認(rèn)

將所得的10批川麥冬藥材色譜圖導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)軟件，采用中位數(shù)法生成共有模式，得到的共有模式（圖2）包含共有峰40個(gè)。通過(guò)與對(duì)照品溶液色譜圖（圖3）對(duì)照保留時(shí)間，指認(rèn)了其中8個(gè)色譜峰，峰4，13，14， 15，16，18，28和29分別為化合物S－1，S－2，S－3，S－4，S－5，S－6，S－7和S－8。

2．4．3 指紋圖譜的相似度分析

因川麥冬藥材色譜圖中保留時(shí)間8 min之前的色譜峰及38號(hào)峰占總峰面積比例較大，對(duì)整體相似度影響過(guò)大。所有色譜圖剪除8 min之前的色譜峰及38號(hào)峰重新生成共有模式，以該共有模式為參照，計(jì)算各色譜圖的相似度。10批川麥冬藥材的指紋圖譜相似度按批號(hào) OJ－1～OJ－10的順序分別為 0．950，0．971，0．954，0．974，0．981，0．968，0．943，0．946，0．934，0．951。

表1 共有模式各色譜峰的保留時(shí)間、相對(duì)保留時(shí)間及10批藥材各共有峰的相對(duì)峰面積

2．4．4 指紋圖譜相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分析

以28號(hào)峰麥冬皂苷D為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。10批藥材共有峰的相對(duì)保留時(shí)間較固定，與共有模式對(duì)應(yīng)峰的相對(duì)保留時(shí)間非常接近（RSD＜0．5%）。共有模式各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及10批藥材共有峰的相對(duì)峰面積見(jiàn)表1。

3 討論

前期研究結(jié)果顯示，已對(duì)供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行過(guò)大量的調(diào)整優(yōu)化[9]。本研究中在前期研究的基礎(chǔ)上建立了川麥冬藥材指紋圖譜新的分析方法，具有如下特點(diǎn)。

藥材提取溶劑：由甲醇變?yōu)?0%甲醇，使指紋圖譜包含了更多大極性成分的信息（如峰1～12）。對(duì)于部分麥冬相關(guān)的制劑，特別是麥冬相關(guān)的注射劑，這些成分因水溶性較好，往往伴隨工藝過(guò)程轉(zhuǎn)移至最終產(chǎn)品。此外，本研究中對(duì)流動(dòng)相梯度進(jìn)行了調(diào)整，使指紋圖譜同時(shí)包含了更多小極性成分的信息（如峰36～40）。這些成分占總峰面積的比例相對(duì)較大，含量較高，可轉(zhuǎn)移至最終制劑，其物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究明確。對(duì)于保留時(shí)間8 min之前的色譜峰，因極性過(guò)大，保留時(shí)間過(guò)短，建議采取其他技術(shù)和方法建立多張指紋圖譜，以綜合評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量。

檢測(cè)器：由UV－ELSD串聯(lián)變?yōu)閱蜤LSD。UV檢測(cè)器主要針對(duì)川麥冬中的高異黃酮類(lèi)化合物。對(duì)于部分麥冬相關(guān)制劑，特別是麥冬相關(guān)的注射劑，高異黃酮類(lèi)化合物因極性小、水溶性低，轉(zhuǎn)移率往往較低。因此，本研究中采用單ELSD檢測(cè)，降低儀器要求，減少分析測(cè)試成本。此外，本研究中采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方法相對(duì)簡(jiǎn)便，不涉及復(fù)雜的化學(xué)計(jì)量學(xué)算法及特殊的軟件。本研究中建立的分析方法具有較強(qiáng)的實(shí)用性，有利于醫(yī)藥工業(yè)行業(yè)實(shí)際應(yīng)用。

評(píng)價(jià)：本研究中采用相似度分析和相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了評(píng)價(jià)。10批川麥冬藥材的相似度均大于0．900，表明指紋圖譜整體有良好的相似性。川麥冬藥材有悠久的藥用及栽培歷史，良好的相似性顯示藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。相對(duì)峰面積反映了各色譜峰的比例關(guān)系，進(jìn)而更加細(xì)致地反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量。在本研究中，各批次藥材共有峰的相對(duì)峰面積在較寬的范圍內(nèi)波動(dòng)（RSD＝7．1% ～71．9%），客觀反映了不同批次藥材成分比例的差異。因此，建議針對(duì)制劑的具體情況，利用本研究建立的分析方法研究各色譜峰從藥材到制劑的質(zhì)量傳遞規(guī)律，對(duì)主要移行成分和關(guān)鍵色譜峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行規(guī)定，制訂合理的上下限。

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HPLC Fingerprint Analysis of Ophiopogonis Radix Cultivated in Sichuan

Guo Mingli1，Zhang Jiayu2，Wang Bing3，Li Ning1，4，Dong Tingxia1，Zhan Huaqiang1，Tu Pengfei4
（1．HKUST Shenzhen Research Institute，Shenzhen，Guangdong，China 518057； 2．Center of Scientific Experiment，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100029； 3．Experiment Center for Teaching and Learning，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai，China 201203；4．State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University Health Science Center，Beijing，China 100191）

Objective To develop a new HPLC method to generate the fingerprint of OphiopogonisRadix cultivated in Sichuan province．M ethods A total of 10 batches ofOphiopogonis Radix samples were analyzed by HPLC，and 8 reference substances were used forthe identification of the common peaks．The fingerprint was further analyzed by similarityanalysis，relativeretention time analysis and relative peak area analysis．Results The similarities of all the samples tested were higher than 0．900．The relative peak areas of the common peaks varied in a relatively wide range（RSD＝7．1% －71．9%，n＝10）．Conclusion The method is simple，practical，suitable for industrial application，and could be used for the quality evaluation of Ophiopogonis Radix．

Ophiopogonis Radix；HPLC；fingerprint；quality evaluation

R282．71；R284．1

A

1006－4931(2017)04－0001－05

2016－11－09)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．001

國(guó)家自然科學(xué)基金[81303189，81303206]。

郭明里（1991－），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)樗帉W(xué)與藥物分析，（電子信箱）gml53252811473272＠163．com。

李寧（1982－），男，博士研究生，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘钚猿煞峙c質(zhì)量評(píng)價(jià)，（電子信箱）mailtolining＠gmail．com。