液相色譜－高分辨率四級桿飛行時間質譜聯用法測定保健食品中非法添加的N－去甲基他達拉非

舒 展，王 帥

（浙江省金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000）

·檢驗檢測·

液相色譜－高分辨率四級桿飛行時間質譜聯用法測定保健食品中非法添加的N－去甲基他達拉非

舒 展，王 帥

（浙江省金華市食品藥品檢驗檢測研究院，浙江 金華 321000）

目的基于高分辨率四級桿飛行時間質譜（QTOF），建立保健食品中N－去甲基他達拉非的檢測方法。方法色譜柱為 Agilent Poroshell EC－C18柱（100 mm×4．6 mm，2．7 m），流動相為乙腈－0．1%醋酸，梯度洗脫，流速為0．3 mL／min，柱溫為35℃；電噴霧電離（ESI），正離子模式，根據保留時間、精確相對分子質量和二級碎片比對定性。由提取離子流圖峰面積與質量濃度關系定量分析N－去甲基他達拉非 ESI質譜的裂解途徑。結果N－去甲基他達拉非進樣質量濃度在 53～1 060 ng／mL范圍內與峰面積線性關系良好（r＝0．999 6），檢出限為10．6 ng／mL，定量限為35．0 ng／mL，平均回收率大于97．2%。結論該方法準確、可靠，適用于N－去甲基他達拉非的快速鑒別和定量測定。

液相色譜－四級桿飛行時間質譜；非法添加；N－去甲基他達拉非

5磷酸二酯酶(PDE5）抑制劑主要包括西地那非、伐地那非和他達拉非，主要用于治療男性勃起功能障礙，但售價較高。為牟取暴利，一些廠家將其非法添加到保健食品中，消費者不知情使用這些產品，可能會引起嚴重的藥品不良反應[1－3]。為此，國家食品藥品監督管理總局發布了補充檢驗方法和檢驗項目批準件，用于中成藥中PDE5抑制劑的檢測，以加強監管的力度。為規避檢查，一些廠家改為添加新型PDE5衍生物[4－6]，特別是近些年非法添加他達拉非類衍生物[7－12]的情況尤為嚴重，如非法添加N－去甲基他達拉非[13]。由于發現時間不長，目前仍缺少相應的定性定量分析方法。為此，本研究中采用液相色譜－高分辨率四級桿飛行時間質譜聯用法對保健食品中的N－去甲基他達拉非進行了檢測和分析，以期建立快速、準確的檢驗方法。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 6530型 HPLC－QTOF液質聯用儀（美國Agilent公司）；Mettler XS205DU型電子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ－200KDB型超聲儀（昆山市超聲儀有限公司）；Direct－PureUP 20型超純水系統（上海樂楓生物科技有限公司）

1．2 試藥

N－去甲基他達拉非對照品（Toronto Research Chemicals公司，批號 19－MVI－126－1）；西地那非（批號1358－057A1），他達拉非（批號1156－051A1），那紅地那非（批號 1591－080A3），紅地那非（批號1947－006B2），氨基他達拉非（批號 1638－004A2），羥基豪莫西地那非（批號1441－048A6），伐地那非鹽酸鹽（批號 1132－035A1），豪莫西地那非（批號1220－030A3），偽伐地那非（批號 1217－011A2），硫代艾地那非（批號1214－006A3），那莫西地那非（批號1646－055A2），均購于加拿大 TLC Pharma Chem公司。乙腈（色譜純，德國Merck公司，批號JA042430）；冰醋酸（色譜純，阿拉丁試劑有限公司，批號E1519047）；樣品為我研究院日常抽檢品（均為標注有增強免疫等功能的保健品）。

2 方法與結果

2．1 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為 Agilent Poroshell EC－C18柱（100 mm×4．6 mm，2．7 μm）；流動相A為0．1%的乙酸溶液，B為乙腈，梯度洗脫（0～15 min，25%～40%B；15～20 min，40%～80%B；20～30 min，80%B）；流速為0．3 mL／min；柱溫為40℃。

質譜條件：采集模式，正離子模式；掃描范圍，m／z 50～1 000；離子源為電噴霧電離（ESI）源；霧化氣（N2），35 psi（1 psi＝6．895 kPa）；干燥氣（N2），流速12 L／min；溫度350℃；毛細管電壓3．5 kV；碎裂電壓180 V；二級質譜碰撞池能量25 eV。

2．2 溶液制備

標準品貯備液：稱取N－去甲基他達拉非對照品10．60 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加乙腈使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準品貯備液。

混合對照品溶液：取12種PDE5型抑制劑各10 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈使溶解并稀釋至刻度，搖勻，50%乙腈稀釋至500 ng／mL，即得。

供試品溶液：取樣品1．0 g置50 mL容量瓶中，加入乙腈約15 mL，超聲溶解，乙腈稀釋至刻度，過濾，取1 mL置100 mL容量瓶中，用50%乙腈稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2．3 質譜行為分析

取N－去甲基他達拉非標準品貯備液，用50%乙腈稀釋成質量濃度為530 ng／mL的對照品溶液，按擬訂條件測定。其一級、二級質譜圖見圖1和圖2。由于結構中的氮原子，N－去甲基他達拉非易與H＋結合形成準分子離子[M＋H]＋。定性篩查時應注意，除[M＋H]＋外，N－去甲基他達拉非還能與Na形成[M＋Na]＋離子。

2．4 定量分析

圖1 N－去甲基他達拉非一級質譜圖

圖2 N－去甲基他達拉非二級質譜圖

采用B04．00版Mass Hunter軟件，按精確相對分子量376．129 2提取色譜圖進行定量，提取質量窗口為5×10－6。

2．5 色譜質譜條件優化

2．5．1 流動相選擇

參考國家食品藥品監督管理總局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（編號為2009030）中檢測方法，考察了水－乙腈、10 mmol／L乙酸銨溶液－乙腈、0．1%乙酸溶液－乙腈流動相體系對分離效果及質譜靈敏度的影響。結果，采用0．1%乙酸溶液－乙腈流動相體系不僅具有較好的峰形及質譜響應，同時能與批準件規定的11種PDE5型抑制劑分離見圖3，從而提高工作效率。

2．5．2 毛細管出口電壓優化

隨著毛細管出口電壓（Fragmentor）的增加，N－去甲基他達拉非的[M＋H]＋離子響應也逐漸增加，但隨后發生源內裂解，離子響應逐漸減小。采用100～200 V的毛細管出口電壓測定（每隔10 V增加），將毛細管出口電壓設定為150 V時，[M＋H]＋離子具有最高的響應值。

2．5．3 碰撞裂解能優化

他達拉非類物質較易裂解。采用10，15，20，25，30 eV的碰撞裂解能進行測定，結果碰撞裂解能為25 eV時，裂解碎片細節最豐富，有利于對N－去甲基他達拉非進行裂解途徑的歸納和鑒別測定，故將碰撞裂解能量設定為25 eV。

2．6 裂解規律推測

圖3 12種對照品提取離子色譜圖

圖4 N－去甲基他達拉非的裂解途徑及主要碎片離子

基于精確相對分子量的二級質譜圖（圖2），推測N－去甲基他達拉非可能的裂解途徑（圖4）：先脫去胡椒環形成 m／z為254．092 4的碎片，然后失去羰基，形成 m／z為226．097 5的碎片。這一碎片離子在開環后極不穩定，隨后脫去HCN和另一個羰基，形成穩定的m／z為169．076 0的碎片[8]。N－去甲基他達拉非的另一裂解途徑為通過反Diels－Alder反應得到的 m／z為262．086 3碎片離子。

2．7 方法學考察

線性關系考察：將標準品貯備液用50%乙腈稀釋成質量濃度分別為53，106，212，530，1 060 ng／mL的對照品溶液，按擬訂條件測定，以母離子的峰面積（Y）對相應的質量濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程 Y＝1 719．9X＋29 949，r＝0．999 8（n＝5）。結果表明，N－去甲基他達拉非質量濃度在53～1 060 ng／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取N－去甲基他達拉非對照品溶液（212 ng／mL），按擬訂條件連續測定5次，以母離子峰面積計算精密度。結果的 RSD為2．73%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取N－去甲基他達拉非對照品溶液（212 ng／mL），按擬訂條件分別于0，2，4，8，12 h時測定母離子峰面積。結果的 RSD為2．88%（n＝5），表明溶液在12 h內穩定。

重復性試驗：取能檢測出N－去甲基他達拉非的樣品，依法平行制備供試品溶液6份，按擬訂條件進樣測定。結果N－去甲基他達拉非母離子峰面積的 RSD為2．30%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密稱取未檢測出N－去甲基他達拉非的樣品1 g，置50 mL容量瓶，分別精密加入N－去甲基他達拉非對照品貯備溶液2，5，8 mL，加乙腈稀釋至刻度，50%乙腈稀釋400倍，每個質量濃度平行制備3份，按上述條件測定，計算回收率。結果見表1。

檢出限與定量限確定：取標準貯備液，稀釋后測定，結果檢出限為 10．60 ng／mL（S／N＝3），定量限為35．00 ng／mL（S／N＝10）。

表1 N－去甲基他達拉非在不同質量濃度下的回收率

圖5 陽性樣品提取離子色譜圖

圖6 陽性樣品二級質譜圖

2．8 樣品測定

按擬訂條件進樣測定，測定樣品5批，其中一批樣品中提取出與對照品保留時間相同的提取離子流色譜峰（圖5），其準分子離子峰[M＋H]＋m／z值為376．128 4（理論 m／z 376．129 2，Δm＝－2．1×10－6），二級質譜圖一致（圖6）。測定含量為5．26 mg／g。

3 討論

高分辨質譜檢測器具有高分辨率和高選擇性，在缺少對照品的情況下根據精確分子質量及裂解規律也能進行化合物的快速篩查。由于他達拉非類物質的結構修飾主要集中在哌嗪二酮的N原子上，根據N－去甲基他達拉非的裂解規律可推測在裂解過程中均能產生 m／z分別為169．076 0（C11H9N2）、262．086 3（C17H12NO2）這2個特征碎片離子[14－15]。實際工作中可根據特征離子快速篩查他達拉非類物質，再結合裂解規律推測化合物的最終結構，從而實現對非目標物質的篩查。

非法添加樣品的添加劑量具有不確定性，有時有必要對樣品進行再稀釋。當對照品與供試品的質量濃度較高時會產生較強的殘留，需對質譜系統進行較長時間沖洗，以免出現不必要的假陽性。

N－去甲基他達拉非作為一種新型的 PDE5抑制劑，目前仍缺少成熟的檢驗方法，監管上存在漏洞，讓不法商家有機可乘。本研究中采用液相色譜－高分辨率四級桿飛行時間質譜聯用法對N－去甲基他達拉非進行了定性定量測定，并對裂解途徑進行了推斷。在沒有對照品的情況下也可對其進行快速鑒定篩查，也能用于推斷同類新型衍生物的結構推斷，為打擊非法添加提供了有力的技術支持。

[1]張魯南，張夢琪，陳 莉，等．性保健品中可能違禁添加7種藥物的 LCMS／MS法測定[J]．中國醫藥工業雜志，2010，41（10）：755－758．

[2]Kloner RA．Cardiovascular effects of the 3 phosphodiesterase－5 inhibitors approved for the treatment of erectile dysfunction[J]．Circulation，2004，110（19）：3149－3155．

[3]Laties AM．Vision disorders and phosphodiesterase type 5 inhibitors：a review of the evidence to date[J]．Drug Saf，2009，32（1）：1－18．

[4]Patel DN，Li L，Kee CL，et al．Screening of synthetic PDE－5 inhibitors and their analogues as adulterants：analytical techniques and challenges[J]．Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2014，87（1434）：176－190．

[5]Lee HM，Lee BJ．A novel approach to simultaneous screening and confirmation of regulated pharmaceutical compounds in dietary supplements by LC／MS／MS with an information－dependent acquisition method[J]．Food Additives＆ Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure＆Risk Assessment，2011，28（4）：396－407．

[6]Venhuis BJ，Kaste DD．Towards a decade of detecting new analogues of sildenafil，tadalafil and vardenafil in food supplements：A history，analytical aspects and health risks[J]．Journal of Pharmaceutical＆Biomedical Analysis，2012，69（8）：196－208．

[7]Toomey VM，Litzau JJ，Flurer CL．Isolation and structural characterization of two tadalafil analogs found in dietary supplements[J]．Journal of Pharmaceutical＆Biomedical Analysis，2011，59（1）：50－57．

[8]Lee ES，Kim JW，Lee JH，et al．Identification of a new tadalafil analogue found in a dietary supplement[J]．Food Additives＆Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure＆Risk Assessment，2013，30（4）：621－626．

[9]Kern SE，Nickum EA，Flurer RA，et al．Isolation and structural characterization of a new tadalafil analog（2－hydroxyethylnortadalafil）found in a dietary supplement[J]．Journal of Pharmaceutical＆Biomedical Analysis，2014，103：99－103．

[10]Huang YC，Lee HC，Lin YL，et al．Separation and identification of a novel tadalafil analogue adulterant in a dietary supplement[J]．Food Additives＆Contaminants Part A Chemistry Analysis Control Exposure＆Risk Assessment，2016，33（2）：179－185．

[11]Xu Y，Kee CL，Ge X，et al．Isolation and characterization of a tadalafil analogue，N－cyclopentyl nortadalafil in health supplement[J]．Journal of Pharmaceutical＆ Biomedical Analysis，2015，118（8）：235－241．

[12]Kern SE，Lorenz LM，Lanzarotta A，et al．Isolation and structural characterization of a new tadalafil analog（chloropropanoylpreta dalafil）found in a dietary supplement[J]．Journal of Pharmaceutical＆Biomedical Analysis，2016，128：360－366．

[13]黃朝輝，蔡丹丹，陳仲益，等．保健食品中他達拉非類似物去甲他達拉非的檢測研究[J]．中國藥學雜志，2015，50（4）：371－374．

[14]Zou P，Hou P，Oh SS，et al．Electrospray tandem mass spectrometric investigations of tadalafil and its analogue[J]．Rapid Communications in Mass Spectrometry，2006，20（22）：3488－3490．

[15]Singh S，Prasad B，Savaliya AA，et al．Strategies for characterizing sildenafil，vardenafil，tadalafil and their analogues in herbal dietary supplements，and detecting counterfeit products containing these drugs[J]．Trac Trends in Analytical Chemistry，2009，28（1）：13－28．

Determination of N－Desmethyltadalafil Illegally Added in Dietary Supplements by HPLC－QTOF

Shu Zhan，Wang Chengshuai
（Jinhua Institute for Drug and Food Control，Jinhua，Zhejiang，China 321000）

Objective To establish the high－resolution quadrupole－time－of－flight mass spectrometry（QTOF）method for determining the N－Desmethyltadalfi illegally added in dietary supplements．M ethods The analysis was performed on an Agilent Poroshell EC－C18column（100 mm×4．6 mm，2．7 m）with 0．1% acetic acid－acetonitrile as mobile phase，and the flow rate was 0．3 mL／min，gradient elution，with the column temperature 35 ℃．QTOF MS equipped with ESI ion source was performed in positive ionization mode．Qualitative analysis was based on the retention time，accurate mass，and the product ions．Quantitative analysis was performed by using the peak area and concentration．Results The ESI－MS fragmentation behavior was characterized．Good linearity was obtained in the range of 53－1 060 ng／mL(r＝0．999 6)．The LOD was 10．6 ng／mL and LOQ was 35．0 ng／mL，the recoveries were more than 97．2%．Conclusion The method is sensitive，accurate，and can be used in the qualitative and quantitative analysis of N－Desmethyltadalafil illegally added in dietary supplements．

HPLC－QTOF；illegal additives；N－desmethyltadalafil

R927．1

A

1006－4931(2017)04－0022－05

2016－10－13；

2016－11－17)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．006

舒展（1984－），男，浙江金華人，碩士研究生，主管藥師，主要從事藥物分析工作，（電話）0579－82301374（電子信箱）185161587＠163．com。