DNA甲基化在中醫藥研究中的應用＊

陳光，王階

DNA甲基化在中醫藥研究中的應用＊

陳光1,2，王階1＊＊

（1.中國中醫科學院廣安門醫院北京100053；2.北京中醫藥大學研究生院北京100029）

DNA甲基化是表觀遺傳學的經典調控機制，可調控轉錄水平。目前其在中醫領域的研究主要包括證候相關生物標志物的初步研究，即探討特定疾病的證候與特定基因甲基化的相關性，以及藥物分子作用機制研究，即探討中醫藥干預對特定基因甲基化程度變化及甲基化相關酶的影響。目前認為，甲基化調控具有遺傳性、可塑性，并在整個基因組均有分布，可以適應中醫證候動態演變與中醫整體干預的研究特點。但目前的研究在證候相關生物標志物的方法學方面有待完善，在甲基化機制方面有待功能學驗證的深入研究。甲基化在詮釋中醫先天遺傳因素與后天環境影響對疾病與證候發生發展方面，甲基化與RNA層面的相互作用在探索中藥干預機制方面，以及甲基化證候生物標志物在人群的證候篩查、疾病證候分型、藥物敏感性的預測方面，均有廣闊前景。

DNA甲基化中醫藥證候機制

表觀遺傳學是研究基因的核苷酸序列不發生改變的情況下，基因表達的可遺傳的變化的一門遺傳學分支學科。從分子角度，表觀遺傳學是在同一基因組上建立并將不同基因表達（轉錄）模式和基因沉默傳遞下去的染色質模板變化的總和[1]。表觀遺傳學建立于對意外發現現象的理解，其機制具有遺傳性和可塑性。DNA甲基化就是表觀遺傳中的典型現象之一。本文就DNA甲基化的基本研究方法及在中醫藥領域研究中的應用進行綜述。

1 DNA甲基化基礎

1.1 DNA甲基化基本概念

在哺乳動物中，DNA甲基化是由甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）所催化，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylMethionine，SAM）作為甲基供體，將甲基主要轉移到CpG雙核苷酸序列的胞嘧啶第五號碳原子上，也有少量轉移到如CHG、CHH等非CpG的胞嘧啶上。

甲基化DNA在復制過程中，DNA會出現半甲基化狀態，而DNMT1負責DNA復制中的甲基化維持，UHRF1負責識別半甲基化的DNA，并招募DNMT1。因為復制過程中DNMT1功能的缺失，則出現DNA被動的去甲基化現象。而主動的去甲基化過程可能的方式主要包括：糖苷酶特異識別5 mC，切除后進一步被BER通路修復為C；存在脫氨酶特異識別5 mC，C變成T后形成GT錯配；NER通路直接切掉5 mC；5 mC通過氧化作用將甲基氧化成羧基，再通過脫羧酶的脫羧作用達到去甲基；水解作用直接去掉甲基基團[2]。其中，氧化方式中TET蛋白發揮著重要作用，而TET1則富集在TSS附近和CGI上，是該區域維持低甲基化的機制之一。因此，可見DNA甲基化處于甲基化和去甲基化的動態過程中，在復制過程中存在遺傳性，但在動態變化中又具有可塑性。

1.2 DNA甲基化調控功能

DNA的甲基化修飾使DNA結合蛋白的部位——DNA雙螺旋凹槽的外形發生改變，從而導致其與DNA結合蛋白的結合能力降低，影響識別轉錄因子，從而調節轉錄[3]。另外，DNA甲基化也可結合蛋白，通過影響結合的蛋白，從而對轉錄進行調控。

不同區域的DNA甲基化的功能不盡相同，TSS和啟動子區甲基化與基因的轉錄抑制相關；在gene body上的甲基化則與轉錄剪接有關；重復序列、異染色質區域和轉座子的轉錄抑制、基因組的穩定性有關；涉及基因印記則與X染色體失活有關。

在人的生命中存在兩次重大的去甲基化過程，一次發生在形成成熟配子的過程中，一次發生在胚胎發育受精卵分化為干細胞的過程中，前者為了重新建立印記，而后者為了減弱印記，建立新的印記。

一些疾病與DNA甲基化密切相關，如X連鎖的MeCP2突變導致Rett綜合征，X連鎖的紅綠色盲以及癌癥。異常的低甲基化導致原癌基因的過度表達與異常的高甲基化導致抑癌基因被沉默都可能是癌癥發生的機制之一。

可見，DNA甲基化的調控方式在基因組中分布廣泛，發揮的功能多樣，又在胚胎發育過程中帶有先天的印記。

1.3 DNA甲基化研究方法

在DNA甲基化的現代研究方法中，基于LC-MS/ MS液相色譜串聯質譜分析5 mC/5 hmC的含量，可以確定總甲基化相對比例，但無法定位；針對特定位點的經典亞硫酸鹽測序方法是金標準。對于芯片檢測或測序方法而言，分為基于抗體、標記等親和富集的方法（如MeDIP-seq）和BS處理單堿基分辨率的方法，前者對通量要求不很高，適合全基因組范圍篩查，同時分辨率也受到限制，而后者又分為全基因組測序和RRBS，全基因組BS測序對測序深度要求較高，而RRBS則集中在富含CpG的區域，降低了測序成本。

另外，Hairpin BS-seq可以同時測兩條鏈的甲基化，從而計算甲基化在復制過程中保留有效率。而TAB-Seq的特點則在于可以區分hmC，亞硫酸鹽處理原理的檢測則不能區分5mC和5-hmC。在研究過程中，可以根據實驗設計的目標不同，選擇不同的方法或方法組合。

2 中醫藥領域DNA甲基化研究現狀

2.1 中醫藥相關組學研究背景

目前中醫藥在基因組學和后基因組學領域的研究主要涉及早期大量的SNP的GWAS研究、轉錄組學研究（早期以mRNA差異表達譜為主，最近以研究miRNA、lncRNA、circRNA為熱點）、表觀遺傳學（以DNA甲基化為主）以及最新個別的研究腸道微生物相關的宏基因組學。

因為中醫學認為“證候”是疾病某一階段本質變化的體現，并據此進行治療。所以，中醫很大程度的研究是圍繞證候進行的。研究方法基本為根據疾病和證候的不同組合進行分組，通過小樣本量組間比較尋找某一組學的差異，對差異再進行大樣本量的RT-PCR驗證，如果涉及多個組學層面，則進行共表達分析，通過生物信息學推測與疾病和證候聯系相對密切的差異，以及不同層面的上下游關系和網絡調控關系，并通過動物和細胞實驗進行功能學驗證。這類研究往往同時再進行藥物干預，觀察藥物對差異基因的影響，以及與患者癥狀、體征以及其他常規指標的相關性。

前一部分差異的篩選主要目的是尋找證候相關的生物標志物，中醫的診療本就具有個體性，而生物標志物的研究為中醫藥實現現代的精準醫療奠定基礎；后一部分聚類差異深入研究主要是為尋找關鍵調控節點及藥物分子靶標，為闡明藥物作用機制及研發中藥新藥提供思路。其過程中，利用的高通量技術基本以組合應用形式，先用芯片或二代測序小樣本大范圍篩選，再PCR驗證，當然隨著單細胞測序和三代測序的發展，其在中醫藥研究中的作用也將逐漸發揮優勢。

2.2 中醫證候相關研究

大部分中醫藥甲基化研究集中在對于某種特定疾病的證候與甲基化的相關性進行探討。研究可以針對某特定基因甲基化進行研究。如一項急性髓系白血病中醫證型與ID4基因啟動子區甲基化相關性研究[4]發現，各證型患者ID4基因啟動子區甲基化陽性率由低到高依次為氣陰兩虛證＜瘀血痰結證＜毒熱熾盛證，差異均有統計學意義（P＜0.05）。對于中晚期非小細胞肺癌MGMT基因甲基化表達與中醫證型的相關性研究發現，肺脾氣虛證、肺陰虛證、氣滯血瘀證、氣陰兩虛證、痰熱阻肺證5種中醫證型的MGMT啟動子甲基化陽性率分別為85.00%、90.00%、15.00%、75.00%、20.00%，經樣本間兩兩比較秩和檢驗，氣滯血瘀證、痰熱阻肺證兩組與其他各組間均有顯著差異（P＜0.01或P＜0.05）[5]。一項慢性萎縮性胃炎中醫證型與胃粘膜cmycDNA甲基化水平研究發現，c-myc基因甲基化率在慢性萎縮性胃炎中醫各證型間有顯著性差異（P＜0.01），且各證型中c-myc基因甲基化率由高到低依次是胃熱傷陰＞瘀毒內阻＞痰濕凝結＞脾胃虛寒＞氣血雙虧＞肝胃不和[6]。其他一些研究[7-12]的方法則類似。

同時，也可以對全基因組進行甲基化研究。一項基于全基因組甲基化的乙肝后肝硬化證候研究發現，HLA-DRB1和ADAMTS9，NUDT1和YES 1，APOA5和PRKCZ等基因的差異甲基化可能分別與濕熱內蘊證、脾虛濕盛證和肝腎陰虛證的證候有關[13]。而且，在方法學上也有基于雙生子進行研究[14]。另外，也有一些陰性結果的研究，如一項研究不同中醫證型骨髓增生異常綜合征RIZ1、ID4基因甲基化的結果[15]發現，RIZ1基因甲基化表達在不同中醫證型患者中無明顯差異。

2.3 中醫干預機制相關研究

在分析證候甲基化差異的基礎上，也有對甲基化相關酶以及中醫藥干預對甲基化影響的研究。一項中醫抗衰老機理研究[16]發現，腎健脾方劑能明顯提高生理性腎虛小鼠肝細胞DNA甲基化酶的活力，具有延緩衰老的作用。一項組蛋白去甲基化酶與腎虛型絕經后骨質疏松癥的研究[17]發現，組蛋白去甲基化酶JMJD2A、JMJD2B表達程度，骨質疏松癥患者組明顯低于非骨質疏松癥組。

另外一些中藥干預研究發現，甲基化可能是一些中藥干預的作用機制之一，如穩斑湯干預急性冠脈綜合征痰瘀互結證血漿血栓調節蛋白基因啟動子甲基化，治療后較治療前甲基化程度顯著降低；對于乳腺癌高危人群根據中醫辨證給予不同中藥干預，結果發現血清TRβ1基因甲基化程度治療后較治療前明顯降低；針對骨髓間充質干細胞給予補腎中藥提取成分含藥血清干預，結果發現含藥血清組β-catenin基因甲基化狀態較其他組有明顯的降低，且組間差異有統計學意義（P＜0.05）[18-20]。

3 中醫藥領域DNA甲基化研究思路與優勢

根據DNA甲基化調控機制的特點，結合中醫學有待研究的科學問題，其相關的研究思路可從以下幾點進行思考。其一，DNA甲基化調控是動態的，具有遺傳性與可塑性；而中醫的證候是動態演變的，而且受體質遺傳因素的影響，又在與環境的相互作用下變化。試想，證候實質的生物學基礎是否一定程度上反映在DNA甲基化這一層面？其二，DNA甲基化的調控方式在基因組中分布廣泛，而中藥的作用特點是針對關鍵調控節點發揮整體調節作用，其作用機制是否與DNA甲基化密切相關？其三，DNA甲基化作為經典的表觀遺傳學調控機制，其能否為中醫證候的客觀診斷與中藥作用機制提供新的思路？具體可體現在從分子層面界定證候范圍的生物標志物研究，以及從表觀遺傳學層面闡述中藥作用機制、探討方劑組分配伍原理的分子機制研究。

DNA甲基化的特點與中醫學問題的相關性，決定了目前相關研究存在以下特色及優勢：①中醫證候處于動態變化過程中，受遺傳與環境雙重作用影響，而DNA甲基化既具有印記的遺傳性，又受環境因素改變的可塑性，這就使得其在研究證候的時間特異性領域中占有了一定的地位，并為治療提供了樂觀的前景；②中醫的主要思想就是整體觀，而在脊椎動物中甲基化CpG在整個基因組中均有分布，這為研究中醫藥干預證候機制的整體性提供了依據；③中醫利用中藥干預人體的過程是復雜的，也不僅是多通路、多靶點的簡單羅列，也許是復雜系統，而DNA甲基化調控基因表達存在影響轉錄因子的結合活性與甲基化結合蛋白抑制轉錄這直接和間接兩種機制，為研究中醫藥針對不同環節治療打開了思路[21-23]。

4 問題與展望

研發真正的分子靶向治療藥物的重要途徑就是發現生物標志物，其中也包括中藥單體藥物的研發。而生物標志物需具備特異性強、靈敏度高、重復性好、穩定性高、取樣無損害等特點，并對評估危險程度以及預測治療效果有一定程度的臨床指導價值。但目前只有很少一部分生物標志物真正用于臨床，中醫證候的生物標志物研究尚處于初級階段，存在很多方法學的問題，也頗受爭議。

用于中醫證候診斷的生物標志物探索的難點在于：時間特異性、組織特異性以及正常參考值的確定。目前國際上較為成熟的生物標志物研究方法是利用Cox回歸分析或隨機森林分析方法，探索血瘀證高風險與低風險相關甲基化DNA/mRNA/microRNA/circRNA，訓練組用于構建風險預測模型，測試組用于驗證信度，并擴大樣本量對模型進行驗證和校正，以進一步提高模型的效能。但這種方法還不能完全滿足中醫學的研究，隨著統計學家在動態模型構建方法上的突破，大數據時代思想與技術的逐步成熟，中醫生物標志物模型的時空觀特點也將逐步得以實現。

對于探索機制的調控網絡研究，通過生物信息學分析構建網絡僅僅是預測的結果，通過細胞和動物實驗對生物標志物及上下游關系進行功能學驗證則至關重要，比如運用5-Azacytidine（5-Aza）這種甲基化抑制劑培養細胞造成一系列梯度甲基化程度，同時檢測目的基因轉錄水平，從而驗證甲基化對該基因轉錄的調控作用[24]。但是值得注意的是，成熟的生物標志物也未必就是調控網絡中的關鍵節點，而如果希望根據調控關鍵節點篩選中藥有效成分或單體作為生物靶向藥物，仍需以確定關鍵節點為前提。

綜上所述，DNA甲基化本身的特點與中醫的特色有著一種天然而隱約的聯系，其研究思路也較為廣泛且具有特色，但仍存在諸多問題。以下僅談三點展望：

第一，現有研究表明，DNA甲基化的最終結果遠遠不止于控制基因表達，它擴展到基因組印記、X染色體失活，以及染色質結構修飾[25]。而基因印跡是一種基因是否表達由其來自父方或母方決定的現象，通過卵子和精子的形成過程中DNA甲基化精細微妙的變化而實現。實際上，基因印跡是對來自父方和母方遺傳物質的一種選擇，是在先天之精形成過程中適應性選擇的機制之一，為先天之精作用后天的研究提供了思路，從而為詮釋中醫體質對疾病發生發展及證候演變的影響提供了研究基礎[26]。

第二，DNA的甲基化不僅調控編碼的mRNA的轉錄，同時也作為非編碼RNA的調控機制之一。然而有趣的是，非編碼RNA可以通過調節DNMT的表達而調節DNA的甲基化，所以非編碼RNA——DNA甲基化兩個層次的相互作用調節網絡，可能是中醫藥干預作用的連鎖放大效應以及反饋平衡機制之一，可能是中藥作用的關鍵環節之一。

第三，利用高通量測序或芯片技術篩選差異甲基化位點及RNA水平差異（mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）后，對甲基化與RNA兩個層面進行生物信息學分析，構建調控網絡。其后，一方面根據差異倍數、統計學意義、基因功能注釋結果，選擇差異基因擴大樣本量進行驗證，構造生物標志物的證候診斷模型，可應用于人群的證候篩查、疾病證候分型、藥物敏感性的預測；另一方面，對構建的調控網絡進行藥物干預相關網絡的臨床試驗，以及動物和細胞的功能學驗證，以進一步確立調控網絡中的關鍵節點，從而從分子層面闡明中藥作用機制，進而可應用于篩選中藥有效成分、遴選中藥單體等新藥創制。

1Allis C D,JenuweinT,TrinbergD,et al.表觀遺傳學.北京:科學出版社,2009:36.

2Zhu J K.Active DNA Demethylation Mediated by DNA Glycosylases. Annu Rev Genet,2009,43(1):143-166.

3Bird A.The essentials of DNA methylation.Cell,1992,70(1):5-8.

4劉菲,徐瑞榮.急性髓系白血病中醫證型與ID4基因啟動子區甲基化相關性研究.中國中西醫結合雜志,2012,32(4):471-473.

5李雪梅,許玥,林華勝,等.中晚期非小細胞肺癌MGMT基因甲基化表達與中醫證型的相關性研究.四川中醫,2012,30(5):36-38.

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8靖景艷.人急性髓系白血病中醫辨證分型與RASSF1A、ZO-1基因甲基化的相關性研究.山東:山東中醫藥大學碩士學位論文,2013.

9黃定鵬.Runx3、Gst-π基因啟動子甲基化與胃癌及中醫辨證分型的相關性研究.廣州:廣州中醫藥大學碩士學位論文,2012.

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11唐梅森.基于DNA單核苷酸多態性和甲基化修飾探討早發冠心病血瘀證的相關易感基因的研究.湖南:湖南中醫藥大學博士學位論文,2015.

12吳文婷.IL-17RC低甲基化影響葡萄膜炎的機制研究及中藥治療葡萄膜炎的臨床體會.北京:北京中醫藥大學博士學位論文,2014.

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14文欽.基于雙生子研究證候差異的甲基化調控.成都:成都中醫藥大學碩士學位論文,2011.

15玄麗娜.不同中醫證型骨髓增生異常綜合征RIZ1、ID4基因甲基化異常表達及臨床意義.山東:山東中醫藥大學碩士學位論文,2012.

16林一萍,陳比特,陳玉春.DNA甲基化酶與中醫抗衰老機理的關系.中國中醫藥信息雜志,1999,6(6):18-19.

17唐宏宇.組蛋白去甲基化酶在腎虛型絕經后骨質疏松癥的表達分析.廣州:廣州中醫藥大學碩士學位論文,2015.

18程修平,宮麗鴻,李楠,等.穩斑湯輔助治療對急性冠狀動脈綜合征痰濁血瘀證患者血漿血栓調節蛋白基因啟動子甲基化的影響.中醫雜志,2016,57(2)：140-144.

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21米歇爾·沃爾德羅普.陳玲譯.復雜.北京:生活·讀書·新知三聯書店,1998:147,162,320.

22錢學森,于景元,戴汝為.一個科學新領域——開放的復雜巨系統及其方法論.自然雜志,1991,13(1):3.

23戴汝為.復雜巨系統科學——一門21世紀的科學.自然雜志,1997, 19(4):190.

24 Lu X L,Wang L,Chang S Y,et al.Sonic Hedgehog Signaling Affected by Promoter Hypermethylation Induces Aberrant Gli2 Expression in Spina Bifida.Mol Neurobiol,201553(8):5413-24.

25[美]TollefsbolTO.表觀遺傳學實驗手冊.上海：上海科學技術出版社,2007:4.

26沈珝琲.染色質與表觀遺傳調控.北京:高等教育出版社,2006:135-136.

Application of DNAMethylation in Traditional Chinese Medicine

Chen Guang1,2,Wang Jie1
(1.Guang'anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100053,China;2.Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

As a classic regulation method in epigenetics,DNA methylation regulates the process of transcription. Currently,it can be utilized in the field of biomarker discovery for traditional Chinese medicine(TCM)syndromes and the study of finding molecular targets of herbal medicine.The former is mainly about exploring the relationship between specific disease syndrome and specific DNA methylation,while the latter is related to evaluating the influence of TCM methods on the change of DNA methylation and relevant methylation enzyme.It is reported that the information of DNA methylation is inheritable and plastic and covers the whole genome,which makes it possible to study the spatio-temporal changes of TCM syndrome and holistic effects of TCM.However,the methodology of syndrome related biomarker discovery deserves improvement and the functional validation of the mechanism still needs further research.It is promising that DNA methylation may elucidate the influence of both inheritance and environment on the advance of diseases and syndromes,and that the interaction of DNA methylation and RNAs might lighten the mechanism of TCM and DNA methylation biomarkers would be employed for the syndrome screening in the population,differentiation of syndromes and prediction of effectiveness of particular medicine.

DNA methylation,traditional Chinese medicine,syndrome,mechanism

10.11842/wst.2017.06.011

R2-03

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：王晶）

2017-02-27

修回日期：2017-05-20

＊國家自然科學基金委面上項目（81473561）：冠心病血瘀證相關miRNA表達的甲基化調控機制研究，負責人：王階；國家自然科學基金委面上項目（81673847）：冠心病血瘀證相關lncRNA-miRNA調控網絡研究，負責人：王階；科學技術部國家“重大新藥創制”重大科技專項（2013ZX09301307）：宣痹安痛方藥物研發，負責人：王階。

＊＊通訊作者：王階，本刊副主編，研究員，博士生導師，主要研究方向：中醫藥防治心血管病、血瘀證與活血化瘀研究、中醫證候的規范化研究、中醫藥防治艾滋病。