重組人腦鈉尿肽對心力衰竭大鼠心肌重構及縫隙鏈接蛋白43 表達的影響

譚文婷，彭葳銳，唐芬，劉盛權，龍俊蓉，褚春

(1南華大學附屬第一醫院，湖南衡陽 421001；2南華大學附屬第二醫院)

重組人腦鈉尿肽對心力衰竭大鼠心肌重構及縫隙鏈接蛋白43 表達的影響

譚文婷1，彭葳銳1，唐芬1，劉盛權1，龍俊蓉1，褚春2

(1南華大學附屬第一醫院，湖南衡陽 421001；2南華大學附屬第二醫院)

目的探討重組人腦鈉尿肽(rhBNP)對壓力超負荷所致心力衰竭大鼠心肌重構及縫隙鏈接蛋白43(Cx43)表達的影響。方法將45只雄性SD大鼠隨機分為心力衰竭(F)組、心力衰竭+ rhBNP(B)組、假手術(SO)組各15只，F組、B組經腹主動脈縮窄法建立壓力超負荷心力衰竭大鼠模型，SO組大鼠不縮窄腹主動脈。B組經腹腔皮下注射用生理鹽水配制的rhBNP 25 μg/(kg·d)，SO組和F組僅用生理鹽水腹腔皮下注射，均給藥8周。檢測各組左心功能、血流動力學、QT離散度、左室心肌組織病理形態、心肌纖維化沉積和心肌Cx43的表達。結果與SO組比較，F組左心功能、血流動力學、QT離散度、左室心肌組織病理形態、心肌纖維化沉積和心肌Cx43表達均有統計學差異(P均<0.05)，顯示心力衰竭模型制作成功。與F組比較，B組大鼠平均動脈壓下降、QT離散度減小、心肌細胞排列紊亂程度減輕、心肌細胞間膠原纖維沉積減少、Cx43表達增加(P均<0.05)。結論rhBNP可改善壓力超負荷下心力衰竭大鼠的血流動力學指標，上調心肌組織Cx43表達并抑制心肌重構。

心力衰竭；重組人腦利鈉肽；縫隙連接；鏈接蛋白43；心肌重構

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of recombinant human brain natriuretic peptide (rhBNP) on the myocardial remodeling and connexin 43 (Cx43) expression of rats with cardiac failure caused by pressure overload.MethodsForty-five male SD rats were randomly divided into the heart failure group (group F), heart failure+rhBNP group (group B), and sham operation group (group SO) with 15 rats in each group. In the group F and group B, we established the rat models of pressure overload-induced heart failure by abdominal aortic constriction, while in the SO group, rats did not receive coarctation of the abdominal aorta. Rats in the group B were subcutaneously injected with rhBNP (25 ug/kg/d), while rats in the group SO and group F were injected intraperitoneally with normal saline for 8 weeks. The left ventricular function, hemodynamics, QT dispersion, left ventricular myocardial pathology, myocardial fibrosis and collagen deposition, and myocardial Cx43 protein expression were detected in each group.ResultsCompared with the SO group, the left ventricular function, hemodynamics, QT dispersion, left ventricular myocardial histopathology, myocardial fibrosis deposition, myocardial Cx43 protein expression were statistically significant in the group F (allP<0.05), which showed that heart failure model was established successfully. Compared with group F, the heart function of rats increased, the mean arterial pressure and QT dispersion decreased, the disordered arrangement of myocardial cells reduced, collagen deposition decreased between cardiac myocytes, and the expression of Cx43 increased in the group B (allP<0.05).ConclusionrhBNP can improve the cardiac function and hemodynamic indexes in rats with heart failure under pressure overload, up-regulate the myocardial expression of Cx43 protein, and inhibit myocardial remodeling.

Keywords: heart failure; recombinant human brain natriuretic peptide; gap junction; connexin 43; myocardial remodeling

腦利鈉肽是心力衰竭診斷、療效評估及預后判斷的一項有效指標。但是，關于腦利鈉肽對心力衰竭時的縫隙連接以及心肌重構的作用及其機制尚不明確。縫隙連接是心肌細胞之間一種電化學偶聯的通道，其與心室重構有著密切的關系，其基本構成單位是縫隙連接蛋白(Cx)，而Cx43則是心肌工作細胞中最主要的連接蛋白。心肌重構是心力衰竭發生和發展的重要環節[1]，心力衰竭時所出現的電生理紊亂可產生心律失常，從而導致離子通道重構和縫隙連接重構。近期有研究發現在出現心力衰竭的情況下，心肌會出現縫隙連接重構，Cx43于心力衰竭早期可增加，而晚期則明顯減少并伴有分布異常[2，3]。2011年6月～2016年12月，我們通過建立壓力超負荷心力衰竭大鼠模型，觀察重組人腦鈉尿肽(rhBNP)對心肌重構和Cx43表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雄性SD大鼠45只，體質量(200±20)g，購于南華大學動物實驗中心。Masson染色試劑盒購于福州邁新生物技術開發有限公司；HE染色試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；兔抗大鼠Cx43一抗、羊抗兔二抗、免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司；凍干rhBNP(0. 5 mg/支)購于西藏諾迪康藥業股份有限公司。

1.2 動物分組及模型制備 將45只SD大鼠隨機分為心力衰竭組(F組)、心力衰竭+ rhBNP(B組)和假手術組(SO組)，每組15只。F組和B組大鼠均經腹腔注射戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉，在無菌的環境下，于腹主動脈處將一外徑為0. 6 mm的鋼針與腹主動脈一并結扎，取出鋼針，從而建立腹主動脈縮窄心力衰竭模型。術后8周后采用心臟彩超儀和12 MHz探頭檢查射血分數(EF)，連續取三個心動周期計算EF平均值，EF小于50%的動物進入本次實驗研究。SO組大鼠除不縮窄腹主動脈外，其余步驟與上述兩組相同。B組經腹腔皮下注射用生理鹽水配制的rhBNP 25 μg/(kg·d)，SO組和F組則用生理鹽水腹腔皮下注射，均給藥8周。

1.3 血流動力學和QT離散度測定 每組大鼠均經腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，分離右側頸總動脈，插入已預先充滿肝素生理鹽水的PE50導管，使用BL-420生物機能實驗系統記錄大鼠頸動脈平均動脈壓(MABP)。同時以16導生理記錄儀連續測量5個QT間期平均值，計算QT離散度。

1.4 心肌組織形態結構觀察 取各組左心室前壁組織，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色，最后樹膠封片，觀察形態結構變化。

1.5 心肌纖維化沉積檢測 取各組左心室前壁組織，bonius氏液固定2 h，流水沖洗直至無黃染，室溫晾干，嚴格按照說明書步驟進行Masson染色。于400倍鏡下選取不同視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量計算出觀察到的染色區域膠原纖維染色面積，每個標本各取5個視野，測量并計算平均值。

1.6 Cx43表達檢測 采用免疫組化法。各組石蠟切片脫蠟水化，于3% H202中室溫孵育；沖洗、冷卻、孵育；再沖洗、脫水、透明、封片。使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算出染色區域的總光密度值和染色面積，總光密度值和染色面積的比值為Cx43表達平均光密度值(MOD)；每個標本各取5個視野，測量并計算平均值。

2 結果

2.1 三組EF、MABP比較 SO組、F組、B組EF分別為(74±5)%、(40±6)%、(41±7)%，三組EF比較差異有統計學意義(P<0.05)。與SO組比較，F組與B組大鼠EF均下降 (P均<0.05)；B組與F組比較，EF差異無統計學意義(P>0.05)。SO組、F組、B組MABP分別為(87.58±5.81)、(128.5±6.315)、 (100. 2±14. 27)mmHg,三組MABP比較差異有統計學意義(P<0. 05)；與SO組比較，F組與B組大鼠MABP均升高 (P均<0.05)；B組大鼠MABP低于F組 (P<0.05)。

2.2 三組QT離散度比較 SO組、F組、B組QT離散度分別為 (25.43±3.56)、 (128. 5±6.315)、(26. 05±4.11) ms，三組QT離散度比較差異有統計學意義(P<0.05)。與 SO組比較，F組大鼠 QT離散度增加(P<0.05)；與 F 組相比，B 組QT離散度減少(P<0.05)。

2.3 三組心肌組織形態結構及纖維化沉積情況 HE染色顯示，SO組心肌細胞形態正常，結構清晰；F組左心室前壁心肌細胞肥大，排列紊亂，B組心肌細胞直徑較F組減小，心肌組織結構紊亂改善。Masson染色鏡下膠原纖維染呈藍色。SO組、F組、B組心肌纖維沉積面積分別為(12 125±3 420)、(14 010±6 120)、(126 320±48 612)μm2，三組心肌纖維沉積面積比較差異有統計學意義(P<0. 05)；F組大鼠心肌組織間質纖維沉積較SO組增加(P<0.05)，B組大鼠心肌組織纖維沉積較F組減少(P<0.05)。

2.4 三組左室心肌Cx43表達 SO組、F組、B組心肌Cx43表達MOD分別為74.32±4.28、51.26±6.36、69.84±3.24，三組心肌Cx43表達MOD比較差異有統計學意義(P<0. 05)。與SO組比較，F組Cx43表達減少(P<0.05)，經rhBNP的治療后，B組較F組Cx43表達增加(P<0.05)。

3 討論

心肌重構是心力衰竭的重要環節，可最終引起心律失常和猝死[4]。本研究發現心力衰竭模型大鼠心臟左心EF值明顯下降，血壓升高。同時，大鼠心肌細胞肥大，排列紊亂，大量纖維沉積于心肌組織間質，引起心肌重構和心肌順應性下降[5]，心臟最終出現舒張功能和收縮功能失調，從而發生心律失常[6]。同時，心肌重構也可導致心肌電生理重構和電生理失穩態。QT離散度被認為是心室復極異質性較為準確的量化指標[7]，與充血性心力衰竭、室性心律失常、心肌缺血、心肌肥厚等疾病有著密切關系[8]。有報道顯示QT離散度增加越多，心肌電生理失穩態就越嚴重，也就越容易導致心律失常的發生[9]。本研究發現，心力衰竭的大鼠QT離散度明顯增加，這預示其更容易導致心律失常。

縫隙連接是一種細胞間連接，它由許多Cx組成并構成心肌細胞間電興奮傳導的關鍵部位，為相鄰細胞提供了一個低阻抗的電藕聯通道。研究發現，誘導敲除成年小鼠心臟中的Cx43,可以減慢心室傳導甚至猝死[9]。同時有結果表明通過刺激迷走神經調節Cx43可抑制致死性心律失常的發生，從而降低心功能不全小鼠的病死率[10]。因此心肌電生理重構、心律失常與Cx43都有著密切的關系。Beardless等[11]發現，心肌組織缺血可造成Cx43減少，從而影響細胞間的電藕聯，引起心律失常。本研究發現，心力衰竭的大鼠心肌細胞間質纖維化沉積面積明顯增加，而心肌組織Cx43表達減少，提示心力衰竭大鼠心肌組織存在明顯縫隙連接重構，并可能與心力衰竭大鼠QT離散度增加以及電生理失穩態有關。

腦利鈉肽主要是由左心室的心肌細胞所分泌的一種肽類激素。有研究表明腦鈉肽具有抑制RASS系統活性、抑制促腎上腺皮質激素的釋放、促進排鈉利尿等作用[12，13]。本研究顯示rhBNP可降低MABP，證實其有利尿降壓作用。Su等[14]發現腦利鈉肽還可改善心肌梗死后大鼠心肌纖維化，Zhu等[15]也發現長期腦利鈉肽干預可改善心力衰竭大鼠的心肌重構。本研究發現，經rhBNP干預后心力衰竭大鼠心肌重構明顯改善，心肌纖維化沉積面積明顯減少。同時發現rhBNP干預后心力衰竭大鼠心肌組織Cx43蛋白表達上調，提示rhBNP可以改善心力衰竭大鼠心肌的縫隙連接。與此同時，rhBNP干預后心力衰竭大鼠QT離散度也明顯減少，說明rhBNP可能在治療心力衰竭的同時還可以改善心力衰竭時的心肌電生理失穩態，有助于減少心律失常的發生。本研究發現，心力衰竭大鼠出現縫隙連接重構，Cx43表達減少及分布紊亂。經rhBNP治療8周后縫隙連接重構得到抑制，電生理失穩態改善。

綜上所述，rhBNP具備潛在抑制心律失常發生的作用，作為一種新型的抗心衰藥物臨床應用前景廣闊。但是，rhBNP干預心力衰竭時心肌電生理失穩態和縫隙連接重構作用的更深層機制仍不是十分清楚，有待進一步研究。

[1] Zhu XQ , Hong HS, Lin XH, et al. Changes in cardiac aldosterone and its synthase in rats with chronic heart failure:an intervention study of long-term treatment with recombinant human brain natriuretic peptide[J]. Braz J Med Biol Res, 2014,47(8):646-654.

[2] 李世強, 傅向華, 代玉涵,等.早期應用重組人B型利鈉肽對ST段抬高型心肌梗死患者急診冠狀動脈介入術后心肌梗死面積的影響[J].中華心血管病雜志, 2015, 43(11):954-959.

[3] 馮俊,陳華文.丹參酮ⅡA通過調節miR-133水平對慢性心力衰竭心肌重構的影響[J].現代中西醫結合雜志,2016,25(8):803-806.

[4] 蔡輝,蔡佳玉,張靜,等.丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心肌纖維化的影響及機制[J].山東醫藥,2013,53(10):14-16.

[5] Chevalier B, Heudes D, Heymes G, et al. Trandolapril decreases prevalence of ventricular ectopic activity in middle-aged SHR[J].Circulation, 1995,92(7):1947-1953.

[6] 趙妍,馬向紅,李廣平.Tp-e/QT比值和QTd對急性ST段抬高性心肌梗死患者室性心律失常的預測價值[J].中華臨床醫師雜志,2013,7(2):504-507

[7] 鄭喜勝,秦根生,董照剛,等.穩心顆粒對老年充血性心力衰竭患者QT間期離散度的影響[J].中國實用醫藥,2013,8(5):173-174.

[8] 唐純青,史杰,唐國驥.急性心肌梗死QTd增大伴心律失常86例報告[J].山東醫藥,2005,45(13):31-31.

[9] Van Rijen HVM, Eckardt D, Degen J, et al. Slow conduction and enhanced anis otropy increase the propensity for ventricular tachya-rrhythmias in adult mice with induced deleti on of connexin43[J].Circulation, 2004,109(8):1048-1055.

[10] Zhang Y, Kakinuma Y, Ando M, et al. Acetylcholine inhibits the Hypoxia-induced reduction of connexin43 protein in rat cardiomyo-cytes[J]. J Phar m acol Sci, 2006,101(3):214-222.

[11] Beardslee MA, Lerner DL, Tadros PN, et al. Dephosphorylation and intracellular redistribution of ventricular connexin 43 during electrical uncoupling induced by ischemia [J]. Circ Res, 2000,87(8):656-662.

[12] Nishikimi T, Maeda N, Matuoka H. The role o f natriuretic peptides in cardio protection[J]. Cardiovasc Rds, 2006, 69(2):318-328

[13] 潘柏申.心臟標志物的臨床應用[J].中華檢驗醫學雜志,2005,28(1):124-126.

[14] Su Z, Wei G, Wei L, et al. Effects of rhBNP on myocardial fibrosis after myocadial infarction in rats[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(6):6407-6415.

[15] Zhu XQ, Hong HS, Lin XH, et al.Changes in cardiac aldosterone and its synthase in rats with chronic heart failure: an intervention study of long-term treatment with recombinant human brain natriuretic peptide[J].Braz J Med Biol Res, 2014,47(8):646-654.

Effects of recombinant human brain natriuretic peptide on myocardial remodeling and connexin 43 expression in rats with heart failure

TANWenting1,PENGWeirui,TANGFen,LIUShengquan,LONGJunrong,CHUChun

(1TheFirstAffiliatedHospitalofSouthChinaUniversity,Hengyang421001,China)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.33.003

R541.6

A

1002-266X(2017)33-0009-04

國家自然科學基金資助項目(81202830)。

譚文婷(1993-)，女，在讀碩士，研究方向為心血管疾病的診治。E-mail：15377389133@163.com

褚春(1977-)，女，副主任藥師，研究方向為藥物聯合基因修飾對心肌梗死后心肌重構的作用及機制。E-mail：yjchuchun@163.com

2016-12-31)