環狀RNAs在消化系惡性腫瘤中的表達、生物學功能及臨床應用研究進展

何存存，吳會超，成紹敏

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

環狀RNAs在消化系惡性腫瘤中的表達、生物學功能及臨床應用研究進展

何存存，吳會超，成紹敏

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

環狀RNAs高度穩定，且不易被核酸外切酶降解，能夠存在于外泌體和血液中。其在食管鱗癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺導管癌中表達異常，具有微小RNA海綿、參與蛋白翻譯、調控基因轉錄及剪切等功能，通過多種信號通路在上述消化系腫瘤發生、發展及轉移中發揮重要調控作用，并且可以作為分子標志物用于消化道腫瘤的診斷和預后判斷。

環狀RNA；食管鱗癌；胃癌；結直腸癌；肝細胞癌；胰腺導管癌；微小RNA

環狀RNAs是非編碼RNAs(ncRNAs)家族中的一類競爭性內源性RNAs(ceRNAs)[1]，其分子結構呈閉合環狀，以共價鍵結合，不含有5′-帽和3′-多聚腺苷酸A尾結構，因此對核糖核酸酶不敏感，比線狀RNA更加穩定，且不易被降解[2]。環狀RNAs與人類疾病息息相關，估計約15%的活性基因會產生環狀RNAs[3]。新近的研究證實，環狀RNAs在食管鱗癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺導管癌中表達異常，與細胞間黏附、細胞周期調節以及腫瘤的增殖、侵襲、轉移密切相關[4]。本文就環狀RNAs在消化系惡性腫瘤中的表達、生物學功能及臨床應用研究進展作一綜述。

1 環狀RNAs在消化系惡性腫瘤中的表達

環狀RNAs在食管鱗癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺導管癌等消化系惡性腫瘤中均有表達異常，并與腫瘤分期、浸潤深度及淋巴結轉移等臨床病理參數相關。

1.1 環狀RNAs在食管鱗癌中的表達 有研究表明，環狀RNA cir-ITCH在食管鱗癌組織中呈低表達，作為miR-7、miR-17和miR-214的海綿，cir-ITCH可以增加其親本基因ITCH的表達水平，促進磷酸化Dvl2的泛素化和降解，抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而對食管鱗癌產生抑制作用[5]。Xia等[6]通過對51例食管鱗癌患者的研究發現，與癌旁組織相比，環狀RNA hsa-circ-0067934在食管鱗癌組織中顯著過表達，且其高表達程度與食管鱗癌分化程度、TNM分期等有關。通過siRNA體外沉默，hsa-circ-0067934能夠抑制食管鱗癌細胞的增殖遷移和阻遏細胞周期進展，這表明hsa-circ-0067934有望成為食管鱗癌的一種新型的診斷標志物和靶向治療目標。

1.2 環狀RNAs在胃癌中的表達 Pan等[7]檢測了102例原發胃癌組織及其配對的癌旁組織中的環狀RNA-7(ciRS-7)，結果顯示ciRS-7在胃癌組織中的表達顯著上調，其過表達與胃癌的腫瘤分期、淋巴結轉移和遠處轉移相關，提示其可作為胃癌預后不良的一個獨立危險因素。通過進一步的細胞實驗證實，ciRS-7過表達可激活PTEN/PI3K/AKT信號通路來抑制微小RNA-7(miR-7)功能，從而影響miR-7在胃癌中的腫瘤抑制作用。當然也有學者通過對基因組位點擴增的研究發現，環狀RNA circ-PVT1在胃癌組織中表達上調，且其作為miR-125家族成員的海綿，能夠促進胃癌細胞增殖[8]。環狀RNA Has-circ-0000190首次被發現在胃癌組織和血漿中表達下調，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期和CA19-9水平顯著相關[9]。

1.3 環狀RNAs在結直腸癌中的表達 Dou等[10]對來源于同一結直腸癌細胞株的三種細胞DLD-1(既含KRAS野生型又含KRAS突變型)、DKO-1(只含KRAS突變型)和DKs-8(只含KRAS野生型)進行檢測，發現與DKs-8細胞株相比，環狀RNAs在DLD-1和DKO-1細胞株中顯著下調，大部分環狀RNAs在KRAS突變的結直腸癌細胞中表達下調，表明了KRAS基因突變對環狀RNAs的表達產生廣泛影響。此外，在這三個細胞株分泌的相應的細胞外囊泡(EVs)中也檢測到了環狀RNAs，且外泌體中環狀RNAs表達比細胞內豐富。Weng等[11]研究顯示，ciRS-7在結直腸癌組織中顯著上調，其過度表達與結直腸癌患者轉移和不良預后相關。進一步通過細胞實驗表明，ciRS-7在HCT116和HT29細胞中過表達可阻礙miR-7的腫瘤抑制作用，激活其靶基因，促進結直腸癌細胞增殖、侵襲及轉移。

1.4 環狀RNAs在肝細胞癌中的表達 Xu等[12]研究發現，ciRS-7與miR-7在肝癌組織中的表達呈負相關，而與miR-7的靶基因磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ(PIK3CD)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達呈正相關，ciRS-7可通過抑制肝癌中miR-7表達，間接抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而促進肝癌微血管浸潤(MVI)。肝細胞癌組織中ciRS-7表達與患者年齡、甲胎蛋白水平、腫瘤直徑、腫瘤包膜、MVI程度和不良預后顯著相關，提示ciRS-7可能參與肝細胞癌的發生發展，能夠作為肝細胞癌預后判斷的生物標志物和微血管浸潤的靶向治療目標。一項針對肝細胞癌的遺傳學和流行病學的研究發現，cir-ITCH在肝細胞癌組織中的表達顯著低于配對的癌旁組織，COX回歸分析提示cir-ITCH表達相對較高的肝細胞癌患者有著相對良好的預后，揭示了cir-ITCH可能對肝細胞癌有抑制作用，可作為肝細胞癌患者易感性和預后評估的生物標志物[13]。由此可知，環狀RNAs在肝細胞癌中的表達與一些傳統的生物標志物如甲胎蛋白和miRNAs有關，它們可能與miRNAs相互作用，充當miRNA海綿，調控miRNA靶基因的表達，影響肝癌的發生發展。此外，與miRNAs相比，環狀RNAs更穩定，甚至可以在外泌體中檢測到。因此，我們認為環狀RNAs和傳統的生物標志物的聯合應用可為肝細胞癌的診斷提供更好的理論依據。

1.5 環狀RNAs在胰腺導管腺癌中的表達 Li等[14]使用基因芯片對胰腺導管腺癌中環狀RNAs表達譜進行研究，并使用微陣列分析發現，共有351種環狀RNAs在胰腺導管腺癌組織及其配對的正常組織之間存在表達差異，其中在腫瘤組織中有209種環狀RNAs表達上調，142種環狀RNAs表達下調。后來對隨機選取的7種有表達差異的環狀RNAs進行驗證，包括有2種表達上調的(hsa-circ-0001946、hsa-circ-0005397)和5種表達下調的(hsa-circ-0006913、hsa-circ-0000257、hsa-circ-0005785、hsa-circ-0041150和hsa-circ-0008719)，結果發現上述環狀RNAs表達模式與基因芯片數據一致。在這些環狀RNAs中，hsa-circ-0005785有可能作為微小RNA海綿抑制miR181a和miR181b，而miR-181a在胰腺癌生長和轉移過程中發揮至關重要的作用[15]，miR-181b的表達與胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥密切相關[16]。

2 環狀RNAs的生物學功能

2.1 作為競爭性內源性RNAs或微小RNA海綿 Hansen等[3]的研究發現，一些環狀RNAs的RNA結合蛋白(RBP)豐富，可充當微小RNA海綿，通過自身含有的微小RNA(miRNA)結合位點，與miRNA競爭性結合mRNA 3′非翻譯區(3′UTR)的miRNA識別元件(MRE)，降低miRNA對其靶基因的抑制或降解作用，從而增加其靶基因的mRNA及蛋白的表達水平，參與腫瘤發生發展過程中重要的生物學調控[17]。其中ciRS-7也被稱為小腦變性相關蛋白1反義轉錄物，它擁有至少70個miR-7的選擇性保守結合位點，充當miR-7海綿，有效調控miR-7，從而降低miR-7對其靶基因的抑制作用[18]。CiRS-7過表達可間接增加miR-7靶基因下游的表皮生長因子受體(EGFR)表達，進而調控細胞的生長、增殖、分化和腫瘤細胞的信號轉導[11]。同樣地，另一個作為微小RNA海綿的circRNA是cir-ITCH，它跨越了E3泛素化蛋白連接酶的幾個外顯子，由親本基因ITCH衍生而來，含有miR-7、miR-17 和miR-214的結合位點[19]。除此之外，雄性性別決定基因含有miR-138的保守結合位點[3]。總之，環狀RNAs作為競爭性內源性RNAs或微小RNA海綿的功能目前已經得到證實，但其在腫瘤發生發展中的具體生物學機制及能否通過干預此途徑來提高腫瘤分子靶向治療仍有待進一步研究。

2.2 參與蛋白翻譯 起初認為，環狀RNAs不含有5′- 帽和3′- 多聚腺苷酸A尾結構，且大多數存在于細胞質中，缺乏相應的內部核糖體進入位點(IRES)，不能翻譯出蛋白質[20]。但后來有研究報道，一部分內源性環狀RNAs能夠被翻譯成蛋白質[21]。一些研究表明，在起始密碼子上游含有IRES序列的人工環狀RNAs能翻譯出功能性的綠色熒光蛋白(GFP)[20]。Legnini等[22]發現，環狀RNA circ-ZNF609在小鼠成肌細胞中可被IRES驅動，轉化為蛋白質。Pamudurti等[23]對飛行昆蟲頭部提取物的質譜分析發現，環狀RNA circMbl3也能夠翻譯出蛋白質。一些具有多個標記編碼序列的人工合成環狀RNAs在沒有任何特定的IRES驅動的情況下，可通過類似于滾環擴增(RCA)的機制，也能夠翻譯蛋白質[21]。

2.3 調控基因轉錄及剪切 環狀RNAs還可以調控基因轉錄，其機制多種多樣，比如以通過miRNAs發揮作用。這一部分環狀RNAs基本存在于原核生物。例如環狀RNAs circ-EIF3J和circ-PAIP2可以通過與U1核小核糖蛋白體和RNA聚合酶Ⅱ相互作用，增強HeLa細胞和HEK293細胞中親本基因的表達[24]。也有研究發現，環狀RNAs ci-ankrd52和ci-sirt7也能夠通過與RNA聚合酶Ⅱ相互作用在其親本基因中起到正反饋調控功能[25]。這表明環狀RNAs也能調控親本基因轉錄。Ashwal-Fluss等[26]發現環狀RNAs可以通過競爭剪接因子調控親本基因表達。以上研究表明，circRNAs在親本基因的不同表達水平即可起到正反饋調控，又可起到負反饋調控。

2.4 調控腫瘤信號通路 環狀RNAs通過多種機制參與腫瘤分子生物學調控，其中最重要的為ciRS-7/miR-7調控軸。越來越多的證據顯示，miR-7在肝細胞癌、胃癌、結直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、舌癌及神經鞘腫瘤等多種腫瘤中作為抑制基因參與癌癥發生。Chou等[27]研究發現，在肺癌中ciRS-7能增加miR-7靶基因的表達，顯著降低腫瘤抑制基因miR-7的活性。而miR-7參與多種腫瘤信號通路，如miR-7可直接下調EGFR、mTOR、PIK3CD、胰島素受體底物1(IRS-1)及黏著斑激酶(FAK)等。在體外，miR-7過表達通過調控PI3K/Akt信號通路參與細胞周期阻滯和細胞遷移。已經有相關研究證實，腫瘤干細胞(CSCs)在癌癥進展和轉移中起重要作用，miR-7在CSCs中表達下調。Kruppel樣因子4(KLF4)作為CSCs中關鍵的轉錄因子，miR-7抗癌作用的部分原因可能是它能夠抑制KLF4，這一調節在乳腺癌轉移中起著重要作用[28]。此外，miR-7通過下調組蛋白賴氨酸1(SETDB1)來間接調控信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)，導致EMT并抑制乳腺癌干細胞細胞侵襲轉移[29]。在胃癌發生發展過程中，miR-7通過抑制IGF1R，上調E鈣黏蛋白，從而抑制EMT，延緩腫瘤生長和轉移[30]。另有circ-ITCH在食管癌細胞株Eca-109和TE-1中，可抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，導致癌細胞增殖能力、細胞周期進程和致瘤能力均受到抑制[5]。

3 環狀RNAs在消化道腫瘤的診斷及預后判斷的應用

由于環狀RNAs具有高度的穩定性，不易被核酸外切酶降解，故環狀RNAs可以在細胞內不斷累積[31]。環狀RNAs的一個可能排泄機制是EVs，EVs是指從細胞膜上脫落或由細胞分泌的囊泡狀小體，其內包含有RNA、蛋白質和脂類等多種細胞成分，在許多體液，如血液、尿液或唾液中都可以發現EVs的存在，根據它們的合成或釋放途徑，可以將EVs分為不同的亞型，其中外泌體是研究最為熱門的亞型[32]。Li等[33]研究表明，環狀RNAs可存在于于外泌體和血漿中，外泌體中的環狀RNAs表達量是產生環狀RNAs的癌細胞的3倍以上；此外，他們研究團隊還發現，環狀RNA circ-KLDHC10在結直腸癌患者血清中的表達水平比健康人群血清高。近期，環狀RNA hsa-circ-0000190被發現是胃癌診斷的一個潛在的生物標志物，其在胃癌組織和血漿中均表達下調，與CEA和CA19-9這兩個經典的生物標志物相比，hsa-circ-0000190具有更好的敏感性和組織特異性，has-circ-0000190有望成為有助于胃癌診斷的一種非侵入性的生物標志物[9]。另一方面，胃癌患者術后血漿中環狀RNA has-circ-002059與術前相比有顯著差異，且其低表達水平與遠端轉移、TNM分期、性別和年齡相關[34]。因此，與腫瘤組織相比，外泌體或血漿中環狀RNAs穩定表達為腫瘤診斷提供更為便捷的方式。

綜上所述，環狀RNAs高度穩定，且不易被核酸外切酶降解，能夠存在于外泌體和血液中，在食管鱗癌、胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、胰腺導管癌中表達異常，具有微小RNA海綿、參與蛋白翻譯、調控基因轉錄及剪切等功能，通過多種信號通路在消化系腫瘤發生、發展及轉移中發揮重要調控作用，并且可以作為分子標志物用于消化道腫瘤的診斷和預后判斷。但環狀RNAs在消化道腫瘤中的作用仍處于推測階段，需更大樣本、更多數據和細胞實驗進一步證實，其最終是否能夠真正應用于腫瘤診斷與治療仍未可知。腫瘤細胞中環狀RNAs的功能、環狀RNAs檢測方法的優化、尋找可以作為腫瘤診斷標志物或治療靶點的環狀RNAs是今后的研究方向。

[1] Qu S, Yang X, Li X, et al. Circular RNA: a new star of noncoding RNAs[J]. Cancer Lett, 2015,365(2):141-148.

[2] Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013,495(7441):333-338.

[3] Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges[J]. Nature, 2013,495(7441):384-388.

[4] Salzman J, Gawad C, Wang PL, et al. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types[J]. PLoS One, 2012,7(2):e30733.

[5] Li F, Zhang L, Li W, et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2015,6(8):6001-6013.

[6] Xia W, Qiu M, Chen R, et al. Circular RNA has_circ_0067934 is upregulated in esophageal squamous cell carcinoma and promoted proliferation[J]. Sci Rep, 2016,6:35576.

[7] Pan H, Li T, Jiang Y, et al. Overexpression of circular RNA ciRS-7 abrogates the tumor suppressive effect of miR-7 on gastric cancer via PTEN/PI3K/AKT signaling pathway[J]. J Cell Biochem, 2017,9999:1-7.

[8] Chen J, Li Y, Zheng Q, et al. Circular RNA profile identifies circPVT1 as a proliferative factor and prognostic marker in gastric cancer[J]. Cancer Lett, 2017,388:208-219.

[9] Chen S, Li T, Zhao Q, et al. Using circular RNA hsa_circ_0000190 as a new biomarker in the diagnosis of gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2017,466:167-171.

[10] Dou Y, Cha DJ, Franklin JL, et al. Circular RNAs are down-regulated in KRAS mutant colon cancer cells and can be transferred to exosomes[J]. Sci Rep, 2016,6:37982.

[11] Weng W, Wei Q, Toden S, et al. Circular RNA ciRS-7-A promising prognostic biomarker and a potential therapeutic target in colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res, 2017,23(14):3918-3928.

[12] Xu L, Zhang M, Zheng X, et al. The circular RNA ciRS-7 (Cdr1as) acts as a risk factor of hepatic microvascular invasion in hepatocellular carcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2017,143(1):17-27.

[13] Guo W, Zhang J, Zhang D, et al. Polymorphisms and expression pattern of circular RNA circ-ITCH contributes to the carcinogenesis of hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2017,8(29):48169-48177.

[14] Li H, Hao X, Wang H, et al. Circular RNA expression profile of pancreatic ductal adenocarcinoma revealed by microarray[J]. Cell Physiol Biochem, 2016,40(6):1334-1344.

[15] Zhang P, Guo Z, Hu R, et al. Interaction between microRNA-181a and TNFAIP1 regulates pancreatic cancer proliferation and migration[J]. Tumour Biol, 2015,36(12):9693-9701.

[16] Takiuchi D, Eguchi H, Nagano H, et al. Involvement of microRNA-181b in the gemcitabine resistance of pancreatic cancer cells[J]. Pancreatology, 2013,13(5):517-523.

[17] Kartha RV, Subramanian S. Competing endogenous RNAs (ceRNAs): new entrants to the intricacies of gene regulation[J]. Front Genet, 2014,5:8.

[18] Saydam O, Senol O, Würdinger T, et al. miRNA-7 attenuation in Schwannoma tumors stimulates growth by upregulating three oncogenic signaling pathways[J]. Cancer Res, 2011,71(3):852-861.

[19] Li F, Zhang L, Li W, et al. Circular RNA ITCH has inhibitory effect on ESCC by suppressing the Wnt/β-catenin pathway[J]. Oncotarget, 2015,6(8):6001-6013.

[20] Wang Y, Wang Z. Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs[J]. RNA, 2015,21(2):172-179.

[21] Abe N, Matsumoto K, Nishihara M, et al. Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells[J]. Sci Rep, 2015,5:16435.

[22] Legnini I, Di Timoteo G, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis[J]. Mol Cell, 2017,66(1):22-37.

[23] Pamudurti NR, Bartok O, Jens M, et al. Translation of CircRNAs[J]. Mol Cell, 2017,66(1):9-21.

[24] Li Z, Huang C, Bao C, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the Nucleus[J]. Nat Struct Mol Biol, 2015,22(3):256-264.

[25] Zhang Y, Zhang XO, Chen T, et al. Circular intronic long noncoding RNAs[J]. Mol Cell, 2013,51(6):792-806.

[26] Ashwal-Fluss R, Meyer M, Pamudurti NR, et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing[J]. Mol Cell, 2014,56(1):55-66.

[27] Chou YT, Lin HH, Lien YC, et al. EGFR promotes lung tumorigenesis by activating miR-7 through a Ras/ERK/Myc pathway that targets the Ets2 transcriptional repressor ERF[J]. Cancer Res, 2010,70(21):8822-8831.

[28] Okuda H, Xing F, Pandey PR, et al. miR-7 suppresses brain metastasis of breast cancer stem-like cells by modulating KLF4[J]. Cancer Res, 2013,73(4):1434-1444.

[29] Zhang H, Cai K, Wang J, et al. MiR-7, inhibited indirectly by lincRNA HOTAIR, directly inhibits SETDB1 and reverses the EMT of breast cancer stem cells by downregulating the STAT3 pathway[J]. Stem Cells, 2014,32(11):2858-2868.

[30] Zhao X, Dou W, He L, et al. MicroRNA-7 functions as an anti-metastatic microRNA in gastric cancer by targeting insulin-like growth factor-1 receptor[J]. Oncogene, 2013,32(11):1363-1372.

[31] Conn SJ, Pillman KA, Toubia J, et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs[J]. Cell, 2015,160(6):1125-1134.

[32] Harding CV, Heuser JE, Stahl PD. Exosomes: looking back three decades and into the future[J]. J Cell Biol, 2013,200(4):367-371.

[33] Li Y, Zheng Q, Bao C, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis[J]. Cell Res, 2015,25(8):981-984.

[34] Li P, Chen S, Chen H, et al. Using circular RNA as a novel type of biomarker in the screening of gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2015,444:132-136.

貴州省科技廳、遵義醫學院、遵義市科技局聯合基金資助項目(LKZ[2013]-13號)。

吳會超(E-mail： wuhuichao985@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.034

R735

A

1002-266X(2017)40-0100-04

2017-07-17)