骨碎補總黃酮對骨質疏松癥大鼠BMP—2蛋白表達及血清骨鈣素水平的影響

黃松++陳敬有++高皓

[摘要]目的 探討骨碎補總黃酮對骨質疏松癥大鼠BMP-2蛋白表達及血清骨鈣素水平的影響。方法 通過摘除大鼠卵巢的方法復制骨質疏松癥模型，并將大鼠分成正常組、假手術組、模型組、骨碎補總黃酮組和鈣爾奇D片組。手術后第7天開始給藥，1次/d，連續12周，HE染色觀察大鼠骨組織形態學變化，ELISA檢測各組大鼠股骨中BMP-2蛋白表達情況以及血清中的骨鈣素水平。結果HE染色結果顯示，骨碎補總黃酮組大鼠股骨組織的骨小梁數量、密度、布局及完整性均優于模型組，且大鼠股骨組織中BMP-2蛋白表達量[（13.469±0.215）pg/ml]和血清中骨鈣素水平[（1.61±0.09）μg/L]均分別高于模型組的（5.516±0.119）pg/ml和（0.76±0.22）μg/L（P<0.05），接近于假手術組的（15.279±0.211）pg/ml和（1.34±0.17）μg/L（P>0.05）。結論 骨碎補總黃酮治療骨質疏松癥大鼠的效果顯著，其作用機制可能是通過上調股骨組織中BMP-2蛋白和血清中的骨鈣素水平，進而促進骨組織的形成。

[關鍵詞]骨質疏松癥；骨碎補總黃酮；骨形態發生蛋白-2；骨鈣素

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（a）-0012-04

[Abstract]Objective To explore the effect of Total Flavonoids of RhizomaDrynariae on BMP-2 protein expression and serum bone gla protein level in rats with osteoporosis.Methods Osteoporosis model was established by removing rat ovary，and the rats were divided into normal group，sham operation group，model group，total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group and Caltrate D Tablet group.In the seventh days after surgery，drugs were used once per day for 12 consecutive weeks.Morphological change of bone tissue in rats was observed by HE staining，and the expression of BMP-2 protein and the level of serum bone gla protein level in the femur of rats in each group was detected by ELISA.Results HE staining indicated that the number，density，distribution，and integrity of bone trabecula in the rats femoral bone tissue in the Total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group were superior to those in the model group.The protein expression of BMP-2 in rats femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein [（13.469±0.215 ） pg/ml and （1.61±0.09） μg/L respectively] was much higher than that in the model group [（5.516±0.119） pg/ml and （0.76±0.22） μg/L respectively] （P<0.05）.The protein expression and serum bone gla protein level was close to that in the sham operation group respectively[（15.279±0.211） pg/ml and （1.34±0.17） μg/L] （P>0.05）.Conclusion In the treatment of rats with osteoporosis，Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria can obtain a great effect.The possible mechanism is through up-regulation of BMP-2 protein in the femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein，thus promoting the formation of bone tissue.

[Key words]Osteoporosis；Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria；Bone morphogenetic protein-2；Bone gla protein

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種比較常見的疾病，主要是以骨量減少、骨組織微結構退化為特征，導致骨脆性增加，骨折率高發[1]。骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一種與骨組織生長相關的多功能糖蛋白，是最主要的骨形成調控因子，能夠誘導未分化的間充質細胞分化為成骨細胞和軟骨細胞，進而誘導新骨的形成[2-3]，BMP-2是誘導成骨活性最強的骨形態發生蛋白之一，能夠直接反映新骨形成情況。骨鈣素（bone gla protein，BGP）是由成骨細胞分泌的一種激素樣多肽，比較穩定，不受骨吸收因素的影響，能夠反映新形成的成骨細胞的活動狀態，是臨床上反映骨代謝狀況的特異性生化指標[4]。成骨細胞分化末期特異性表達的BGP能調控骨礦物的沉積和轉移，促進成骨細胞成熟及骨細胞的形成[5-6]。目前治療OP的臨床藥物極多[7]，其中以中藥材藥物最為突出[8]，中藥具有療效好、副作用小、經濟實惠等特點，因此受到了人們的關注。骨碎補總黃酮是中藥材骨碎補根莖的提取物，研究發現骨碎補總黃酮對OP導致的骨密度下降有明顯的抑制作用[9]，而且還可以在抑制破骨細胞活性的同時促進成骨細胞增殖[10-11]，因此，骨碎補總黃酮是一種常見的治療老年性OP的中藥材，但有關骨碎補總黃酮治療老年性OP的機制研究還不全面。本研究應用OP動物模型，探討骨碎補總黃酮對OP模型大鼠血清BGP和BMP-2蛋白的影響，進一步為骨碎補總黃酮有效治療OP提供新的機制論點。

1材料與方法

1.1實驗動物

雌性健康的Wistar大鼠50只，鼠齡5～6個月，體重（243±21）g，未曾交配，購自于湖北省實驗動物中心。

1.2實驗試劑與儀器

骨碎補總黃酮（商品名：強骨膠囊，生產批號：150412，北京岐黃制藥有限公司），鈣爾奇D片（生產批號：150710，惠氏制藥有限公司），大鼠BGP（OT）ELISA檢測試劑盒（上海研謹生物科技有限公司），BMP-2試劑盒（AMEKO），多功能酶標儀（型號：Infinite M200，Tecan），低溫高速離心機（型號：ST40R，Thermo），解剖手術器械（上海醫療器械手術器械有限公司）。

1.3動物分組及造模

實驗前將動物隨機分為兩組，正常組（10只）和手術組（40只）。將手術組動物分別沿左右軟肋下剪開皮膚，分離皮膚筋膜及腹膜臟層，暴露腹腔，預留假手術組10只，其他大鼠進行結扎及剪除整個卵巢組織，分層縫合后，外層皮膚消毒，正常飼養，手術過程中無大鼠死亡。術后7 d再將手術組存活的大鼠隨機分成4組（每組小鼠數量一致，各8只），即假手術組、模型組、骨碎補總黃酮組和鈣爾奇D片組。

1.4給藥及取材

手術后第7天開始給藥，每天上午灌胃1次，連續12周。根據人與大鼠體表面積計算大鼠的骨碎補黃酮和鈣爾奇D片用藥使用量，正常組、假手術組和模型組以等量的生理鹽水灌胃。灌胃期間，每周一對大鼠體表面積進行重新估算，以調整給藥劑量。灌胃第12周后，禁食24 h后，眼球取血，-20℃保存。取血后，用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重肌內注射麻醉后，在無菌條件下，取右后肢股骨干骺端，剝離附著的肌肉及解體組織，充分暴露股骨頭，用消毒后的老虎鉗將股骨頭鉗碎，放入無菌的EP管中，做好標記，一部分用于石蠟包埋，一部分用于提取骨組織中的蛋白。

1.5 HE染色

取小鼠股骨組織剪碎成3～5 mm后，經10%甲醛固定，10%硝酸溶液脫鈣后，自來水水洗過夜，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，至于65℃恒溫烘箱烤片6 h左右。將組織切片常規脫蠟至水，水洗1～2 min，蘇木精染液染色3～6 min，流水洗去蘇木精染液1～2 min，然后放入1%鹽酸乙醇1～3 s，稍水洗1～2 s，促藍液返藍5～10 s，水洗15～30 s，0.5%伊紅染液染色2～3 min，蒸餾水洗1～2 s，80%乙醇15～30 s，95%乙醇15～30 s，無水乙醇1～2 s，分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明2次，每次2～3 s，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下（×100），觀察各組小鼠股骨組織片HE染色情況。

1.6大鼠股骨中BMP-2蛋白和血清中BGP的測量

按照ELISA檢測試劑盒的說明書要求進行，用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值（D），繪制標準曲線，計算大鼠股骨組織中BMP-2蛋白的實際濃度以及各組血清中BGP水平。

1.7統計學處理

采用SPSS 17.0統計學軟件分析數據，計量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1大鼠股骨組織HE染色

如圖1A、B所示，正常組和假手術組大鼠股骨組織形態結構完整，骨細胞位于骨髓腔中央，骨髓腔較小，骨小梁粗細一致，相互連接成網絡結構，無斷裂現象，骨小梁之間間隙較小。模型組大鼠隨著卵巢組織被摘除，雌激素分泌減少，骨組織形態結構不完整，骨小梁丟失、斷裂嚴重，骨小梁之間連接點較少，分布稀疏凌亂，游離末端增多，間距增大，骨髓腔融合嚴重，出現典型的骨質疏松病理形態改變，如圖1C所示。骨碎補總黃酮組大鼠股骨組織與模型組相比較，骨小梁增厚，斷裂減少，連接點增多，尚可連接成網絡結構，骨小梁數量較多，密度增大，排列規則，完整性明顯優于模型組，但比正常組和假手術組稍差，如圖1D所示。鈣爾奇D片組與骨碎補總黃酮組比較，骨小梁斷裂較多，結構不完整，連接點較少，具有較多的游離末端；但是與模型組比較，鈣爾奇D片組骨小梁數量、密度、連接狀態以及完整性均優于模型組，如圖1E所示。

2.2 ELISA檢測大鼠骨中BMP-2蛋白表達情況

各組大鼠股骨中BMP-2蛋白表達情況如表1所示，鈣爾奇D片組和模型組與正常組比較，BMP-2蛋白濃度明顯下降（P<0.05）。與模型組比較，骨碎補總黃酮組和鈣爾奇D片組差異有統計學意義（P<0.05），提示這兩組藥物均能顯著提高大鼠股骨中的BMP-2蛋白表達，與正常組比較，鈣爾奇D片組差異有統計學意義（P<0.05），而骨碎補總黃酮組差異無統計學意義（P>0.05），提示骨碎補總黃酮對OP的治療效果比鈣爾奇D片顯著。

2.3大鼠血清的BGP水平變化

模型組與正常組、假手術組比較，BGP濃度下降明顯（P<0.05），提示OP中骨代謝異常，BGP水平較低；骨碎補總黃酮組和鈣爾奇D片組的BGP濃度高于正常組（P>0.05），骨碎補總黃酮組和鈣爾奇D片組與模型組比較差異有統計學意義（P<0.05）（表2），提示骨碎補總黃酮組和鈣爾奇D片組能提高OP大鼠血清中的BGP含量，從而促進骨質合成，從結果上看，骨碎補總黃酮組的療效好于鈣爾奇D片組。

3討論

骨骼是人體重要的一個組成成分，它不僅具有生命力還具有一定的彈性和韌性，賦予人類運動的功能，然而各種骨類疾病的發生給人類的生活質量造成很大影響。BMP是一種存在于骨基質中的酸性糖蛋白，也是一種能夠誘導骨組織形成的生長因子，例如能夠誘導人體間充質細胞分化為骨、韌帶、軟骨、肌腱和神經組織[12-13]。骨修復過程受到多種因子的調節，而BMP-2就是其中最重要的調節因子之一。機體受到相應外界信號刺激時，BMP-2與細胞膜上的受體結合，將信息轉遞至細胞核內，通過轉錄激活相關物質促進骨組織的再生[14]。BGP是成骨細胞分泌的一種激素樣多肽，是骨代謝狀況的特異性生化指標，能特異性反映成骨細胞的活性[15]。BGP由成骨細胞分泌后沉積在骨組織的間質細胞外，最后釋放至血液中，因此血液中的BGP與骨組織中BGP含量成正相關[16]。雌激素能夠通過促進骨樣細胞增殖分化和誘導骨細胞成熟，達到促使骨形成的作用[17-18]，而破骨細胞和成骨細胞中也存在雌激素受體，因此常使用摘除動物卵巢的方法制備OP動物模型[19-20]。本研究采用摘除大鼠卵巢的方法復制OP模型，以及通過檢測BMP-2蛋白表達以及BGP水平來探討骨碎補總黃酮組治療OP可能存在的機制。

根據大鼠股骨組織HE染色結果，可以看出模型組大鼠股骨骨組織形態結構不完整，骨小梁丟失、斷裂嚴重，骨小梁之間連接點較少，分布稀疏凌亂，游離末端增多，間距增大，骨髓腔融合嚴重，是典型的骨質疏松病理形態改變，說明造模成功。持續給藥12周后，骨碎補總黃酮組大鼠骨小梁增厚，斷裂減少，連接點增多，同時骨小梁數量較多，密度增大，排列規則，說明骨碎補總黃酮能明顯改善OP病情。且模型組中BMP-2蛋白表達量和血清BGP水平與正常組比較顯著性降低，說明OP大鼠機體內BMP-2蛋白處于低表達水平，血清BGP處于低水平狀態；然而骨碎補總黃酮組與模型組比較，大鼠體內BMP-2蛋白表達和血清BGP處于較高水平狀態，說明骨碎補總黃酮組能夠提高OP大鼠機體內BMP-2蛋白表達和血清BGP水平。另外，鈣爾奇D片組大鼠股骨骨組織骨小梁密度、數量及完整性稍差于骨碎補總黃酮組，優于模型組，大鼠機體內BMP-2蛋白表達和血清BGP水平也稍低于骨碎補總黃酮組，說明骨碎補總黃酮的療效更佳，因而，骨碎補總黃酮有效治療老年OP的機制可能是通過提高骨內BMP-2蛋白表達和血清中的BGP水平來實現的。

[參考文獻]

[1]劉政，吳倩，黃帥立，等.骨質疏松癥的中醫病因病機與治則研究[J].江蘇中醫藥，2014，46（2）：42-44.

[2]Wang C，Wang J， Li J，et al.KDM5A controls bone morphogenic protein 2-induced osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells during osteoporosis[J].Cell Death Dis，2016，7（8）：e2335.

[3]張春，魏琴，王雪梅，等.BMP-2體外誘導OPG-/-小鼠BMSCs向成骨方向分化的實驗研究[J].實驗動物與比較醫學，2012，32（3）：186-190.

[4]蔡曉燕，董光富.脂代謝及血清骨鈣素水平與骨質疏松癥的相關性分析[J].中國骨質疏松雜志，2016，22（6）：711-712，730.

[5]Ducy P.The role of osteocalcin in the endocrine cross-talk between bone remodelling and energy metabolism[J].Diabetologia，2011，54（6）：1291-1297.

[6]王春玉，龍豐云，陳香，等.骨鈣素介導的骨內分泌系統[J].中華骨質疏松和骨礦鹽疾病雜志，2013，6（3）：196-202.

[7]裴育.骨質疏松癥治療藥物研究新進展[J].中國醫學前沿雜志（電子版），2015，7（10）：15-20.

[8]牛愛春，吳建民，郭憲章.中醫藥治療骨質疏松癥研究現狀[J].亞太傳統醫藥，2016，12（9）：47-49.

[9]曾年，王月義，裘邯軍.骨碎補總黃酮對老年骨質疏松癥骨痛和骨密度的影響[J].山東中醫雜志，2013，32（6）：387-388.

[10]謝雁鳴，秦林林，鄧文龍，等.骨碎補總黃酮對成骨細胞體外培養作用的機制研究[J].中華中醫藥雜志，2005，20（3）：161-162.

[11]Huang XF，Yuan SJ，Yang C.Effects of total flavonoids from Drynaria fortunei on the proliferation and osteogenic differentiation of rat dental pulp stem cells[J].Mol Med Rep，2012，6（3）：547-552.

[12]Shibasaki S，Kitano S，Karasaki M，et al.Blocking c-Met signaling enhances bone morphogenetic protein-2-induced osteoblast differentiation[J].FEBS Open Bio，2015，5：341-347.

[13]王霖霞，李玉坤.BMP-2信號通路與成骨細胞分化[J].國際骨科學雜志，2009，30（2）：132-133.

[14]Qu X，Cao Y，Chen C，et al.A poly （lactide-co-glycolide） film loaded with abundant bone morphogenetic protein-2：a substrate-promoting osteoblast attachment，proliferation，and differentiation in bone tissue engineering[J].J Biomed Mater Res A，2015，103（8）：2786-2796.

[15]Price PA，Parthemore JG，Deftos LJ.New biochemical marker for bone metabolism.Measurement by radioimmunoassay of bone GLA protein in the plasma of normal subjects and patients with bone disease[J].J Clin Invest，1980，66（5）：878-883.

[16]楊偉民，邵斌.骨代謝生化指標與骨質疏松癥[J].中國骨質疏松雜志，2004，10（1）：118-121.

[17]孔德策，楊鐵毅，邵進.絕經后骨質疏松骨代謝標志物研究進展[J].國際骨科學雜志，2016，37（1）：36-41.

[18]潘啟源，王直兵，張峽.雌激素通過抑制破骨細胞促進骨軟骨缺損的自發修復[J].中華創傷雜志，2016，32（6）：36-39.

[19]郭軍鵬，孟超，于蘭英，等.補腎經驗方對去卵巢所致大鼠骨質疏松的防治作用[J].吉林中醫藥，2016，36（5）：65-67.

[20]惠紅巖，董玉珍.自擬補腎活血顆粒對去卵巢骨質疏松癥大鼠的治療作用[J].中國病理生理雜志，2016，（9）：85-88.

（收稿日期：2016-12-25 本文編輯：許俊琴）