凝膠電泳毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析大腸癌腫瘤與癌旁組織的差異蛋白質(zhì)組

劉卓　李洪軍　李曉鷗　楊照微　趙麗純　黃麗紅　郭宏華　王?！≮w晴　何成彥

摘要通過凝膠電泳將大腸癌患者的手術(shù)標(biāo)本組織（腫瘤與癌旁）中的總蛋白按照分子量分成不同的組分，經(jīng)膠內(nèi)水解后，利用毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對各個(gè)組分的多肽混合物進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出29種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)19種，如Fibrinogen beta chain，Vimentin，F(xiàn)ibrinogen gamma chain，Histone H2A type 1B/E，Isoform 1 of Periostin，F(xiàn)ibrinogen alpha chain，Histone H3.1，Alphaenolase，Protein disulfideisomerase A3等； 在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)的有10種蛋白質(zhì)，如Sarcomeric tropomyosin kappa，Transgelin，Heat shock protein beta1，Talin1，Isoform 2 of Vinculin，Isoform 1 of FilaminC等。通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)對其中的踝蛋白1（Talin1）和烯醇化酶（Alphaenolase）的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析表明在大腸癌組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白多具有胞外分泌的屬性，提示這些蛋白很有可能會滲透到機(jī)體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中，從而在患者血液或者腹水中能夠被檢測到； 而在大腸癌組織中表達(dá)下調(diào)的蛋白則多為細(xì)胞骨架、胞外基質(zhì)纖維等的組成成分，這些蛋白的下調(diào)常與腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。本研究為大腸癌的早期診斷、大腸癌初篩等方面的研究等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對進(jìn)一步深入研究大腸癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

關(guān)鍵詞凝膠電泳毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜； 大腸癌； 蛋白質(zhì)組； 踝蛋白1； 烯醇化酶1

1引 言

近年來，隨著我國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化， 大腸癌的發(fā)病率和死亡率均有逐年上升的趨勢[1]，其發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，受環(huán)境中物理、化學(xué)、生物學(xué)的因素和機(jī)體中遺傳、內(nèi)分泌、免疫等因素共同誘發(fā)和影響[2，3]。因此，對大腸癌發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的生物大分子尤其是蛋白質(zhì)進(jìn)行全面整體的分析成為深入研究其內(nèi)在復(fù)雜機(jī)制的一種重要策略。目前，研究者已對多種人類腫瘤組織或細(xì)胞系包括大腸癌中開展了蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并取得了一系列成果。 Giusti等[4]通過二維（2D）電泳分離結(jié)合質(zhì)譜分析，在大腸癌患者的腸道灌洗液中發(fā)現(xiàn)了38種腫瘤相關(guān)蛋白； Hammoudi A等[5]通過二維色譜 （2DLC）技術(shù)研究小鼠的小腸上皮細(xì)胞經(jīng)APC基因敲除的蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)了81個(gè)表達(dá)升高的蛋白，生物信息學(xué)分析顯示其中9種蛋白有可能在血液循環(huán)系統(tǒng)中被檢測到； Yamamoto等[6]利用毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了甲醛固定石蠟包埋的結(jié)直腸病理組織中癌癥區(qū)域和非癌癥區(qū)域的蛋白質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)Cyclophilin A， Annexin A2， 和Aldolase等蛋白在癌癥區(qū)域的表達(dá)明顯升高。越來越多的證據(jù)表明，大腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多個(gè)癌基因和抑癌基因的改變，表現(xiàn)為多基因、多步驟的協(xié)同累積作用。因此，使用具有多種不同維度、不同機(jī)理的分離和前處理手段， 盡可能使復(fù)雜樣品混合物得到有效地分離，包括在蛋白和多肽兩種水平上對復(fù)雜組織樣品進(jìn)行全面分析，能夠得到更全面深入的樣品蛋白的種類和組成分布特征等信息。

作為一種高通量的蛋白質(zhì)研究方法，蛋白組學(xué)的研究對象常常是成百上千種蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)的不同的修飾狀態(tài)[7，8]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)研究幾乎都首先涉及到對蛋白質(zhì)、多肽的不同程度的分離， 因此需不斷完善和發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)與多肽分離技術(shù)[9，10]。相對于傳統(tǒng)的二維凝膠電泳技術(shù)，目前發(fā)展了二維色譜 （2DLC）、二維毛細(xì)管電泳 （2DCE）、液相色譜毛細(xì)管電泳 （LCCE） 、凝膠電泳毛細(xì)管液相色譜（GelCapLC）等新型分離技術(shù)。這些技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用，能夠直接、全面地對復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析鑒定，其中， 基于凝膠電泳毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)已廣泛地應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。該技術(shù)首先將蛋白質(zhì)混合物經(jīng)凝膠電泳分離，再將分離后的蛋白質(zhì)條帶剪切后分別進(jìn)行膠內(nèi)水解，得到肽段混合物再進(jìn)行毛細(xì)管液相色譜分離。這種策略整合了蛋白質(zhì)水平的分離（凝膠電泳）和多肽水平的分離（毛細(xì)管液相色譜）， 分離效率大為提高， 操作相對簡單， 已逐漸發(fā)展成為復(fù)雜蛋白質(zhì)組樣品的主流分離技術(shù)[11，12]。

本研究通過凝膠電泳毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)， 對4名大腸癌患者的手術(shù)標(biāo)本組織（腫瘤與癌旁）進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，并對蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。本研究對于大腸癌的病因、發(fā)病機(jī)制、臨床診斷、治療以及預(yù)防等方面的研究具有重要意義。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

EasynLC 1000納升液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive質(zhì)譜儀、Varioskan酶標(biāo)儀（美國Thermo Scientific公司）； PepMap100 C18反相毛細(xì)管色譜分析柱（150 mm×0.075 mm， 3μm， 美國Thermo Fisher Dionex公司）； Allegra TM X22R離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）； 離心干燥機(jī)（德國Christ公司）。

二硫蘇糖醇、測序級TPCK修飾的胰蛋白酶、苯甲基磺酰氟 （PMSF）（Promega公司）； 鼠抗人踝蛋白抗體、鼠抗人烯醇化酶抗體、兔抗人GAPDH（Glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase）抗體（Santa Cruz公司）； 尿素（Urea）、三羥甲基氨基甲烷 （Tris base）、Bradford蛋白定量試劑盒、碳酸氫銨、碘乙酰胺（BioRad公司）； 磷酸酶抑制劑、ZipTip C18吸頭（Pierce公司）； 甲酸、乙腈 （Sigma公司）； 其它試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)MilliQ純水儀制備的超純水。

2.2臨床樣本取材

本實(shí)驗(yàn)所用4例新鮮組織標(biāo)本取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診并手術(shù)治療的大腸癌患者。病人術(shù)前均未接受任何治療。所取癌旁正常組織均為距離癌邊緣10 cm之外， 切緣正常組織，并且均位于癌組織上端。標(biāo)本離體后，使用生理鹽水沖洗表面殘余血液，立即放入液氮冷凍，再置于80℃保存。另取少量組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE常規(guī)染色，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)組織類型，均是Ⅲ期腺癌。

2.3樣品總蛋白提取、蛋白濃度分析及電泳分離

2.4蛋白質(zhì)樣品的還原、烷基化和膠內(nèi)水解

用潔凈的刀片將蛋白條帶切取后，再切成1 mm3左右的顆粒，用脫色液（15 mmol/L K3[Fe（CN）6]，50 mmol/L Na2S2O3）將顏色完全脫除。用25 mmol/L NH4HCO3清洗膠粒3次后， 用乙腈脫水，室溫自然干燥。加入1 mol/L DTT溶液，充分混勻，使其終濃度為20 mmol/L； 在56℃條件下還原1 h； 反應(yīng)物溫度降至室溫后，加入1 mol/L碘乙酰胺溶液，充分混勻，使其終濃度為50 mmol/L，在常溫下避光反應(yīng)30 min； 按1∶50 （w/w）比例加入測序級胰酶， 37℃放置過夜； 酶切后樣品經(jīng)真空抽干后

2.5毛細(xì)管液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析與數(shù)據(jù)庫檢索

所有干燥的多肽樣品均溶解在流動相A（99%水+1%乙腈+0.1%甲酸）中，以 2 μL/min的流速上樣到 C18預(yù)柱（20 mm×0.075 mm， 3μm）上，以 流動相A淋洗脫鹽 10 min。再以流動相A和B（B： 99%乙腈+1%水+0.1%甲酸）進(jìn)行梯度洗脫（0～30 min， 5%～35% B； 30～ 40 min， 35%～80% B），流速為300 nL/min。洗脫出的多肽經(jīng)納升噴霧離子源進(jìn)入Q Exactive質(zhì)譜進(jìn)行分析。質(zhì)譜掃描方式為數(shù)據(jù)依賴的采集工作模式（DDA），母離子分辨率為65000，子離子分辨率為16500。每次全掃描后最多采集15個(gè)碎片圖譜。歸一化碰撞能量為28% HCD。將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理工作站，并使用Thermo Proteome Discoverer 1.1質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件，在國際蛋白質(zhì)索引中的人類數(shù)據(jù)庫（International Protein Index）進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)：胰蛋白酶（Trypsin）， 最多允許2個(gè)漏切位點(diǎn)，母離子允許最大誤差為15 ppm，子離子允許最大誤差為0.8 Da，半胱氨酸（Cys）烷基化為固定修飾，絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）的磷酸化以及甲硫氨酸（Met）的氧化為可變修飾。SEQUEST檢索后將肽段可信度參數(shù)（Peptide confidence）設(shè)為高（High），對所得結(jié)果進(jìn)行篩選，根據(jù)每個(gè)蛋白所匹配的譜圖數(shù)評價(jià)其豐度。

2.6蛋白印跡

將2.3節(jié)中各個(gè)蛋白樣品與上樣緩沖液煮沸5 min，進(jìn)行12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。將電泳分離的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到PVDF 上， 分別用抗烯醇化酶和抗踝蛋白的單克隆抗體雜交后， 加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗，以ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色。同時(shí)，使用抗GAPDH的抗體對樣品中的內(nèi)源性GAPDH進(jìn)行檢測，作為內(nèi)參。

2.7生物信息學(xué)分析

將在大腸癌組織中鑒定出的上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)上傳到基因本體論（http：//geneontology.org/）網(wǎng)站，按照不同的細(xì)胞組分（Cell Components）進(jìn)行富集分類。

3結(jié)果與討論

3.1組織總蛋白質(zhì)的提取、蛋白濃度測定及電泳分離

將4例大腸癌患者的腫瘤組織與癌旁組織從冰箱中取出，分別在液氮中研磨粉碎后，使用裂解緩沖液提取總蛋白質(zhì)。用Bradford蛋白定量試劑盒對蛋白樣品進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測并計(jì)算腫瘤與癌旁組織蛋白濃度。樣本病理信息、組織重量、制備總蛋白的體積和濃度見表1。

3.2大腸癌腫瘤組織與癌旁組織差異表達(dá)蛋白的鑒定

將腫瘤組織與癌旁組織總蛋白經(jīng)SDSPAGE分離后得到的不同分子量的共56個(gè)組分的酶解產(chǎn)物進(jìn)行液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，得到酶解混合物的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索得到各個(gè)組分的肽段和蛋白的鑒定信息（表2）。將各個(gè)組分的肽段和蛋白結(jié)果分別進(jìn)行合并，得到各個(gè)樣本的肽段和蛋白的結(jié)果。從肽段和蛋白的數(shù)量可知，4組8個(gè)樣本的肽段種類在21635～26937之間，蛋白種類在4157～5024之間（圖2）。

采用譜圖計(jì)數(shù)法，即根據(jù)鑒定蛋白的二級質(zhì)譜圖數(shù)目與蛋白豐度呈一定的正相關(guān)的原理，對蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，找出差異蛋白。 通常，樣品中某蛋白質(zhì)的豐度越高，則酶切產(chǎn)生的肽段也會越多，經(jīng)質(zhì)譜分析所匹配的二級譜圖數(shù)也會越多[13，14]。這是基于譜圖計(jì)數(shù)無標(biāo)記定量方法的基礎(chǔ)，研究者嘗試?yán)米V圖計(jì)數(shù)作為一種簡單的方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行相對定量分析。譜圖計(jì)數(shù)

（Spectral counts，SpC）模型通過直接統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)所有肽段的二級譜圖數(shù)總和來反映蛋白質(zhì)豐度。

在鑒定出每一位患者手術(shù)標(biāo)本組織的差異表達(dá)蛋白的基礎(chǔ)上，再鑒定所有在4位患者手術(shù)標(biāo)本中都具有顯著差異的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，共有29種差異表達(dá)蛋白，其中19種蛋白在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，10種蛋白在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)（表3）。

3.3部分差異蛋白的蛋白印跡驗(yàn)證

在鑒定出的29種有顯著差異蛋白質(zhì)中，挑選感興趣的蛋白（踝蛋白和烯醇化酶）進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（圖3）。結(jié)果表明， 踝蛋白在癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織，而烯醇化酶在癌組織中表達(dá)明顯高踝蛋白（Talin） 是一種主要分布在細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)，能夠?qū)⒓?xì)胞骨架肌動蛋白與整合素相連接，從而促進(jìn)穩(wěn)定黏著斑的形成[15]，與惡性腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。在前期研究工作中， 本研究組利用毛細(xì)管反向高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)， 分析了人大腸癌組織中的踝蛋白，鑒定了踝蛋白分子中的10個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)[17]。在本研究中進(jìn)一步證實(shí)，大腸正常癌旁組織中踝蛋白的表達(dá)水平明顯高于大腸原發(fā)癌組織。

在本研究組的前期工作中發(fā)現(xiàn)，在血液腫瘤白血病耐藥細(xì)胞中烯醇化酶（Enolase）有非常高的上調(diào)[18]。而烯醇化酶能夠催化2磷酸甘油酸（2Phosphoglycerate）轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate），這表明腫瘤細(xì)胞在有藥物等外界壓力因素的環(huán)境中，通過加快細(xì)胞內(nèi)糖酵解的速率而加大腫瘤細(xì)胞對葡萄糖的利用率，從而滿足腫瘤細(xì)胞所需的更多的能量消耗。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，大腸原發(fā)癌組織中烯醇化酶的含量明顯高于正常癌旁組織，提示腫瘤組織中糖酵解途徑的活躍程度明顯升高。

3.4差異蛋白的細(xì)胞組分的分類

對通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定到的大腸癌組織差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析（圖4）。結(jié)果表明，在大腸癌組織中上調(diào)的蛋白多數(shù)具有胞外分泌的屬性，提示這些蛋白很可能會滲透到機(jī)體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)中，從而在患者血液或者腹水中被檢測。上調(diào)蛋白的這種特點(diǎn)非常有利于在臨床檢驗(yàn)研究中發(fā)展相關(guān)蛋白的體液分析方法，進(jìn)一步研究這些蛋白作為大腸癌腫瘤生物標(biāo)志物的可行性。而在大腸癌組織中下調(diào)的蛋白則多為細(xì)胞骨架、胞外基質(zhì)纖維等的組成成分，這些蛋白的下調(diào)常預(yù)示著細(xì)胞間質(zhì)密度變小，有利于腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

4結(jié) 論

本研究通過凝膠電泳毛細(xì)管液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對4名大腸癌患者的手術(shù)標(biāo)本組織（腫瘤與癌旁）進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，共鑒定出29種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)19種，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)10種。通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)對其中的踝蛋白和烯醇化酶進(jìn)行了驗(yàn)證。生物信息學(xué)分析表明，在大腸癌組織中上調(diào)的蛋白多數(shù)都具有胞外分泌的屬性，而下調(diào)的蛋白則多為細(xì)胞骨架、胞外基質(zhì)纖維等的組成成分。本研究為大腸癌的早期診斷、大腸癌初篩等方面的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對進(jìn)一步深入研究大腸癌發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

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AbstractThe whole protein extracts from tissue specimens （tumor and noncancerous） from patients with colorectal cancer were divided into several fractions with different molecular weight by gel electrophoresis， which were then subject to ingel digestion and proteomics analysis by capillary liquid chromatographymass spectrometry. A total of 29 differentially expressed proteins were identified， among which 19 were upregulated proteins in tumor tissues， such as Fibrinogen beta chain， Vimentin， Fibrinogen gamma chain， Histone H2A type 1B/E， Isoform 1 of Periostin， Fibrinogen alpha chain， Histone H3.1， Alphaenolase， Protein disulfideisomerase A3， and so on. Ten proteins were found to be downregulated， including Sarcomeric tropomyosin kappa， Transgelin， Heat shock protein beta1， Talin1， Isoform 2 of Vinculin， Isoform 1 of FilaminC， and so on. The differential expressions of Talin1 and Alphaenolase were selected to be verified by Western blot analysis. Bioinformatics analysis results indicated that most of the upregulated proteins in colorectal cancer tissues had the feature of protein exocytosis， suggesting that these proteins were likely to penetrate into the circulatory system in the body， which could be detected in blood or ascites. On the other hand， most of the downregulated proteins belonged to the cytoskeleton and extracellular matrix fibers， which were closely related to the invasion and metastasis of tumor cells into their surrounding tissues. This study provided basic data for the early diagnosis of colorectal cancer， colorectal cancer screening and other aspects， which had important significance to further study the pathogenesis of colorectal cancer.

KeywordsGel electrophoresiscapillary liquid chromatographymass spectrometry； Colorectal cancer； Proteome； Talin 1； Enolase 1