呼吸道感染流感嗜血桿菌生物學分型及耐藥基因研究

周世娟++劉運香++林華杰++余進勝++徐潔玲

[摘要]目的 調查Hi的陽性率、生物學分型和耐藥情況。方法 2015年1月～2016年12月從惠東縣人民醫院門診及住院患者呼吸道標本中分離流感嗜血桿菌共200株，用法國梅里埃系統API NH進行鑒定確認生物型，并同時檢測β-內酰胺酶。采用K-B紙片擴散法對12種抗生素進行藥敏實驗。根據藥敏結果，對于有對β-內酰胺酶類抗生素產生耐藥性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型別，PCR檢測TEM-1和ROB-1基因。統計不同生物型的β-內酰胺酶、抗生素耐藥率、基因檢出率。結果 共檢出Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6種生物型，其中比例最高的是Ⅲ型，占38%；其次是Ⅱ型，占25%。Ⅴ型、Ⅷ型未見對12種抗生素耐藥。Ⅳ型對于抗生素的耐藥率最高，對于氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他定、氨曲南、阿奇霉素均產生耐藥。35.16%的菌株對氨芐西林等β-內酰胺類抗生素呈現耐藥性。34.04%菌株產生β-內酰胺酶，TEM-1陽性率為54.26%，ROB-1為6.38%。結論 惠東縣人民醫院收集的呼吸道感染流感嗜血桿菌的生物型有Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6種，以Ⅱ型、Ⅲ型為主，Ⅳ型亦占一定比例。Ⅴ型、Ⅷ型未見對12種抗生素耐藥。Ⅳ型對于抗生素的耐藥率最高。對氨芐西林等β-內酰胺類抗生素，耐藥機制以質粒介導的TEM產β-內酰胺酶型為主，少數為ROB-1介導。關注Hi致病生物型的流行情況，對于合理選擇抗生素具有重要意義。

[關鍵詞]流感嗜血桿菌；生物型；耐藥；基因

[中圖分類號] R378.4+1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（a）-0162-04

[Abstract]Objective To investigate the positive rate，the biological type and the drug resistance of Haemophilus influenzae.Methods 200 strains of Haemophilus influenzae were separated from outpatient and hospitalized patients of Huidong County People′s Hospital from January 2015 to December 2016.Biological types and beta lactamase were identified with API NH of France bioMerieux identification system.The drug sensitivity test of 12 antibiotics was performed by K-B disk diffusion method.According to the results of drug sensitivity，TEM-1 and ROB-1 gene of the strains of Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，and Ⅳ biotypes were detected by PCR.Results There were 6 biotypes，which were type Ⅰ-Ⅴ，and Ⅷ type.The highest proportion was type Ⅲ （38%） and type Ⅱ （25%）.Type Ⅴ，type Ⅷ was sensitive to 12 antibiotics.Type Ⅳ had the highest antibiotic resistance rate of Ampicillin，Cefuroxime，Ceftazidime，Aztreonam and Azithromycin.35.16% of the strains showed resistance to Ampicillin and other beta lactam antibiotics.34.04% strains produced beta lactam.The positive rate of TEM-1 gene was 54.26%，while the positive rate of ROB-1 gene was 6.38%.Conclusion There were 6 biological type of Haemophilus influenzae in Huidong County People′s Hospital.Type Ⅱ and type Ⅲ were the dominant biotypes，and Ⅳ type also shared a certain proportion.Type Ⅴ，type Ⅷ was sensitive to 12 antibiotics.The biological type which was highest resistance to antibiotics would be type Ⅳ.The production of beta lactamase is mainly mediated by TEM，and just a few strains mediated by ROB-1.To pay attention to the epidemic situation of Hi is of great significance for the selection of antibiotics.

[Keywords]Haemophilus influenza；Biological type；Drug resistance；Gene

作為呼吸道感染常見致病病原體的流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，Hi）對常見抗生素的耐藥率有增高趨勢，重視和加強Hi的流行病學調查及耐藥性監測工作，特別對于兒童和老年患者，對提高患者治愈率，控制Hi耐藥性具有非常重要的意義[1-2]。本研究調查惠東縣人民醫院Hi的陽性率及生物型分型，了解生物型與產β-內酰胺酶及耐藥基因的關系，分析生物型與常用抗生素的耐藥性的相關性，并統計耐藥基因的流行情況，有助于正確分析Hi的耐藥機制，合理選擇抗生素治療，提高臨床效果，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

2015年1月～2016年12月從惠東縣人民醫院門診及住院患者呼吸道標本，包括痰液、咽拭子、肺部灌洗液分離獲得的Hi共200株（剔除來自同一患者相同部位的分離菌株）。

1.2 Hi鑒定及生物型分型

根據全國臨床檢驗操作規程，將合格送檢標本分別接種于哥倫比亞血平板及含有萬古霉素的巧克力平板（梅里埃嗜血桿菌巧克力平板）上，孵育條件：37℃，5%CO2，18～24 h。然后從中挑取無色、透明、濕潤小菌落，在血瓊脂平皿（廣州市迪景微生物科技有限公司）和營養瓊脂平皿（鄭州博賽生物技術股份有限公司）上用ATCC25923（金黃色葡萄球菌）進行衛星試驗，在血瓊脂平皿上生長而在營養瓊脂上無菌落生長者，初步鑒定為Hi。再用法國梅里埃系統API NH進行鑒定確認（根據API NH中脲酶發酵、吲哚試驗和鳥氨酸脫羧酶發酵三個生化反應進行Hi生物分型），并同時檢測β-內酰胺酶（梅里埃β-內酰胺酶快速檢測試劑盒）。

1.3 藥敏試驗

采用K-B紙片擴散法，按2014年美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）標準取0.5麥氏單位Hi菌懸液涂布于Hi專用藥敏培養基HTM（Hemophilustestmedium，美國OXOD公司），貼上抗生素紙片，5%CO2、35～37℃培養18～24 h后測量抑菌圈直徑并判讀結果?？股丶埰ū本┨靿幬镉邢薰荆┌ò逼S西林（10 μg/片）、頭孢呋辛（30 μg/片）、頭孢他定（30 μg/片）、頭孢曲松（30 μg/片）、頭孢吡肟（30 μg/片）、氨曲南（30 μg/片）、亞胺培南（10 μg/片）、美諾培南（10 μg/片）、環丙沙星（5 μg/片）、左氧沙星（5 μg/片）、阿齊霉素（15 μg/片）、氨芐西林/舒巴坦（10/10 μg/片）等。用Hi質控株ATCC49766（氨芐西林敏感株）、ATCC49247（產β-內酰胺酶陰性、氨芐西林耐藥株）用上述藥敏紙片對HTM培養基進行質控。應用軟件WHONET 5.6進行抗生素敏感性分析，統計中介率、耐藥率和多重耐藥的情況。

1.4耐藥基因檢測

根據藥敏結果，對于有對β-內酰胺酶類抗生素產生耐藥性的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型別進行相應的耐藥基因檢測。參考文獻[3]和NCBI數據庫中的耐藥基因TEM-1、ROB-1序列，合成引物（上海英濰捷基公司），引物序列如下：

TEM-1上游引物5′-ATCAGTTGGGTGCACGAG TG-3′，下游引物5′-CGCTCGTCGTTTGGTATGG-3′；ROB-1上游引物5′-ACCCATACCAATCGGCTAGA-3′，下游引物5′-TGGCGTCTTCGGTAAATTGC-3′。

根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書[天根生化科技（北京）有限公司]提取流感嗜血桿菌 DNA。PCR檢測耐藥基因（寶生物公司TaKaRa Ex Taq試劑盒，反應體系參照說明書），反應條件為98℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 Cycles（LC480 PCR儀產自美國Phoenix 100公司）。用已知產TEM和ROB基因的大腸桿菌作陽性對照；無菌去離子水作陰性對照。

2結果

2.1 Hi的生物分型結果

本研究Hi樣本一共檢出6種生物型，分別是Ⅰ～Ⅴ型以及Ⅷ型。其中比例最高的是Ⅲ型，占38%；其次是Ⅱ型，占25%；Ⅴ型和Ⅷ型檢出率較低（表1）。

2.2 Hi對12種抗生素的藥敏實驗結果

對于收集的200株Hi進行抗生素敏感性分析，結果顯示，耐藥率最高的前三種抗生素分別是氨芐西林（35.16%）、阿奇霉素（20.22%）、頭孢呋辛（17.58%）。個別菌株檢出頭孢他定、氨曲南、左氧沙星耐藥。對于頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、美諾培南、氨芐西林/舒巴坦，所有菌株均敏感（表2）。

2.3 Hi不同生物分型的12種抗生素敏感性分析

進一步對檢出的6種生物型Hi的藥敏結果進行分析。Ⅴ、Ⅷ型Hi均未發現對該12種抗生素耐藥的菌株。Ⅳ型Hi的氨芐西林耐藥率相對較高，占該生物型菌株的87.00%，其次還有Ⅱ、Ⅲ型，均高于50%。Ⅱ型Hi的頭孢呋辛耐藥率相對較高，占該生物型菌株的45.45%，其他生物型均低于10.00%。Ⅱ型、Ⅳ型檢出頭孢他定耐藥菌株，占比分別是25.00%、22.22%。Ⅳ型Hi的氨曲南耐藥菌株占該生物型菌株的20.00%，Ⅲ型菌株則有7.14%檢出耐藥。Ⅳ型Hi的阿奇霉素耐藥率相對較高，占該生物型菌株的50.00%，其次為Ⅲ型（30.00%），Ⅱ型（18.18%）（表3）。

2.4 Hi不同生物型的耐藥基因和β-內酰胺酶檢測結果

對于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型Hi共188株，PCR檢測耐藥基因TEM-1和ROB-1，結合β-內酰胺酶檢測結果進行分析。結果顯示，4種生物型均檢出TEM-1、ROB-1基因，Ⅰ型Hi未檢出β-內酰胺酶（表4）。

3討論

Hi的生物型引起的疾病有所差異，例如Ⅰ型主要致兒童腦膜炎，Ⅱ型、Ⅲ型主要引起上呼吸道感染和肺炎，健康兒童口咽部Hi則以Ⅶ、Ⅷ型占優勢。湖南新邵地區檢出Ⅰ到Ⅲ、Ⅴ到Ⅷ型7種生物型，以Ⅱ、Ⅲ型為主[3]；蘇州地區兒童、山東青島地區的研究結果亦是以Ⅱ、Ⅲ型為主[4-5]。本研究中，占優勢的Hi生物型也是Ⅱ、Ⅲ型，與上述研究一致。武漢地區的調查未分離到Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅷ型，分離到的主要為生物型Ⅵ型，并認為該生物型主要引起肺炎和支氣管炎[6]；遼寧丹東地區兒童Hi則以生物型Ⅳ和Ⅵ占優勢[7]。本研究也分離了一定數量的Ⅵ型菌株。綜合本研究及國內外的數據顯示，各地流行的致病Hi生物型不盡相同[8-9]。

氨芐西林是Hi感染的首選治療藥物，但是，多項報道顯示，Hi對氨芐西林的耐藥性不斷上升[10]。在本研究中，氨芐西林的總體耐藥率為35.16%。不同生物型Hi對氨芐西林的耐藥程度不同，最高的為Ⅳ型（87.00%），Ⅱ、Ⅲ型均高于50.00%。對于第二代頭孢菌素頭孢呋辛，本地區也發現一定程度的耐藥菌株（17.58%），其中Ⅱ型耐藥率相對較高，占該生物型菌株的45.45%。第三代頭孢菌素——頭孢他定檢出少量耐藥菌株，集中在生物Ⅱ型（25.00%）、Ⅳ型（22.22%）。第三代頭孢菌素頭孢曲松和第四代頭孢菌素頭孢吡肟均未發現耐藥菌株，同時，上述抗生素無腎毒性，因此可作為難治性Hi治療的推薦藥物。在對于青霉素類和頭孢類過敏的患者中，還可使用單環β-內酰胺酶類抗生素，如氨曲南；碳青霉烯類抗生素，如亞胺培南、美諾培南等。本研究藥敏結果顯示，本院存在部分氨曲南耐藥菌株（6.33%），主要為Ⅳ型生物型；收集的菌株對碳青霉烯類抗生素均敏感。上述抗生素均為β-內酰胺酶類抗生素。對于非β-內酰胺酶類抗生素，筆者分析了大環內酯類抗生素阿奇霉素，發現了一定程度的耐藥（20.22%），其中Ⅳ型耐藥率較高（50.00%）；而喹諾酮類抗生素環丙沙星、左氧氟沙星均未發現耐藥。綜合比較各個生物型Hi的耐藥情況，Ⅳ型對于抗生素的耐藥率最高，對于氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他定、氨曲南、阿奇霉素均產生耐藥，提示生物Ⅳ型較易產生耐藥，臨床應予關注。

細菌對于β-內酰胺酶類抗生素耐藥的機制主要是通過產生β-內酰胺酶，水解抗生素的β-內酰胺環，從而使抗生素失活。Hi的β-內酰胺酶可由多種基因編碼，其中，由質粒介導的 TEM-1基因較為多見，此外，也有少數由ROB-1基因介導[11-12]。國內外數據顯示，β-內酰胺酶產生率為12.8%～38.0%[13-15]。本研究中，β-內酰胺酶整體的陽性率為34.04%，與前人報道一致，其中Ⅳ型β-內酰胺酶產生率最高（60.61%），這也與β-內酰胺類抗生素的藥敏實驗結果一致；其次是Ⅲ型（44.87%）。對于TEM-1、ROB-1耐藥基因檢測的結果，亦與β-內酰胺酶、藥敏實驗結果趨勢基本一致（陽性率：Ⅳ型>Ⅲ型>Ⅱ型>Ⅰ型）。同時，TEM-1耐藥基因檢出率（54.26%）比β-內酰胺酶高（34.04%），提示耐藥基因檢測的靈敏度高于檢測β-內酰胺酶。

綜上所述，呼吸道感染Hi的生物型有Ⅰ～Ⅴ型、Ⅷ型6種，以Ⅱ型、Ⅲ型為主，Ⅳ型亦占一定比例。Ⅴ、Ⅷ型未見對12種抗生素耐藥。Ⅳ型對于抗生素的耐藥率最高，對于氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢他定、氨曲南、阿奇霉素均產生耐藥。35.16%的菌株對氨芐西林等β-內酰胺類抗生素呈現耐藥性，耐藥機制以質粒介導的TEM-1產β-內酰胺酶型為主，少數為ROB-1介導。因此，關注Hi致病生物型的流行情況，正確分析Hi耐藥機制，對于合理選擇抗生素進行抗感染治療具有重要意義。

[參考文獻]

[1]王云橋，厲小玉，陳剛，等.兒童感染流感嗜血桿菌分離培養與耐藥性分析[J].中國當代醫藥，2013，20（32）：108-109.

[2]陳紫桃，易燕桃，李迪，等.小兒社區獲得性肺炎的致病菌分布及耐藥性分析[J].中國當代醫藥，2014，21（15）：107-109.

[3]隆豐厚，艾文衛，唐孝志，等.新邵地區成人呼吸道感染流感嗜血桿菌生物學分型及耐藥基因研究[J].實用預防醫學，2014，21（1）：35-38.

[4]江秀愛，趙自云，姜蓓，等.呼吸道嗜血桿菌屬的生物學分型及耐藥性分析[J].國際檢驗醫學雜志，2015，36（19）：2840-2841.

[5]王運中，季偉，陶云珍，等.兒童呼吸道感染流感嗜血桿菌的生物學分型及耐藥性[J].江蘇醫藥，2012，38（7）：777-779.

[6]田磊，張真，陳中舉，等.流感嗜血桿菌的分型研究[J].中國微生態學雜志，2014，26（3）：290-294.

[7]孫丹丹，劉曉華.兒童急性呼吸道感染流感嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏分析研究[J].中國醫藥指南，2014，12（14）：165-166.

[8]Chong L，Xia Y，Qian L，et al.Antibiotic resistance and molecular epidemiology of the beta-lactamase-producing Haem-ophilus influenzae isolated in Chongqing，China[J].APMIS，2012，120（11）：926-934.

[9]Takakura M，Fukuda Y，Nomura N，et al.Antibacterial susceptibility surveillance of Haemophilus influenzae isolated from pediatric patients in Gifu and Aichi prefectures （2009-2010）[J].Jpn J Antibiot，2012，65（5）：305-321.

[10]Resman F，Ristovski M，Forsgren A，et al.Increase of β-lactam-resistant invasive Haemophilus influenzae in Sweden，1997 to 2010[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56（8）：4408-4415.

[11]Kuvat N，Nazik H，Berkiten R，et al.TEM-1 and ROB-1 presence and antimicrobial resistance in Haemophilus influenzae strains，Istanbul，Turkey[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，2015，46（2）：254-261.

[12]S■ndergaard A，N■rskov-Lauritsen N.Contribution of PBP3 substitutions and TEM-1，TEM-15，and ROB-1 Beta-lactamases to Cefotaxime resistance in Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae[J].Microb Drug Resist，2015，22（4）：247-252.

[13]S■ndergaard A，Lund M，N■rskov-Lauritsen N.TEM-1-encoding small plasmids impose dissimilar fitness costs on Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae [J].Microbiology，2015，161（12）：2310-2315.

[14]Baturin VA，Shchetinin EV，Malykhin FT.Regional specifics of microbial landscape in outpatients with lower respiratory tract infections[J].Int J Risk Saf Med，2015，27：S61-S62.

[15]Giufrè M，Daprai L，Cardines R，et al.Carriage of Haemophilus influenzae in the oropharynx of young children and molecular epidemiology of the isolates after fifteen years of H.influenzae type b vaccination in Italy[J].Vaccine，2015，33（46）：6227-6234.

（收稿日期：2016-12-27 本文編輯：方菊花）