烏腺金絲桃醇溶物對二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件及抑菌效果

胡竣航，李臣軍，常桂英 (吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

烏腺金絲桃醇溶物對二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件及抑菌效果

胡竣航，李臣軍，常桂英
(吉林農業科技學院生物工程學院，吉林 吉林 132101)

為了進一步研究烏腺金絲桃(Hypericumattenuatum)的藥理活性機理，為開發利用長白山特色資源提供依據，探討了烏腺金絲桃醇溶物對二氫葉酸還原酶(DHFR)抑制的最佳條件。通過建立DHFR酶反應體系，采用分光光度法測定酶活力，分別研究了烏腺金絲桃的根、莖、葉、花的醇溶物對二氫葉酸還原酶的抑制作用。結果表明：4種醇溶物對二氫葉酸還原酶有不同程度的抑制作用，其中花的醇溶物抑制作用最為明顯，抑制率為30%，最佳作用溫度為40℃，最佳作用pH為7.5，添加的最適二氫葉酸底物濃度為20μL 1×10-4mol/L，最佳NADPH濃度為20μL 1×10-3mol/L，最佳巰基乙醇濃度為50μL 0.01mol/L，最佳酶用量為10μL。

烏腺金絲桃(Hypericumattenuatum)；二氫葉酸還原酶；反應體系；酶抑制的最佳條件

全世界共有400余種金絲桃屬(HypericumLinn)植物,我國有55種。金絲桃屬植物在我國東北地區分布較少,作為藥用植物的僅有2種，即長柱金絲桃[HypericumlongistylumOliv]和烏腺金絲桃[Hypericumattenuatum][1]。金絲桃屬植物的化學成分研究結果表明，該屬植物主要含有二蒽酮類、黃酮類、間苯三酚類和芳香酸類化合物等化學成分，具有抗菌消炎、收斂止血，以及治療黃疸、肝炎及瘡癤腫毒的作用,對心律失常、心肌缺血、心衰和增強免疫力具有較好的功效，同時還具有抗抑郁、抗腫瘤及抗病毒等活性[2]。

二氫葉酸還原酶(DHFR)可以將體內的二氫葉酸(FH2)還原為四氫葉酸(FH4),從而調節四氫葉酸的再生[3]。四氫葉酸是體內一碳單位轉移酶系統中的輔酶，是由葉酸在維生素C和 NADH+存在下，經葉酸還原酶作用下生成二氫葉酸，然后由二氫葉酸還原酶催化生成四氫葉酸。四氫葉酸可傳遞一碳單位，參與嘌呤和嘧啶的合成，是 DNA合成所必須的，對正常血細胞的生成具有促進作用[4]。所以當葉酸缺乏或某些藥物抑制葉酸還原酶，使葉酸不能轉變為四氫葉酸，都可能影響血細胞的發育和成熟。同時，DHFR 的異常表達也是一些腫瘤發生、發展的原因?？刂扑臍淙~酸的生成，成為治療癌癥藥物的主要研究方向，二氫葉酸還原酶便成為抗癌藥物的主要靶酶[5]。

目前已知抗腫瘤藥物如氨甲蝶呤等均為DHFR抑制劑，但這些化學藥物毒副作用極強。因而尋找和開發天然植物DHFR抑制劑成為抗腫瘤藥物研究的重要方向[6]。烏腺金絲桃醇溶物具用明顯的抗病毒、抗腫瘤活性，但從目前的研究現狀來看，烏腺金絲桃主要化學成分作用機理的研究涉及的比較少，對代謝關鍵酶的研究還沒見報道,探討其對DHFR酶活力的影響將會對開發利用烏腺金絲桃植物資源起到積極的促進作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烏腺金絲桃全草采自吉林農業科技學院烏腺金絲桃基地。巰基乙醇、磷酸鉀緩沖液等生化試劑由吉林農業科技學院生物技術實驗室提供。二氫葉酸和二氫葉酸還原酶為美國sigma公司產品，分析純級。

1.2 試驗儀器

搖擺式高速萬能粉碎機DFY-500：江蘇省江陰市萬達藥化機械有限公司產品；旋轉蒸發儀EYELA和冷凍干燥機、真空冷凍抽濾機：日本東京理化公司產品；μ2700紫外可見分光光度計:日本島津公司產品。

1.3 試驗方法1.3.1 醇溶物的提取

采摘烏腺金絲桃全草，洗凈，將其根、莖、葉、花分開，干燥后用藥材量的20倍的80%乙醇浸提12h，收集醇溶液，使用旋轉蒸發儀提取浸膏，冷凍干燥機干燥，再用真空冷凍抽濾機得到干燥的結晶物，置于-40℃下儲存，備用。

1.3.2 DHFR反應體系的建立

用分光光度法測定DHFR酶活力,酶活力以測定NADPH特征性的340nm波長下光密度值下降速度來表示。

DHFR反應體系：于4mL比色皿中依次加入50μL二次蒸餾水，100L 50mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH7.5)，50μL 0.01mol/L巰基乙醇，10μL 1×10-3mol/LNADPH溶液，20μL 1×10-4mol/L二氫葉酸，最后加10μL DHFR?？焖倩靹蚝蠓謩e在0、3、6、9、12、15、18min時測定340nm波長下的光密度值，建立底物與酶活力關系曲線。

酶活力定義為：每3min減少0.010個光密度為1個活力單位。

1.3.3 醇提物對DHFR酶活力的最小抑制濃度及最佳抑制條件試驗

1)最小抑制濃度 準確稱量烏腺金絲桃干燥結晶醇提物，配置成10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-4、10-5、10-7mg/mL的溶液，分別加入反應體系，測定DHFR酶活力，確定醇提物對DHFR酶活力的最小抑制濃度。

2)最適溫度 在DHFR反應體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，在25、30、35、37、40、45、50℃下測DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的溫度為最適溫度。

3)最適pH 在DHFR反應體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇酶最適溫度，在4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0 pH下測DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的pH為最適pH。

4)最適二氫葉酸濃度 在DHFR反應體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為5、10、15、20、25μL 1×10-4mol/L二氫葉酸，測DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的底物濃度為最適底物濃度。

5)最適NADPH濃度 在DHFR反應體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為5、10、15、20μL 1×10-3mol/L NADPH，測DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的NADPH濃度為最適底物濃度。

6)最適巰基乙醇濃度 在DHFR反應體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為20、30、50、70μL 0.01mol/L巰基乙醇，測DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的巰基乙醇濃度為最適添加濃度。

7)最適酶用量 在DHFR反應體系中加入最小抑制濃度的烏腺金絲桃醇提物，選擇最佳溫度、pH，加入濃度分別為5、10、15、20μL DHFR，測DHFR酶活力變化，選擇酶活力降低最大的NADPH濃度為最適酶濃度。

8)正交試驗 在上述7個試驗結果后，設計7因素2水平正交試驗(表1)，篩選最小抑制濃度、溫度、pH、二氫葉酸濃度、NADPH濃度、巰基乙醇濃度、酶濃度等的最優組合。

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表1 正交試驗因素水平表

1.3.4 抑菌試驗

1)供試菌液的制備 LB培養基的配置與滅菌→細菌的活化(37℃下24h)→ 配置菌懸液備用。

2)濾紙片法抑菌效果測定 制備4種濃度分別為2、4、6、8mg/mL烏腺金絲桃醇溶物。采用濾紙片法，將直徑為10mm的濾紙片滅菌后，分別浸泡于各濃度胞外粗提物溶液中2h,分別吸取0.4mL各供試菌懸液涂布于培養皿上，并且以無菌生理鹽水組作對照。每個處理3個重復，置于37℃培養24h，測量各供試菌在不同濃度下的抑菌圈大小。

1.3.5 數據分析

采用SPSS 16.0對正交試驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 底物與酶活力關系曲線

利用紫外-可見分光光度計測得反應進程中NADPH在340nm處光密度的變化值，得到酶活力變化曲線(圖1)。

圖1 酶活力變化曲線

2.2 醇提物對DHFR酶活力的最小抑制濃度

醇提物對DHFR酶活力的最小抑制濃度試驗結果如圖2所示。由圖2可知，烏腺金絲桃4個不同器官的醇提物均表現抑制作用，其中花的抑制作用最好，花、葉、莖和根的抑制率分別為30%、26%、16%和15%，這與其主要有效成分在全草中的分布狀況有關[7]。在受試濃度下，濃度越大，抑制效果越明顯，選擇10mg/mL為最佳抑制濃度，。

圖2 醇提物對DHFR酶活力的最小抑制濃度

2.3 溫度對DHFR酶活力的影響

不同溫度下的DHFR酶活力測定結果如圖3所示。溫度變化主要是對酶的活性影響，過高過低的反應溫度都會使酶活力下降，由圖3可知，反應體系中酶的最佳活性溫度為40℃左右。

圖3 不同溫度下的DHFR酶活力

2.4 pH對DHFR酶活力的影響

不同pH下的酶活力測定結果如圖4所示。pH對酶反應體系的影響也是對酶活性的影響，過酸或過堿會使酶活力下降，由圖4可知，反應體系中酶的最佳pH為7.5。

圖4 不同pH下的DHFR酶活力

2.5 二氫葉酸濃度、NADPH濃度、巰基乙醇濃度以及二氫葉酸還原酶濃度對DHFR酶活力的影響

在不同二氫葉酸濃度、不同NADPH濃度、不同巰基乙醇濃度以及不同二氫葉酸還原酶濃度條件下的酶活力測定結果分別如圖5～8所示。由圖5～8可知，其最佳條件分別為：1×10-4mol/L的二氫葉酸加入量為20μL，1×10-3mol/L 的NADPH加入量為20μL，0.01mol/L的巰基乙醇加入量為50μL，酶的加入量為10μL。這與安會梅的研究結果相吻合[8]。

圖5 不同濃度二氫葉酸下的DHFR酶活力

圖6 不同濃度NADPH下的DHFR酶活力

圖7 不同濃度巰基乙醇下的DHFR酶活力

圖8 不同酶濃度下的DHFR酶活力

2.6 醇提物對二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件

正交試驗結果見表2。由表2可知：影響DHFR酶活力大小的因素由大到小依次為溫度、最小抑制濃度、DHFR的加入量、巰基乙醇的加入量、二氫葉酸的加入量、pH、NADPH的加入量。由極差分析可知，B因素(溫度)對DHFR的活性影響最大，E因素(NADPH的加入量)的影響最小。由此可知：10mg/mL為醇提物的最佳抑制濃度，其中花的抑制作用最為明顯，抑制率為30%。

表2 正交試驗結果

2.7 烏腺金絲桃醇溶物的抑菌作用

抑菌試驗結果表明，烏腺金絲桃醇溶物的濃度越高，抑菌圈直徑越大，胞外粗提物的濃度與抑菌效果呈正相關關系；同時，沙門氏菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑比較長，而四聯球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌的抑菌圈直徑相對較短(表3)。其原因可能是：革蘭氏陽性菌能產生外毒素，在菌體開始生長的階段，代謝旺盛，細胞增殖快，外毒素含量高，對烏腺金絲桃醇提物的活性破壞作用強，產生的抑菌效果不明顯；革蘭氏陰性菌能產生內毒素，在菌體生長階段，代謝旺盛，細胞增殖快，也有少量衰亡、死亡的細胞會釋放的內毒素，但其含量低，對烏腺金絲桃醇溶物的活性破壞作用弱，產生的抑菌效果明顯。

表3 烏腺金絲桃醇溶物對各供試菌的抑菌效果

3 結論

本研究結果表明，烏腺金絲桃4個不同器官的醇提物對DHFR均表現抑制作用，其中花的抑制作用最強，花、葉、莖和根的抑制率分別為30%、26%、16%和15%。通過建立DHFR反應體系測定酶活力，結果表明：DHFR的最佳活性溫度為40℃左右；最適pH為7.5；1×10-4mol/L的二氫葉酸最適加入量為20μL；1×10-3mol/L 的NADPH最適加入量為20μL； 1×10-2mol/L的巰基乙醇最適加入量為50μL；酶的最適加入量為10μL。抑菌試驗結果表明：烏腺金絲桃醇溶物對細菌有抑制作用，并與醇溶物濃度成正相關，尤其對革蘭氏陰性菌作用明顯。

本研究結果表明烏腺金絲桃的醇溶物對二氫葉酸還原酶有一定的抑制作用，其結果可為以后提取工藝的優化、反應體系的優化、主要有效成分的提純、抗腫瘤新藥物的開發提供依據。

[1]張喜.烏腺金絲桃中金絲桃素的含量測定及提取純化金絲桃素的工藝研究[D].長春:吉林大學，2011.

[2]王玲，索朗斯珠，馬俊英，等.金絲桃素的提取分離及其藥理活性研究現狀[J].動物醫學進展，2005，26(5):32～35.

[3]楊靜.二氫葉酸還原酶(DHFR)與SμFμ相互作用調節Hedgehog信號通路[D].南昌：南昌大學，2013.

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[7]邢桂珍.金絲桃素的提取與化學合成工藝的研究[D].蘭州：中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，2007.

[8]安會梅.熒光光度法二氫葉酸還原酶抑制劑篩選模型的建立和應用[D].北京：首都師范大學，2006.

[編輯] 余文斌

2016-05-29

吉林省大學生創新資助項目(2015[040]);長白山重點實驗室項目(2014[s003])。

胡竣航(1994-)，男，現從事生物化學與生物工程研究。通信作者：常桂英，cgy650607@126.com。

Q949.758.5

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1673-1409(2017)02-0036-06

[引著格式]胡竣航，李臣軍，常桂英.烏腺金絲桃醇溶物對二氫葉酸還原酶抑制的最佳條件及抑菌效果[J].長江大學學報(自科版)，2017，14(2)：36～41,45.