發酵溫度與pH兩段式組合策略對α-溶血性鏈球菌生物量和甘露聚糖肽的影響

許翠 (廣州萬孚生物科技有限公司，廣東 廣州 510530)

楊曉茹，夏帆 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

徐洪宣，董平 (湖北欣愷生物科技有限公司，湖北 荊州 434020)

高夢祥 (長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

發酵溫度與pH兩段式組合策略對α-溶血性鏈球菌生物量和甘露聚糖肽的影響

許翠
(廣州萬孚生物科技有限公司，廣東 廣州 510530)

楊曉茹，夏帆
(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

徐洪宣，董平
(湖北欣愷生物科技有限公司，湖北 荊州 434020)

高夢祥
(長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025)

溫度和pH是影響微生物生長代謝的重要因素。以α-溶血性鏈球菌(α-hemolyticStreptococci)為發酵菌種，在5L發酵罐中，采用調整發酵溫度與pH兩段式組合策略，即0～8h控制pH 7.5，8h后將pH調至7.0；0～11h控制溫度37℃，11h后將溫度調至33℃，以探討發酵溫度與pH兩段式組合策略對α-溶血性鏈球菌生長及甘露聚糖肽產量的影響。結果表明:采用這一策略，α-溶血性鏈球菌最大生物量為15.344g/L，比恒定發酵溫度37℃和pH 7.5控制模式下提高了11.2%，比單獨調控發酵溫度條件下提高了33.8%；甘露聚糖肽的最大產量為1.305g/L，比發酵溫度恒37℃和恒pH 7.5控制模式下提高了35.9%，比單獨調控發酵溫度條件下提高了17.2%。

α-溶血性鏈球菌(α-hemolyticStreptococci)；甘露聚糖肽；發酵溫度；發酵pH；組合策略

發酵溫度和pH是影響微生物繁殖和代謝最重要的2個因素，主要包括對其生物活性的影響、微生物細胞吸收營養物質能力的改變以及改變環境中營養物質的可給性及有害物質的毒性[1]。不同微生物只能在一定的溫度和pH范圍內生長和代謝[2]。分階段控制溫度和pH能很好地增強微生物發酵效率，使目標代謝產物增加[1，2]。

α-溶血性鏈球菌(α-hemolyticStreptococcus)又稱甲型溶血性鏈球菌，它一方面能導致人體引發多種疾病，而另一方面，它經深層發酵培養提煉精制可得到的一種具有多種生物活性的糖肽類物質——甘露聚糖肽。甘露聚糖肽是我國獨立研制的具有自主知識產權的新型免疫增強劑[2，3]。臨床證明，甘露聚糖肽作為治療腫瘤的輔助藥，能減輕放療、化療的毒副作用[4]，對再生障礙性貧血、血細胞減少癥[5]、感染過敏性關節炎[6]、多種口腔粘膜病[7]等非腫瘤疾患均有較好的療效；還可用于治療各種腫瘤，與化療、放療聯合治療肺癌、胃癌、腸癌、食道癌、乳腺癌、白血病等。同時，甘露聚糖肽還可以最大限度地激活畜禽機體免疫細胞和免疫器官，充分發揮機體免疫系統抗病機能，增強動物對各種環境的應激機能，在提高生產性能的同時，還可有效降低抗生素使用頻率和劑量，減輕畜產品中獸藥殘留量，增強畜產食品安全性，對保證人類健康，環境保護和畜牧業可持續發展都具有重要的意義[8]。

然而，目前α-溶血性鏈球菌經深層發酵產生甘露聚糖肽的產率只有萬分之六，提高產率成為該領域的當務之急。目前通過優化其培養基和發酵條件提高甘露聚糖肽產率的報道很有限[3，9]。利用發酵罐研究提高甘露聚糖肽產率的發酵組合控制策略鮮有報道。本研究在α-溶血性鏈球菌的發酵過程中，利用調控發酵溫度和pH，研究了兩階段組合發酵策略對該菌生長及甘露聚糖肽產量的影響，旨在找到高產甘露聚糖肽的最優條件，為甘露聚糖肽的大量生產提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

菌種:α-溶血性鏈球菌由長江大學生命科學學院微生物實驗室提供。

主要設備:Biotech-5BGG-7000A型自動發酵罐(上海保興生物設備工程有限公司產品)；HVE-50型高壓蒸汽滅菌器(華粵企業集團有限公司產品)；HFsafe-1200型生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司產品)；TE124S型電子分析天平、PB-10型酸度計(均為賽多利斯科學儀器(北京)有限公司產品)；HYC-360型醫用冷藏箱(青島海爾特種電器有限公司產品)；THZ-312型臺式恒溫振蕩器(上海精宏實驗設備有限公司產品)；UV-3300PC型紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司產品)；TL-18M型臺式告訴冷凍離心機(上海市離心機械研究所產品)。

無菌生理鹽水:稱取0.9g氯化鈉溶解于100mL蒸餾水中，轉入250mL的錐形瓶加塞封口后于立式壓力蒸汽滅菌器中121℃滅菌25min。滅菌后低溫保藏備用。

0.1mol/L的NaOH溶液:稱取0.4gNaOH溶解于100mL蒸餾水中，封好瓶口，低溫保藏備用。

試管液體培養基:葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，pH 7.2。每支試管裝量l0mL，121℃滅菌25min。

搖瓶種子培養基:葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母膏1.0%，牛肉膏0.5%，氯化鈉1.0%，pH 7.5。每瓶裝6mL，121℃滅菌25min。

發酵培養基:蛋白胨0.3%，酵母膏0.7%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%，pH 7.2。121℃滅菌25min。

1.2 菌種預處理

菌種活化:將血平板中的菌種于超凈工作臺上接入試管液體培養基中，在37℃下培養18～24h，經無菌考查和形態學鑒定合格后再接入試管液體培養基中，37℃培養18～24h，反復2次。挑選生長旺盛、活力強、形態特征等符合要求的菌種，將其在2～4℃冰箱中保存。

搖瓶種子的制備:將試管液體菌種按0.2%的接種量在無菌條件下接入搖瓶培養基中，靜置37℃，培養24h，備用。

1.3 試驗方法

將長勢良好、無雜菌的搖瓶種子液按1%的接種量接入發酵培養基中，通過控制溫度、pH單因素變化及溫度、pH兩因素組合對菌種進行發酵培養。分別在發酵0、2、4、6、8、11、14、17、20、23、25、27、30、32h時測定生物量和代謝產物甘露聚糖肽的含量。

1)溫度兩階段轉換發酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發酵罐中進行發酵培養，控制溫度為37℃，pH為7.5，無菌空氣量以能翻動培養液為宜，轉速為150r/min培養。在發酵11h時調節溫度為33℃，pH保持7.5不變。

2)pH兩階段轉換發酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發酵罐中進行發酵培養，控制溫度為37℃，pH為7.5，無菌空氣量以能翻動培養液為宜，轉速為150r/min培養。在發酵8h時調節pH為7.0，溫度保持37℃不變。

3)溫度和pH兩因素組合發酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發酵罐中進行發酵培養，控制溫度為37℃，pH為7.5，無菌空氣量以能翻動培養液為宜，轉速為150r/min培養。在發酵8h時調節pH為7.0，溫度37℃不變；發酵11h時調節溫度為33℃，pH保持7.0不變。

4)恒溫與恒pH發酵 將搖瓶種子液按1%的接種量倒入發酵罐中進行發酵培養，控制溫度為37℃，pH為7.5，無菌空氣量以能翻動培養液為宜，轉速為150r/min培養。

1.4 試驗指標的測定方法1.4.1 菌體生物量的測定

生物量采用菌體干重法測定量。將各組發酵液取出后，在80℃的水浴鍋滅菌30min后，冷卻至室溫，并分裝在無菌離心管中，在8000r/min的轉速下離心15min，此為一次離心；再將上清液倒去，用蒸餾水洗滌沉淀2～3次，同樣轉速下經二次離心后，再次倒去上清液，洗滌后將沉淀即菌體放入105℃的烘箱中烘干至恒重，并用分析天平稱重并記錄數據，其與空管重量差值即為菌體干重。

1.4.2 甘露聚糖肽含量的測定

1)標準曲線的建立 精密稱取經105℃恒重的D-甘露糖10mg，置100mL容量瓶中，加水使溶解至刻度，搖勻得100μg/mL標準溶液。再分別精確量取標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置試管中，用水稀釋至2mL，各加3%苯酚溶液1.0mL，加入濃硫酸4.5mL，快速搖勻，待冷卻至適溫后在490nm波長處進行比色，測定其光密度，以光密度為橫坐標、甘露糖濃度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程。

2)發酵液中甘露聚糖肽含量的測定 精確量取20mL發酵液于離心管經離心機10000r/min、4℃離心10min，去除菌體留取上清液；上清液中加入3倍體積量的無水乙醇，充分攪拌靜置后10000r/min、4℃離心10min，去除上清液即得到沉淀物；將所得沉淀物用10mL蒸餾水溶解，用15%的三氯乙酸調pH為1.5～3.5，充分攪拌靜置后10000r/min、4℃離心10min，去除雜質即得到上清液；向去除雜質的上清液中緩慢加入40mL的無水乙醇，充分攪拌靜置后10000r/min、4℃離心10min去除上清液即得到沉淀物；重復上述方法2次，得到的沉淀物為粗糖肽；將所得沉淀物用10mL蒸餾水充分攪拌溶解稀釋。精確吸取不同時間離心后的糖液0.1mL，用無菌水稀釋至2mL，以無菌水作對照，各加3%苯酚溶液1.0mL，加入濃硫酸4.5mL，快速搖勻，待冷卻至適溫后在490nm處進行比色，測定光密度，由回歸方程計算甘露聚糖肽含量。

2 結果與分析

2.1 甘露聚糖肽標準曲線的確定

圖1 甘露聚糖標準曲線

以甘露聚糖肽在490nm處的甘露聚糖濃度為橫坐標，以光密度為縱坐標作圖，得到線性回歸方程:y=0.0794x+0.0026，R2=0.9998，表明其擬合效果很好，因此該標準曲線可用于甘露聚糖肽含量的確定。

2.2 兩段式發酵溫度與pH轉換對生物量的影響

由圖2可知，在發酵過程中轉換pH，α-溶血性鏈球菌的生物量上升先變慢后加快，在發酵過程中轉換溫度對菌種生長有明顯的抑制作用。兩階段pH轉換，發酵8h將pH 7.5轉換為7.0后，生物量在11h時開始加速增加，30h達到最大，為16.347g/L，至發酵結束仍無明顯衰退現象。兩階段溫度轉換，發酵11h后，菌體的生長受到了抑制，生物量增加明顯減緩，一直處于較低水平，為11.465g/L，比恒溫與恒pH對照組的最大生物量13.805g/L降低了2.340g/L。而溫度與pH兩段式組合策略極大地促進了菌體的生長，發酵8h轉換pH，生物量增加加快，在17h進入穩定期，在25h達到15.344g/L，比其他條件下的最大生物量平均多了1.472g/L，并且穩定期相比更長?？梢?，兩階段溫度轉換對α-溶血性鏈球菌的生長沒有促進作用，兩階段pH轉換和發酵8h轉換pH、11h轉換溫度的組合策略才能明顯地促進其生長。

圖2 不同調控條件下的菌體生物量

圖3 不同調控條件下的菌體比生長速率

圖4 不同調控條件下的甘露聚糖肽比合成速率

2.3 兩段式溫度與pH轉換對菌體比生長速率及甘露聚糖肽比合成速率的影響

圖3和圖4反映了通過對發酵過程中溫度和pH進行不同調控策略，對α-溶血性鏈球菌的比生長速率及代謝產物甘露聚糖肽的比合成速率的影響。

從圖3可以看出，在發酵過程的前8h，因發酵條件都是37℃和pH 7.5，所以前8h菌體的比生長速率的變化基本一致。8h后不同的轉換條件對菌體比生長速率有不同的影響。兩階段pH轉換和溫度與pH兩段式組合策略實驗中，發酵8h將pH 7.5轉換為7.0后，在8～20h菌體的比生長速率均高于其他條件下的。而兩階段溫度轉換試驗中，發酵11h將溫度37℃轉換為33℃后，對菌體的比生長速率無明顯影響，其與恒溫與恒pH對照條件下的比生長速率無明顯差異。所以，兩階段pH轉換和溫度與pH兩段式組合策略可以促進發酵過程中甲型溶血性鏈球菌的比生長速率，而兩階段溫度轉換對菌體的比生長速率無明顯影響。

從圖4可以看出，在發酵過程的前8h，因發酵條件一樣，都是37℃和pH 7.5，所以前8h比合成速率變化基本無差異。8h后，不同的轉換條件對甘露聚糖肽的影響不同。兩階段pH轉換實驗中，8h時轉換pH 7.5至7.0后，甘露聚糖肽的比合成速率與恒溫與恒pH組無明顯差異。兩階段溫度轉換實驗中，甘露聚糖肽的比合成速率在8～17h均高于相同時間段的其他條件下的比合成速率，在發酵14h時達到最大值0.170h-1。溫度與pH兩段式組合策略實驗中，甘露聚糖肽的比合成速率在發酵前期處于較低水平，在發酵中后期有所提高，在17～27h比合成速率維持在較高水平，20h時甘露聚糖肽的比合成速率為0.082h-1，其他條件下的同時段的甘露聚糖肽的比合成速率平均僅為0.034h-1。整體來說，兩段式pH轉換對甘露聚糖肽的比合成速率無明顯影響，兩段式溫度轉換在發酵中期會增加代謝產物甘露聚糖肽的比合成速率，溫度與pH兩段式組合策略在發酵后期能有效的提高代謝產物甘露聚糖肽的比合成速率。

2.4 兩段式溫度與pH轉換對甘露聚糖肽產量的影響

發酵溫度與pH單因素調整以及溫度與pH組合轉換策略對甘露聚糖肽產量的影響結果見圖5。從圖5可以看出，發酵8h轉換pH和發酵11h單獨轉換溫度甘露聚糖肽產量都有明顯的增加。兩階段pH轉換試驗中，發酵8h將pH 7.5轉換至7.0后，代謝產物甘露聚糖肽的產量增加加快，在8～25h維持在較高水平，到14h后產量增加減慢，25h達到最大合成量1.278g/L。兩階段溫度轉換實驗中，發酵11h將溫度37℃轉換為33℃后，甘露聚糖肽的產量增加同樣加快，在15～27h合成量處于較高水平，25h達到最大量1.114g/L。溫度與pH兩段式組合策略實驗中，在8h轉換pH，11h轉換溫度后，11～17h過程中沒有明顯變化，等到17h后，甘露聚糖肽產量增加速度不斷加快，27h時達到最大值，為1.305g/L，分別比恒溫與恒pH和兩階段溫度轉換條件下的甘露聚糖肽最大值分別增加了35.9%、17.2%，與兩階段pH轉換條件沒有統計差異。以上結果表明，單獨調整溫度或pH都可以有效地提高甘露聚糖肽的產生，而溫度與pH的兩段式組合策略能更大限度地提高甘露聚糖肽的產量。

圖5 不同調控條件下的甘露聚糖肽合成量

3 結論

采用發酵8h將pH 7.5轉換至7.0，11h將溫度37℃轉換為33℃的溫度和pH兩段式組合策略可以有效地促進α-溶血性鏈球菌的生長并提高其代謝產物甘露聚糖肽的產量。最大生物量比恒定發酵溫度37℃和pH 7.5控制模式下提高了11.2%，比單獨調控發酵溫度條件下提高了33.8%；甘露聚糖肽的最大產量比發酵溫度恒37℃和恒pH 7.5控制模式下提高了35.9%，比單獨調控發酵溫度條件下提高了17.2%。

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[編輯] 余文斌

2016-10-31

湖北省自然科學基金項目(2013CFB392)；湖北省重點產業創新團隊項目。

許翠(1988-)，女，碩士，研究方向為微生物代謝及分子生物學。通信作者:高夢祥，mxgao0398@163.com。

Q939.97

A

1673-1409(2017)02-0046-06

[引著格式]許翠,楊曉茹，夏帆,等.發酵溫度與pH兩段式組合策略對α-溶血性鏈球菌生物量和甘露聚糖肽的影響[J].長江大學學報(自科版)，2017，14(2)：46～51.