巴弗洛霉素A1對腦缺血再灌注損傷作用的初步研究

王志堅，劉勝兵，沈忠飛

（嘉興學院醫(yī)學院，浙江嘉興314000）

巴弗洛霉素A1對腦缺血再灌注損傷作用的初步研究

王志堅，劉勝兵，沈忠飛

（嘉興學院醫(yī)學院，浙江嘉興314000）

目的：探討預防性給予SD大鼠巴弗洛霉素A（Bafilomycin A1,Baf A1）對局部腦缺血再灌注損傷(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R），是否神經保護作用及初步機制研究.方法：健康雄性SD大鼠80只，隨機分為：假手術組（sham）、對照組（Saline）、氟西汀組（Fluo）和Baf A1組.Fluo組和Baf A1組大鼠于術前分別給予氟西汀混懸液(2.0mg-1kg-1d-1)灌胃和Baf A1(1.0mg-1kg-1d-1)，連續(xù)14d；sham組和Saline組均于術前14天開始給予等體積生理鹽水.再灌注24h后，進行神經神經功能相關檢測，并用TTC染色法計算腦梗死面積，并提取新鮮腦組織總蛋白采用Western blot檢測自噬相關蛋白Beclin 1的表達.結果：Baf A1可顯著降低大鼠腦缺血再灌注后神經功能損傷癥狀，減少腦梗死面積，并降低自噬相關蛋白Beclin 1的表達.結論：Baf A1對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，可能是通過降低自噬性死亡實現的.

Bafilomycin A1；腦缺血再灌注損傷（MCAO/R）；自噬；Beclin 1

腦缺血再灌注損傷是腦組織缺血后再次獲得血液供應時引發(fā)的繼發(fā)性神經結構和功能損傷，主要與氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等有關[1,2].而近期研究表明，在腦缺血、炎癥反應等應激狀態(tài)下，神經元內Beclin1、LC3-Ⅱ等自噬相關蛋白表達增加，自噬溶酶體途徑被激活且參與了腦缺血再灌注損傷[3].研究表明，Baf A1對神經功能損傷具有保護作用[4]，但其在腦缺血再灌注損傷中是否起到保護作用還未見報道，本實驗通過觀察Baf A1對腦缺血再灌注損傷的保護作用，通過檢測自噬相關蛋白Beclin 1的表達，探究其對自噬的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷中的作用機制.

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠，體重280-300g（浙江大學實驗動物中心提供）,隨機分為sham組、Saline組、Fluo組和Baf A1組，每組各20只.

1.2 大鼠腦缺血再灌注損傷模型制備

采用改良longa．Zea氏線栓法[5]制備大鼠MCA閉塞的腦缺血再灌注模型.大鼠以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，背位固定，備皮，消毒，行頸部正中切口，逐層分離組織，暴露左側頸內動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎CCA近端、ECA根部，于ICA處備線打一活結.在左側ICA近顱端夾一微動脈夾，CCA結扎處遠端剪一斜口，經此插入備好的線栓，并將其緩慢經ICA入顱至大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)以阻斷MCA的血流.結束后立即結扎并縫合皮下組織和皮膚，酒精消毒.再灌注24h處死動物.假手術組只分離、暴露血管，不結扎頸總動脈及頸外動脈，不插栓線，余同以上兩組.

1.3 神經功能評分及大鼠腦梗死面積檢測

采用改良Bederson評分法進行神經功能缺損評分[6].后快速斷頭取腦.把腦組織迅速放入-20℃冰箱冷凍，切成2mm的冠狀切片浸入1%TTC溶液，37℃水浴鍋30分鐘，拍照，正常組織呈鮮紅色，梗死組織為白色，計算出梗死體積占大腦體積的百分比.

1.4 Western blot檢測

收集大鼠損傷側海馬組織，提取組織總蛋白，進行SDS-PAGE電泳.條件為電壓80V跑30min后換110V 70min、凝膠濃度12%和5%.轉膜后于5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入抗Beclin 1(1:1000)一抗孵育過夜，，洗膜后加入辣根過氧化物標記的二抗(抗兔IgG，HRP，1：1000),顯影定影后用Image J分析蛋白相對表達量.

1.5 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次以上，數據采用GraphPad Prism5. 0處理.結果以均數±標準差（mean±SD）表示，各組間計量資料的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用SNK-q檢驗法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 神經功能評分

按照改良Bederson評分法，統(tǒng)計結果顯示（圖1）：再灌注24h后，Saline組評分較sham組顯著升高，提示腦缺血再灌注后神經功能明顯受損.而Fluo組與Baf A1組評分明顯低于Saline組，Fluo組與Baf A1組無明顯差異，提示BafA1明顯降低腦缺血再灌注后的神經功能損傷.

圖1 缺血再灌注24h后神經功能評分

2.2 腦梗死體積檢測

由圖2可知，sham組大鼠腦組織未形成明顯梗死灶；Saline組梗死體積明顯高于sham組，可見腦缺血再灌注后出現明顯的大腦梗死.而Fluo組與Baf A1組明顯低于Saline組，Fluo組與Baf A1組無明顯差異，因此，Baf A1作用后明顯降低大鼠缺血再灌注后的大腦梗死體積.

圖2 缺血再灌注24h后腦梗死體積比

2.3 自噬相關蛋白Beclin 1表達水平檢測

免疫印跡結果（圖3），Saline組海馬區(qū)Beclin 1表達與sham組相比明顯增加，而Fluo組與Baf A1組較Saline組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，Fluo組與Baf A1組無明顯差異.

圖3 缺血再灌注24h后自噬相關蛋白的表達

3 討論

Baf A1是一種來源于灰色鏈霉素的大環(huán)內酯類抗生素，常通過抑制H+-ATP酶質子泵抑制后期自噬[7]，并抑制腫瘤細胞生長和增殖[8].研究表明，Baf A1對神經功能損傷具有保護作用，但其在腦缺血再灌注損傷中是否起到保護作用還未見報道.

本實驗通過預防性的應用Baf A1觀測其對腦神經的保護作用，結果顯示，與Saline組相比，Baf A1組大鼠神經功能缺失顯著降低，表明Baf A1可明顯改善腦缺血再灌注損傷后大鼠的神經功能缺損，發(fā)揮保護神經的作用.同時，本實驗還采用了TTC染色法觀察梗死體積，與Saline組相比，Baf A1組腦缺血再灌注損傷的腦梗死體積明顯縮小，進一步表明Baf A1對腦缺血再灌注損傷具有保護作用.

目前關于腦缺血再灌注中的自噬調控作用和機制尚沒有一致的說法或解釋.有一部分學者認為，藥物作用激活細胞自噬可以緩解或者減少再灌注后腦的梗死體積，簡言之，激活細胞自噬可以對腦缺血再灌注產生保護作用[9].Beclin 1是自噬起始的關鍵調控基因之一，其表達的多少可以反映自噬水平的高低.我們發(fā)現，Baf A1預處理，自噬相關蛋白Beclin 1表達下調，說明Baf A1可能通過抑制前期和后期自噬對大腦功能發(fā)揮保護作用.

綜上，Baf A1可明顯減輕腦缺血再灌注損傷，保護大腦功能，通過抑制細胞自噬可能是作用機制之一，但是具體的作用機制還有待于進一步的研究.

〔1〕Woodruff TM,Thundyil J,Tang SC,et al.Pathophysiology,treatment,and animal and cellular models of human ischemic stroke.Mol Neurodegener.2011,6(1):11.

〔2〕Wang CX,Shuaib A.Involve of inflammatory cytokines in central nervous system injury.Prog Neurobiol.2002, 67(2):161172.

〔3〕Rami A,Langhagen A,Steiger S.Focal cerebral ischemia induces upregulation of Beclin1 and autophagylike cell death.Neurobiol Dis.2007;29:132-141.

〔4〕伏春艷，王志堅，沈忠飛，等.巴弗洛霉素A對抑郁大鼠行為及海馬腦源性神經營養(yǎng)因子的影響.四川大學學報（醫(yī)學版），2017（48）:50-53.

〔5〕LongaEZ，PR，CarlsonS．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy．in rats．Stroke，1989; 20：84-89

〔6〕Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986;17：472-476.

〔7〕Mauvezin C,Neufeld TP.Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusio.Autophagy.2015;11:1437-8.

〔8〕Yuan N,Song L,Zhang SP,Lin WW,Cao Y,Xu F,Fang YX,Wang Z,Zhang H,Li X,Wang ZJ,Cai JY,Wang J, Zhang Y,Mao XL,Zhao WL,Hu SY,Chen SN,Wang JR.Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica.2015;100:345-56.

〔9〕Zhao G,Zhang W,Li L Pinocembrin Protects the Brain against Ischemia-Reperfusion Injury and Reverses the Autophagy Dysfunction in the Penumbra Area. Molecules.2014,19(10):15786-98.

R651

：A

：1673-260X（2017）03-0042-02

2016-11-24

浙江省實驗動物科技計劃項目（2014C37019）；嘉興市科技局項目（2015AY23066）；嘉興學院校SRT計劃項目（SRT2016C097）

王志堅，女，漢，1987-07，碩士，嘉興學院實驗師，研究方向：腦缺血再灌注損傷