利培酮微生物限度檢查方法的建立

王玉華，沈 嵐，趙 靜，徐麗瑋

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺 264003）

利培酮微生物限度檢查方法的建立

王玉華1,2，沈 嵐1，趙 靜2，徐麗瑋2

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；2.山東綠葉制藥有限公司，山東 煙臺 264003）

目的：建立利培酮微生物限度檢查方法.方法：按照《中國藥典》2015年版四部1105《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》中常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法對利培酮進行處理，以5種試驗菌的回收率對檢驗方法的有效性進行驗證和確認(rèn).結(jié)果：采用常規(guī)方法對利培酮進行微生物限度檢查時，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌、白色念珠菌在3次平行試驗中的回收率均低于50%，其他3種試驗菌回收率都高于50%；培養(yǎng)基稀釋法(1∶10的樣品稀釋液，0.2mL/皿)對5種試驗菌的回收率均超過50%.結(jié)論：本文建立的培養(yǎng)基稀釋法可用于利培酮的微生物限度檢查.

利培酮；微生物限度檢查；驗證

利培酮(risperidone)是由比利時楊森制藥公司研制的一種新型抗精神病藥物.利培酮具有較好的療效和發(fā)生率很低的錐體外系不良反應(yīng)，是對精神分裂癥陽性和陰性癥狀均有效的藥物.在英國作為非典型抗精神病藥上市后，被廣泛應(yīng)用于臨床[1].

利培酮作為制劑生產(chǎn)的原料，根據(jù)其用途，應(yīng)進行需氧菌、真菌和酵母菌的測定[2].目前文獻資料中沒有有關(guān)利培酮微生物學(xué)限度檢測方法的報道，本文根據(jù)《中國藥典》2015年版四部中微生物限度檢查法的有關(guān)要求，對利培酮的需氧菌、真菌及酵母菌數(shù)的檢查方法進行方法學(xué)驗證，建立適合該藥品微生物限度檢查的方法，從而保證該藥品檢驗方法的科學(xué)性和準(zhǔn)確性，進一步保證其質(zhì)量[3-6].

微生物限度檢查一般采取常規(guī)法，具有抑菌性的品種抑菌性消除方法有中和法[7]、薄膜過濾法[8]、培養(yǎng)基稀釋法[9-11]等.根據(jù)利培酮的理化性質(zhì)[12]采取相應(yīng)的供試品溶液制備方法.

1 儀器、材料與試藥

1.1 儀器

BD720恒溫培養(yǎng)箱(Binder)，KB720低溫培養(yǎng)箱(Binder)，LMQ.C型壓力滅菌器 (新華醫(yī)療設(shè)備有限公司)，HR40-A2生物安全柜（ESCO），SW-CJ-2FD凈化工作臺（蘇州安泰空氣凈化有限公司）.

1.2 驗證用菌株

銅綠假單胞菌［ATCC9027］、金黃色葡萄球菌［ATCC 6358］、枯草芽孢桿菌［ATCC6633］、白色念珠菌［ATCC10231］、黑曲霉［ATCC16404］均由美國菌種保藏中心提供.

1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(批號:VM655058435)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (批號:VM657938441)、pH7.0NaCl-蛋白胨緩沖液(批號:VM625982406)均購自MERCK.

1.4 藥品

利培酮，浙江華海藥業(yè)股份有限公司（批號：5341-14-001M、5341-14-002M、5341-14-003M.）

2 實驗準(zhǔn)備

按照《中國藥典》2015版四部1105《非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法》進行.

2.1 供試品溶液的制備

取供試品10g，加入20ml二甲基亞砜，制成混懸液，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1:10的供試品溶液.

2.2 菌液制備

取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液；

取黑曲霉孢子懸液，用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的菌懸液.

3 細(xì)菌、霉菌和酵母菌檢查方法學(xué)驗證試驗

3.1 可接受標(biāo)準(zhǔn)

進行3次獨立的平行驗證，分別計算菌回收率，菌回收率應(yīng)在50%～200%范圍內(nèi).

3.2 試驗組

①常規(guī)法:取1:10供試品溶液1ml和菌液1ml注入平皿中，再注入培養(yǎng)基，混勻，每個菌株制備2個平皿.結(jié)果見表1.

②培養(yǎng)基稀釋法：取1:10供試品溶液0.2ml和菌液1ml注入平皿中，再注入培養(yǎng)基，混勻，每個菌株制備2個平皿.結(jié)果見表2.

需氧菌在30～35℃培養(yǎng)3天，霉菌和酵母菌在20～25℃培養(yǎng)5天，計數(shù)取平均值.

3.2 菌液組

測定試驗菌液每毫升中含有的菌落數(shù).

3.3 供試品對照組

按試驗組的方法，不加菌液，測定供試品本底菌數(shù).

3.4 稀釋劑對照組

按照供試品溶液制備方法，不加入供試品，取稀釋液與菌液混合液，分別計數(shù)，測定菌落數(shù)，結(jié)果見表1.

3.5 回收率計算

試驗組菌回收率=(試驗組平均菌落數(shù)－供試品對照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%；

稀釋劑組菌回收率=稀釋劑對照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%.

表1 常規(guī)法-各菌回收率(1mL/皿)

表2 培養(yǎng)基稀釋法-各菌的回收率(0.2mL/皿)

4 結(jié)果與討論

4.1 常規(guī)注皿法（1ml/皿）驗證結(jié)果

按照常規(guī)注皿法對3批次樣品進行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)驗證，結(jié)果見表1常規(guī)法-各菌回收率(1mL/皿)，驗證結(jié)果表明稀釋劑回收率均在50%以上，說明稀釋劑二甲基亞砜對實驗過程沒有影響，可以用于樣品制備；試驗組菌回收率中，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均在69～145%范圍內(nèi)，說明供試品對這三種菌沒有抑菌性，枯草芽孢桿菌和白色念珠菌菌回收率低于50%，供試品對這兩種菌有抑菌性.采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）對枯草芽孢桿菌和白色念珠菌進行再驗證.

4.2 培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）驗證結(jié)果

按照培養(yǎng)基稀釋法對三批次樣品進行重新驗證，兩種菌的回收率結(jié)果見表2培養(yǎng)基稀釋法-各菌的回收率(0.2mL/皿)，表明采用培養(yǎng)基稀釋法(0.2ml/皿) 檢查時，通過降低每個皿中藥物濃度，而降低供試品的抑菌作用，使枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的回收率均超過50%.驗證結(jié)果表明，采用培養(yǎng)基稀釋法可對利培酮的細(xì)菌、真菌及酵母菌進行限度檢查.

5 結(jié)論

本品按照2015年版《中國藥典》四部的要求進行驗證，研究結(jié)果表明采用培養(yǎng)基稀釋法可以有效的消除供試品的抑菌效果，5種試驗菌的回收率均大于50%.

·利培酮微生物檢驗樣品制備方法

取供試品10g，加入20ml二甲基亞砜，制成混懸液，加pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，作為1:10的供試品溶液.

·細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法

取1:10供試液1ml等量分注于5個平皿中，每個平皿0.2ml，注入培養(yǎng)基混勻，培養(yǎng)計數(shù).

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