鹽藻蛋白酶體亞基PSMD7在鞭毛解聚后的表達(dá)分析

石科 梁瑞峰 楊亮

（1. 河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，鄭州 451191；2. 鄭州大學(xué)細(xì)胞生物研究室，鄭州450008；3. 河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004）

鹽藻蛋白酶體亞基PSMD7在鞭毛解聚后的表達(dá)分析

石科1，2梁瑞峰3楊亮1

（1. 河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，鄭州 451191；2. 鄭州大學(xué)細(xì)胞生物研究室，鄭州450008；3. 河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州 450004）

為了研究鹽藻19S蛋白酶體亞基PSMD7和鞭毛解聚的關(guān)系，用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）誘導(dǎo)鹽藻鞭毛解聚，實(shí)時熒光定量PCR檢測PSMD7在鞭毛解聚后的mRNA表達(dá)變化。同時通過原核表達(dá)和蛋白純化得到高純度的鹽藻PSMD7蛋白，制備鹽藻PSMD7的山羊多克隆抗體，Western blot檢測PSMD7蛋白在鞭毛解聚后的表達(dá)情況。結(jié)果顯示IBMX誘導(dǎo)鞭毛解聚后PSMD7的mRNA表達(dá)水平增高，其中在鞭毛解聚后30 min達(dá)到最大值。成功制備了鹽藻PSMD7的山羊多克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示PSMD7蛋白在鞭毛解聚后表達(dá)增加，說明蛋白酶體亞基PSMD7參與鹽藻鞭毛的解聚。

PSMD7；蛋白酶體；鞭毛解聚

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）通過選擇性降解目標(biāo)底物來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)許多蛋白的穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)參與維持蛋白平衡和細(xì)胞活性，參與細(xì)胞周期的調(diào)控、凋亡、信號傳導(dǎo)及病毒感染等［1，2］。UPS是一個由多個亞基組成的降解復(fù)合體，由泛素結(jié)合體系和26S蛋白酶體兩部分組成，底物蛋白的泛素化是被蛋白酶體降解的一個標(biāo)志［3］。26S蛋白酶體由一個20S核心顆粒（core particle，CP）和兩個19S調(diào)節(jié)顆粒（regulatory particle，RP）構(gòu)成，可將泛素標(biāo)記的蛋白水解成小的肽段。20S CP中含有蛋白水解活性位點(diǎn)，是蛋白酶體的降解部位，19S RP作為多泛素化蛋白的受體位于20S CP的兩端，具有篩選泛素化底物并使其進(jìn)入20S CP的作用［4］。

19S RP中有4個去泛素化酶亞基來調(diào)控泛素標(biāo)記底物的降解，分別為USP14、UCHL5/Uch37、PSMD14/RPN11和PSMD7/RPN8［5］，其中PSMD14和PSMD7屬于JAMM家族的去泛素化酶位于19S RP的lid中［6］。組織結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明，19S RP的lid亞復(fù)合體由9個亞基組成，PSMD7位于中央核心位置［7］，說明PSMD7在形成19S蛋白酶體lid亞復(fù)合體中起重要的作用，然而它在細(xì)胞內(nèi)的具體功能尚不完全清楚。

纖毛/鞭毛是進(jìn)化上保守的具有特殊功能的細(xì)胞器，來源于細(xì)胞質(zhì)膜下的基體向上突出于細(xì)胞表面。實(shí)質(zhì)上纖毛和鞭毛的結(jié)構(gòu)基本相同：均由微管蛋白的軸絲及其外部包裹的與細(xì)胞膜相連的纖毛膜組成［8］。在鞭毛的解聚過程中，遠(yuǎn)端的鞭毛蛋白被泛素化標(biāo)記，通過IFT機(jī)制運(yùn)輸至基體而被蛋白酶體降解［9］。前期實(shí)驗中本課題組已用shotgun strategy對鹽藻鞭毛蛋白組學(xué)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了大量參與泛素結(jié)合過程的蛋白質(zhì)［10］，并且通過酵母雙雜交實(shí)驗證實(shí)了鹽藻鞭毛相關(guān)蛋白KCBP和蛋白酶體亞基PSMD7相互作用，并且蛋白酶體參與KCBP蛋白的降解［11，12］。作為蛋白酶體19S RP的lid中的核心蛋白，PSMD7在纖毛/鞭毛解聚后的表達(dá)情況還不清楚，因此本文通過3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）誘導(dǎo)鹽藻鞭毛的解聚，用實(shí)時熒光定量PCR檢測PSMD7在鞭毛解聚后mRNA的表達(dá)變化，同時構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a（+）-PSMD7，利用大腸桿菌BL21（DE3）進(jìn)行His-PSMD7融合蛋白的表達(dá)并進(jìn)行了蛋白純化，制備鹽藻PSMD7的多克隆抗體，研究PSMD7蛋白在鞭毛解聚后的表達(dá)情況，旨在為研究PSMD7生物學(xué)功能及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 方法

1.1.1 材料與試劑 質(zhì)粒pET28a（+）由本實(shí)驗室保存；感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、膠回收試劑盒、蛋白提取試劑盒和Bradford蛋白定量試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶Nde I和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、蛋白Marker等購自TaKaRa；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、弗氏完全佐劑（CFA）和弗氏不完全佐劑（IFA）購自Sigma；HisTrap column購自Amersham；AKTA Purifier購自GE；Quant SYBR Green PCR試劑盒購自Qigen。

親和層析Buffer A：Tris 50 mmol/L（pH 8.0）、NaCl 500 mmol/L、咪唑20 mmol/L；親和層析Buffer B：Tris 50 mmol/L（pH 8.0）、NaCl 500 mmol/L、 咪唑1 mol/L；Hepes緩沖液：Hepes 0.04 mol/L、KCl 0.01 mol/L、CaCl20.01 mol/L、NaCl 1 mol/L、山梨醇0.04 mol/L、甘露醇0.04 mol/L，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.2；鞭毛銀染液：將50 mL 5% AgNO3溶液置三角瓶內(nèi)，緩慢加入5%氨水，直至溶液變?yōu)橥该骷纯伞?/p>

1.1.2 實(shí)驗動物 波爾山羊一只，雄性，體重35 kg，購自河南省鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗中心。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時熒光定量PCR 參照Hirono等［13］的方法用IBMX誘導(dǎo)鹽藻鞭毛解聚，操作如下：收集500 mL對數(shù)生長期杜氏鹽藻細(xì)胞，1 200 r/min離心4 min，用無菌培養(yǎng)基清洗3次，將細(xì)胞用500 mL含0.1 mol/L IBMX的培養(yǎng)基光照培養(yǎng)誘導(dǎo)鞭毛解聚。分別在誘導(dǎo)后30、60和90 min收集藻體，并用改進(jìn)的銀染法［10］觀察鹽藻鞭毛解聚后的形態(tài)變化。用Trizol法提取鹽藻細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法A260/A280檢測所提取RNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｓ肞rimer Premier 6.0設(shè)計一對PSMD7特異性引物（上游引物：ATGGCACCGGCTCCGGACAG，下游引物：ATGACCAGCACTGGAGACAC），同時設(shè)計GAPDH引物作為內(nèi)參（上游引物：CAAGTTCTCCGCCGATGTGA， 下 游 引 物：GAACACGCCTGTGCCCTCAA）。先用普通PCR對退火溫度、引物濃度和模板濃度等實(shí)驗條件進(jìn)行優(yōu)化，確保PCR產(chǎn)物中沒有非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及引物二聚體。然后用Quant SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，反應(yīng)體系：cDNA模板0.3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2.5×Real Master Mix 35.7 μL，20×SYBR solution 29.25 μL，H2O 35.15 μL，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 5 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后觀察擴(kuò)增曲線和熔解曲線，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。所有反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT計算法分析數(shù)據(jù)［14］。

1.2.2 融合載體pET28a（+）- PSMD7的構(gòu)建 以杜氏鹽藻cDNA為模板，設(shè)計引物序列，上游引物：5'-AGCCATATGATGGCACCGGCTCCG-3'；下游引物：5'- CCCAAGCTTTTACTTCTTGCTCTC-3'（下劃線分別為Nde I和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶序列），PCR擴(kuò)增獲得PSMD7基因片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的片段，目的片段和pMD19-T載體相連轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆并提取質(zhì)粒，用Nde I和Hind Ⅲ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收PSMD7目的片段與雙酶切（Nde I和Hind Ⅲ）后的pET28a（+）連接，轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性克隆的質(zhì)粒雙酶切鑒定并進(jìn)行測序。

1.2.3 融合載體的表達(dá) 將構(gòu)建成功的融合載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞，挑取陽性菌落至試管，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD值約0.6。從試管中取200 μL菌液至1.5 mL離心管進(jìn)行離心（12 000 r/min，1 min），棄上清后菌體凍存于-20℃作為誘導(dǎo)前樣品。將菌液分為兩管，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，分別在37℃下誘導(dǎo)4 h和16℃下誘導(dǎo)8 h，取誘導(dǎo)后上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.4 融合蛋白的純化 PSMD7原核表達(dá)的融合蛋白上帶有His標(biāo)簽可用HisTrap column進(jìn)行純化。每升菌體加入40 mL Buffer A充分懸浮菌體，超聲破碎菌體，振幅為40%，工作6 s間歇6 s，共20 min，然后12 000 r/min離心20 min，上清用0.45 μm濾膜過濾備用。用AKTA Purifier蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行融合蛋白的純化，具體操作如下：將HisTrap column接入系統(tǒng)，設(shè)定系統(tǒng)流速為5 mL/min，壓限0.25 MPa，先用去離子水清洗柱中的乙醇，接著用Buffer A平衡柱子，然后將樣品接入super loop中，每次約50 mL，紫外檢測系統(tǒng)顯示有吸收峰時便開始收集穿透液，上樣結(jié)束后用8% Buffer B平衡柱子洗去與HisTrap column結(jié)合力較弱的雜蛋白，再用30% Buffer B洗脫目的蛋白并收集洗脫峰，結(jié)束后取20 μL洗脫峰蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測融合蛋白純度。

1.2.5 山羊抗鹽藻PSMD7多克隆抗體的制備 為研究鹽藻鞭毛解聚后PSMD7蛋白的表達(dá)情況，本實(shí)驗制備了山羊抗鹽藻PSMD7多克隆抗體。首先測定純化后PSMD7的蛋白濃度，與CFA等體積混合，在震蕩混合器上劇烈振蕩混勻，用超聲法短時間充分乳化抗原，功率為200 W，脈沖2 s，間歇59 s，工作5次。首次免疫時用CFA乳化抗原，加強(qiáng)免疫時均采用IFA乳化抗原。免疫程序如下：

波爾山羊免疫方案（圖1）：首次免疫：400 μg/0.5 mL+0.5 mL CFA/只；第2次免疫：200 μg/0.5 mL+0.5 mL IFA/只；第3次免疫：200 μg/0.5 mL+0.5 mL IFA /只；第4次免疫：200 μg/0.5 mL+0.5 mL IFA /只；第5次免疫：200 μg/0.5 mL+0.5 mL IFA /只。抗原經(jīng)頸部皮下注射免疫，其中首次和第2次免疫間隔14 d，其余每次免疫間隔時間均為7 d。第5次免疫7 d后靜脈采血檢測抗血清滴度。檢測前先確定最佳抗原包被濃度，方法為在第3次免疫后耳靜脈采血，用間接ELISA法檢測抗體滴度，正常山羊血清作為陰性對照。

圖1 波爾山羊免疫方案

1.2.6 Western blot分別在IBMX誘導(dǎo)鹽藻鞭毛解聚后30、60和90 min收集藻體，用蛋白提取試劑盒提取鹽藻蛋白，根據(jù)Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒的說明書測定蛋白濃度。將各組蛋白與5×SDS上樣緩沖液按5∶1的比例混合，沸水浴10 min使蛋白完全變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電壓調(diào)至80 V，待溴酚藍(lán)通過濃縮膠后，改用120 V電壓繼續(xù)電泳2-3 h，直至溴酚藍(lán)剛跑出即終止電泳。用Bio-Rad半干式電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，將X膠片放在PVDF膜上曝光，然后進(jìn)行定影，膠片用掃描儀掃描，目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的凈光密度值用Image J軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 融合載體pET28a（+）- PSMD7的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增杜氏鹽藻PSMD7基因片段為993 bp，與pMD19-T載體相連轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后，提取陽性克隆質(zhì)粒，Nde I和Hind III雙酶切后得到2 700 bp和993 bp的兩個片段（圖2-A），回收PSMD7目的片段與Nde I和Hind III雙酶切后的pET28a（+）相連構(gòu)建融合載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞后，質(zhì)粒的雙酶切后結(jié)果如圖2-B所示，含有預(yù)期大小的片段，測序結(jié)果顯示為杜氏鹽藻PSMD7序列，表明PSMD7融合載體構(gòu)建成功。

圖2 pET28a（+）-PSMD7融合載體的構(gòu)建

2.2 融合蛋白的表達(dá)與純化

將構(gòu)建成功的融合載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，分別在37℃下誘導(dǎo)4 h和16℃下誘導(dǎo)8 h。誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的上清與沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測。結(jié)果如圖3所示，0.2 mmol/L的IPTG在37℃和16℃都能成功誘導(dǎo)融合蛋白His-PSMD7的表達(dá)，分子量為36 kD，但表達(dá)量存在差異。37℃誘導(dǎo)4 h的His-PSMD7多以包涵體形式存在于沉淀中，而16℃誘導(dǎo)8 h的則多以可溶性蛋白存在于上清中，故選取16℃誘導(dǎo)8 h進(jìn)行大量表達(dá)，為后期抗體的制備提供足夠的蛋白。

圖3 SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達(dá)

大量誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)后，超聲裂解細(xì)菌并離心得到大量上清蛋白，用HisTrap column對融合蛋白進(jìn)行親和純化。首先用含20 mmol/L咪唑的Buffer A將收集的上清液打入上樣環(huán)，分別用6.5%和8% Buffer B洗脫雜蛋白，最后用30% Buffer B從鎳柱上洗脫目的蛋白（圖4-A）。SDS-PAGE檢測純化后融合蛋白的純度，結(jié)果顯示融合蛋白His-PSMD7純度較好（圖4-B），經(jīng)Image J軟件灰度分析顯示，純化后融合蛋白的純度高達(dá)為96%，滿足了后期抗體制備的要求。

圖4 融合蛋白His-DsPSMD7的親和純化

2.3 蛋白酶體亞基PSMD7在鹽藻鞭毛解聚后的表達(dá)

作為19S蛋白酶體中的一個去泛素化酶亞基，PSMD7和鞭毛解聚的關(guān)系仍不清楚。本實(shí)驗用IBMX誘導(dǎo)鹽藻鞭毛的解聚，如圖5所示，在IBMX處理后30，60和90 min鹽藻鞭毛發(fā)生明顯縮短。從鞭毛長度變化曲線（圖6）中可以看出，IBMX處理鹽藻30 min后，鞭毛長度由～11.0 μm縮短到～7.5 μm，縮短約30%。本研究通過IBMX誘導(dǎo)鹽藻鞭毛的解聚來觀察PSMD7表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示PSMD7在鞭毛解聚后的mRNA表達(dá)量增高，與對照組相比差異顯著（P＜0.05），其中在鞭毛解聚后30 min的表達(dá)量最高（圖7-A）。本實(shí)驗用純化的PSMD7蛋白制備了山羊多克隆抗體，ELISA法檢測所制備抗體的滴度高達(dá)1∶256K-1∶512K，Western blots結(jié)果顯示該抗體可以特異識別PSMD7，說明該抗體效價高、特異性強(qiáng)。從圖7-B和7-C可以看出鞭毛解聚后PSMD7蛋白的表達(dá)量增加，其中鞭毛解聚后60 min表達(dá)量最高。

圖5 IBMX誘導(dǎo)鹽藻鞭毛的解聚

圖6 鹽藻鞭毛解聚曲線（n=50）

3 討論

泛素結(jié)合體系不僅參與植物的免疫應(yīng)答和非生物脅迫（干旱、低溫、鹽脅迫）［15-17］，而且參與纖毛/鞭毛的解聚［19］。不論是衣藻和鹽藻細(xì)胞上的鞭毛，還是哺乳動物細(xì)胞上的纖毛，都是通過軸絲微管的組裝來進(jìn)行延長，通過軸絲微管的解聚來縮短，纖毛/鞭毛的組裝和解聚受細(xì)胞周期和外界信號的調(diào)節(jié)［19］。有研究表明，衣藻的鞭毛中存在著完整的泛素結(jié)合系統(tǒng)，包括E1、E2和E3［16］。這些系統(tǒng)在其他可動纖毛和初級纖毛中也都存在，如泛素、E1和E2在線蟲、果蠅、小鼠和人類的纖毛蛋白質(zhì)組都已被鑒定出來［5，20，21］。游離的泛素蛋白和泛素結(jié)合酶CrUbc13已在衣藻鞭毛中鑒定出來，并且當(dāng)加入外源泛素和腺苷三磷酸酶的時候，在分離的鞭毛中多個蛋白被泛素化，說明鞭毛中泛素結(jié)合體系在發(fā)揮作用。此外，在交配的早期泛素結(jié)合體系的底物（α-tubulin、dynein亞基IC2、兩個參與衣藻交配過程的信號蛋白、依賴環(huán)鳥苷酸的激酶和多囊腎離子通道2）泛素化增強(qiáng)，說明泛素化在調(diào)節(jié)鞭毛信號通路中非常活躍［18］，然而有關(guān)蛋白酶體是否參與鞭毛的解聚未見報道。

圖7 PSMD7在鞭毛解聚過程中的表達(dá)

鞭毛的解聚伴隨著鞭毛蛋白的降解，鑒于PSMD7在19S蛋白酶體lid結(jié)構(gòu)中的重要位置，我們推測PSMD7表達(dá)與鞭毛的解聚有關(guān)。杜氏鹽藻PSMD7含有331個氨基酸（42-1 034 bp），與萊茵衣藻、擬南芥等其他物種的同源度較高，約為60%，說明PSMD7與26S蛋白酶體的其他亞基一樣在進(jìn)化上高度保守。此外，PSMD7的C末端含有大量帶正電的（如賴氨酸）和帶負(fù)電的（如谷氨酸）氨基酸構(gòu)成的KEKE基序，這個基序在20S和19S亞基中的多個蛋白中都存在［7］。為了深入研究PSMD7的功能，本文構(gòu)建了融合表達(dá)載體pET28a（+）- PSMD7，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)了PSMD7-His融合蛋白的表達(dá)，并用HisTrap column對融合蛋白進(jìn)行了純化并制備了多克隆抗體，為后期深入研究PSMD7蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

本實(shí)驗用0.2 mmol/L IPTG成功誘導(dǎo)了His-PSMD7在BL21（DE3）中的表達(dá)。當(dāng)在37℃下誘導(dǎo)時融合蛋白多為包涵體，而在16℃誘導(dǎo)時則表達(dá)的大部分是可溶性蛋白。載體pET28a（+）上含有6×His標(biāo)簽，可以用HisTrap column進(jìn)行目的蛋白的親和純化。親和層析柱中的填料螯合Ni2+金屬離子，帶His標(biāo)簽的融合蛋白與Ni2+相互作用被吸附在層析柱上，而雜蛋白可以被洗脫下來。高濃度的咪唑溶液可競爭性與Ni2+結(jié)合，使目的蛋白被洗脫下來，從而達(dá)到純化的目的。本實(shí)驗結(jié)果顯示His-PSMD7與鎳柱的結(jié)合非常強(qiáng)，在洗脫過程中當(dāng)咪唑濃度達(dá)到80 mmol/L時，雜蛋白幾乎完全被洗脫，再用300 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測純化后的His-PSMD7純度較高為96%，滿足后續(xù)制備多克隆抗體的實(shí)驗要求。本實(shí)驗利用純化的PSMD7蛋白和免疫佐劑混合后作為抗原免疫波爾山羊，經(jīng)過多次免疫后獲得了高效價的山羊抗PSMD7蛋白的多克隆抗體，其滴度為1∶256K-1∶512K，同時Western blot也證實(shí)該抗體識別抗原時具有特異性，為后續(xù)檢測PSMD7蛋白的表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞭毛解聚后PSMD7的表達(dá)量增高，其mRNA水平在鞭毛解聚后30 min達(dá)到最大值。同時用Western blot檢測了鞭毛解聚后PSMD7蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明鞭毛解聚后PSMD7蛋白的表達(dá)量增高，說明PSMD7參與鹽藻鞭毛的解聚。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建融合表達(dá)載體pET28a（+）-PSMD7，用0.2 mmol/L IPTG在16℃誘導(dǎo)8 h可使融合蛋白以可溶形式表達(dá)，用HisTrap column親和純化得到高純度的目的蛋白，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示目的蛋白純度較高，制備的抗體效價高特異性強(qiáng)。鞭毛解聚后PSMD7的mRNA和蛋白的表達(dá)水平增高，說明蛋白酶體亞基PSMD7參與鞭毛的解聚。

［1］Gate D, Danielpour M, Bannykh S, et al. Characterization of cancer stem cells and primary cilia in medulloblastoma［J］.CNS Neurol Disord Drug Targets, 2015, 14：600-611.

［2］ 趙樸, 鄭玉姝, 劉興友. 泛素-蛋白酶體在病毒感染中的作用［J］. 生物技術(shù)通報, 2007（6）：48-50.

［3］Walsh CK, Sadanandom A. Ubiquitin chain topology in plant cell signaling：a new facet to an evergreen story［J］. Front Plant Sci, 2014, 5：122.

［4］D’Arcy P, Linder S. Proteasome deubiquitinases as novel targets for cancer therapy［J］. Int J Biochem Cell Biol, 2012, 44（11）：1729-1738.

［5］Obin M, Lee BY, Meinke G, et al. Ubiquitylation of the transducin betagamma subunit complex. Regulation by phosducin［J］. J Biol Chem, 2002, 277（46）：44566-44575.

［6］Sowa ME, Bennett EJ, Gygi SP, et al. Defining the human deubiquitinating enzyme interaction landscape［J］. Cell, 2009, 138（2）：389-403.

［7］Sharon M, Taverner T, Ambroggio XI, et al. Structural organization of the 19S proteasome lid：insights from MS of intact complexes［J］. PLoS Biol, 2006, 4（8）：e267.

［8］Fisch C, Dupuis-Williams P. The rebirth of the ultrastructure of cilia and flagella［J］. Biol Aujourdhui, 2011, 205（4）：245-267.

［9］Marshall WF, Rosenbaum JL. Intraflagellar transport balances continuous turnover of outer doublet microtubules：implications for flagellar length control［J］. J Cell Biol, 2001, 155：405-414.

［10］Jia Y, Xue L, Li J, et al. Isolation and proteomic analysis of the halotolerant alga Dunaliella salina flagella using shotgun strategy. Mol Biol Rep, 2010, 37（2）：711-716.

［11］Shi K, Li J, Han K, Jiang H, et al. The degradation of kinesin-like calmodulin binding protein of D. salina（DsKCBP）is mediated by the ubiquitin-proteasome system［J］. Mol Biol Rep, 2013, 40（4）：3113-3121.

［12］石科. 蛋白酶體亞基PSMD7在纖毛/鞭毛解聚及食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用［D］. 鄭州：鄭州大學(xué), 2013.

［13］Hirono M, Uryu S, Ohara A, et al. Expression of conventional and unconventional actins in Chlamydomonas reinhardtii upon deflagellation and sexual adhesion［J］. Eukaryot Cell, 2003, 2（3）：486-493.

［14］Livak K, Schmittgen T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod［J］. Methods, 2001, 25：402-408.

［15］王安邦, 金志強(qiáng), 劉菊華, 等. 香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2在非生物脅迫下的表達(dá)分析［J］. 生物技術(shù)通報, 2013（5）：77-80.

［16］嚴(yán)金平, 楊華. 泛素化修飾與植物免疫應(yīng)答［J］. 生物技術(shù)通報, 2011（2）：18-22.

［17］王金利, 史勝青, 賈利強(qiáng), 等. 植物泛素結(jié)合酶E2功能研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報, 2010（4）：7-10.

［18］Huang K, Diener DR, Rosenbaum JL. The ubiquitin conjugation system is involved in the disassembly of cilia and flagella［J］. J Cell Biol, 2009, 186：601-613.

［19］Hu Z, Liang Y, Meng D, et al. Microtubule-depolymerizing kinesins in the regulation of assembly, disassembly, and length of cilia and flagella［J］. Int Rev Cell Mol Biol, 2015, 317：241-265.

［20］Inglis PN, Boroevich KA, Leroux MR. Piecing together a ciliome［J］. Trends Genet, 2006, 22（9）：491-500.

［21］Lutz MS, Burk RD. Primary cilium formation requires von hippellindau gene function in renal-derived cells［J］. Cancer Res, 2006, 66（14）：6903-6907.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Expression Analysis of Proteasome Subunit PSMD7 After Flagellar Disassembly of Dunaliella salina

SHI Ke1，2LIANG Rui-feng3YANG Liang1
（1. Henan Medical College，Zhengzhou 451191；2. Laboratory for Cell Biology of Zhengzhou University，Zhengzhou 450008；3. Henan Province Chinese Medicine Research Institute，Zhengzhou 450004）

To study the relationship between the 19S proteasome subunit PSMD7 and flagellar disassembly in Dunaliella salina，the flagellar disassembly was induced by 3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）and the mRNA expression of PSMD7 was detected by real-time PCR. The high-purity PSMD7 protein of D. salina was obtained by prokaryotic expression and protein purification，followed by the preparation of goat anti-PSMD7 polyclonal antibody. The expression of PSMD7 protein after flagellar disassembly was investigated by Western blot. Results showed that the mRNA expression of PSMD7 increased after flagellar disassembly induced by IBMX and reached the highest at 30 min after disassembly. The goat anti-PSMD7 polyclonal antibody was successfully prepared. Results of Western blot showed that the protein level of PSMD7 rose after flagellar disassembly，indicating that the proteasome subunit PSMD7 was involved in flagellar disassembly of D. salina，thus this provides the basis for further study of the molecular mechanism of ubiquitin-proteasome system in flagellar disassembly.

PSMD7；proteasome；flagellar disassembly

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.014

2016-08-25

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項目（16A310008），河南省科技攻關(guān)計劃項目（152102310161，162102310047）

石科，女，博士，研究方向：生物工程；E-mail：shikesay@163.com，梁瑞峰為共同第一作者

梁瑞峰，男，碩士，助理研究員，研究方向：中藥藥理；E-mail：1654917295@qq.com