尿微量白蛋白熒光免疫層析定量檢測試劑的研制及性能評價

張賽 洪裕好 李凱 何小維 李文美，

（1. 廣州萬孚生物技術股份有限公司 自檢型快速診斷國家地方聯合工程實驗室，廣州 510663；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510640）

尿微量白蛋白熒光免疫層析定量檢測試劑的研制及性能評價

張賽1洪裕好1李凱1何小維2李文美1，2

（1. 廣州萬孚生物技術股份有限公司 自檢型快速診斷國家地方聯合工程實驗室，廣州 510663；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510640）

旨在建立一種快速定量檢測人尿液中微量白蛋白的熒光免疫層析方法。以羧基熒光微球標記的抗人白蛋白單克隆抗體及羊抗兔IgG為標記抗體，人白蛋白和兔IgG分別作為檢測線和質控線制備熒光免疫層析試紙條。結果顯示，所制備檢測試劑的線性范圍為5-300 mg/L，檢測限為2.3 mg/L，批內和批間變異系數（CV）分別為6.4%-9.3%和6.5%-12.3%，平均回收率為102.3%。試劑與尿液中20種干擾物質無交叉反應，實時穩定性試驗表明試劑盒有效期＞12月。臨床樣本測試，與Orion QuikRead U-ALB試劑相關性較好（r＝0.993，P＜0.01），Bland-Altman分析表明兩種方法的診斷結果具有較好的一致性。所制備的熒光免疫層析檢測試劑提供了一種簡單、快速、準確的定量檢測尿液中微量白蛋白的方法。

尿微量白蛋白；熒光免疫層析；快速檢測

尿微量白蛋白（Microalbuminuria，MAU）是指在尿中出現微量白蛋白，其分泌率在30-300 mg/24 h的范圍內。正常情況下人血白蛋白很難通過腎小球基底膜，只有極少量的白蛋白可以通過尿液排出體外，當腎小球基底膜病變，蛋白濾過量超過腎小管重吸收，則導致尿白蛋白增高［1］。尿微量白蛋白是診斷糖尿病腎病早期腎損傷的可靠生化指標［2-4］。此外，研究表明MAU也是高血壓、孕婦子癇前期及心血管疾病并發癥獨立的危險因素［5-7］。

目前臨床上常用的檢測MAU的方法有放射免疫法［8］、酶聯免疫吸附法［9］、化學發光法［10］、免疫比濁法［11］和免疫層析法［12］等。放射免疫法利用放射性同位素作為示蹤劑，有放射性污染且儀器較貴；酶聯免疫吸附法需要多次洗滌和孵育，操作繁瑣；化學發光法成本較貴，試劑及儀器皆依賴于進口；免疫比濁法靈敏度高、特異性好，但需要高質量的特種蛋白分析儀；免疫層析法克服以上幾種方法的缺點，具有快速、靈敏、特異性強、操作簡便、成本較低等優點，是近年免疫檢測中最有發展前途的方法［13］

本研究為克服膠體金免疫層析靈敏度相對偏低，且只能用于定性或半定量檢測的缺點，擬采用免疫標記技術和免疫層析方法，以熒光納米微球作為示蹤物，制備免疫層析試紙條，以期獲得一種操作簡單快速、靈敏度高、特異性強、定量準確的檢測尿微量白蛋白的新的檢測模式。

1 材料與方法

1.1 材料

人血白蛋白，西班牙Instituto Grifols公司；鼠抗人白蛋白單克隆抗體，芬蘭Medix Biochemica公司；兔IgG 及羊抗兔IgG 均為本實驗室制備［14］；熒光微球，美國Bangs lab公司；硝酸纖維素膜，德國Sartorius公司；碳二亞胺（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo NHS），美國Thermo Scientific 公司；牛血清白蛋白（BSA）、吐溫-20、聚乙二醇-4000、一水嗎啉乙磺酸（MES），美國Sigma 公司；硼砂、硼酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，廣州化學試劑廠。其余試劑均為國產分析純。

ND2000 型超微量分光光度計、Legen RT+臺式高速冷凍離心機，美國Thermo Scientific公司；Iso Flow型噴膜機，美國Imagene Technplogy公司；HGS201切條機，杭州峰航科技有限公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q 超純水機，美國Millipore公司；LEO1530VP場發射掃描電子顯微鏡，德國Zeiss公司；飛測II熒光定量檢測儀，廣州萬孚生物技術股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MAU熒光免疫層析試紙條的制備及優化

1.2.1.1 熒光免疫層析試紙條的制備 采用競爭法反應模式，以羧基熒光微球標記的抗人白蛋白單克隆抗體及羊抗兔IgG為標記抗體，用噴膜機噴一定濃度的標記抗體、人血白蛋白和兔IgG于硝酸纖維素（NC）膜上分別作為標記線、檢測線（T線）和質控線（C線）。試紙條的組裝是在聚氯乙烯（PVC）板上順次相互搭接樣品墊、NC膜和吸水紙，然后用切條機切割成4 mm寬的試紙條，試紙條組成如圖1所示。測試時將75 μL待測尿液樣本直接加入加樣孔中，反應3 min后用熒光定量檢測儀檢測。

圖1 試紙條組成

1.2.1.2 熒光微球標記抗體濃度的確定 熒光微球的標記過程參照本實驗室已建立的方法［14］。研究每毫升1% 熒光微球中加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mg的抗體對檢測線熒光信號T值的影響，以確定最佳抗體標記濃度。以標記線熒光微球使用濃度30%+3%，T、C線蛋白濃度2.0 mg/mL噴膜，制備試紙條。取濃度為20 mg/L的參考品75 μL進行加樣，反應時間3 min，每個濃度重復測試5次。

1.2.2 MAU熒光免疫層析檢測試劑的性能評價

1.2.2.1 檢測限 以零濃度參考品作為標本重復測定20次，計算其熒光信號均值（x-）及標準差（SD），將+2SD所得的熒光值代入標準曲線方程計算得出其檢測限。

1.2.2.2 精密度 抽取兩個批次的MAU檢測試劑，分別對MAU濃度20、45、105 mg/L的參考品進行檢測，每個濃度重復測定20次，計算批內和批間各濃度變異系數（Coefficient of variation，CV）。

1.2.2.3 回收率 在已知6個不同濃度的MAU尿液中加入不同濃度的MAU純抗原，使得尿液中MAU的期望濃度為20 mg/L和100 mg/L，每個濃度重復測試5次，計算回收率，即實測值與理論值的比值。

1.2.2.4 特異性 以含MAU的尿液樣本（35 mg/L）為對照，向其中分別添加干擾物質丙酮、肌酐、膽紅素、抗壞血酸、葡萄糖、對乙酰氨基酚、檸檬酸、尿素、氨芐西林、咖啡因、四環素、膽固醇、血紅蛋白（1 mg/mL），人IgA、人IgG、人IgM（50 mg/L），β2-微球蛋白（5 mg/L），促甲狀腺激素（TSH，100 mIU/L）、促卵泡激素（FSH，100 mIU/mL）、人絨毛膜促性腺激素（HCG，100 IU/mL），每個濃度重復測試5次，比較不同干擾物質的測試值，以評價試劑的特異性。

1.2.2.5 穩定性 將成品試劑盒置于干燥房保存，14個月內每個月分別測試濃度為20、45、105 mg/L的MAU參考品，每個濃度重復測試5次，檢測結果相對偏差在±20%以內認為試劑穩定性良好。

1.2.2.6 臨床驗證 用本試劑盒（萬孚-MAU）檢測244例臨床尿液樣本，以Orion QuikRead U-ALB試劑檢測結果為對照，每個臨床樣本測試2次取平均值，比較其檢測結果的相關性和一致性。

1.2.3 統計學分析 采用Origin8.0軟件擬合標準曲線方程，R2≥0.998，P＜0.05表明線性良好。各組數據用x-±s表示。兩種方法臨床定量檢測結果的相關性采用SPSS18.0進行線性回歸分析，相關系數r≥0.95表明相關性良好。采用Bland-Altman圖進行臨床測試結果的一致性分析，統計95%一致性界限外的百分比。

2 結果

2.1 熒光微球掃描電鏡圖譜

從原熒光微球掃描電鏡圖（圖2-A）中可以看出，實驗所用熒光微球呈均一分散的球形，粒徑為500 nm 左右。從與抗體蛋白共價偶聯后的免疫熒光微球掃描電鏡圖（圖2-B）圖中可以看出，微球-抗體復合物仍粒度均一，沒有出現團聚現象。與抗體蛋白共價偶聯后在微球的表層可以觀察到一層“暈”，這層“暈”即為蛋白質分子層。

圖2 熒光微球掃描電鏡圖譜

2.2 標記抗體蛋白濃度的確定

不同標記抗體蛋白濃度下免疫層析熒光信號如圖3所示，在0.2-1.2 mg/mL的范圍內，隨著蛋白濃度的增加，熒光信號值逐漸增加，高于1.0 mg/mL時，熒光信號值變化平穩，說明抗體標記濃度為1.0 mg/mL時，熒光微球共價偶聯蛋白量已達到飽和，因此最佳抗體標記濃度為1.0 mg/mL。

圖3 熒光信號隨標記抗體蛋白濃度的變化

2.3 MAU熒光免疫層析定量檢測試劑的標準曲線

MAU熒光免疫層析定量檢測試劑的標準曲線如圖4所示，回歸方程y=0.00902x+0.27324（決定系數R2＝0.99974、P＜0.01），熒光信號C/T值與MAU參考品濃度在5-300 mg/L范圍內具有良好的線性關系。將x-±SD所得的熒光值代入標準曲線方程計算得出其檢測限為2.3 mg/L，試劑分析靈敏度較高。

圖4 MAU熒光免疫層析檢測試劑標準曲線

2.4 精密度

抽取兩個批次的MAU檢測試劑，分別對MAU濃度20、45、105 mg/L的參考品進行檢測，結果如表1所示，批內和批間變異系數分別為6.4%-9.3%和6.5%-12.3%，批內與批間各檢測濃度CV＜15%，試劑精密度較高。

表1 MAU熒光免疫層析檢測試劑精密度

2.5 回收率

如表2所示，MAU熒光免疫層析檢測試劑在回收率在93.6%-108.3%之間，平均回收率為102.3%，表明添加物與尿液被測物一致，基本沒有尿液基質物的干擾。

表2 MAU熒光免疫層析檢測試劑回收率

2.6 特異性分析

MAU熒光免疫層析檢測試劑特異性分析結果如圖5所示，20種干擾物質的測試值與對照品的相對偏差均＜15%，故這20種干擾物在尿液中對MAU檢測無影響，試劑抗干擾能力較強。

2.7 穩定性試驗

穩定性試驗結果如表3所示，14個月內檢測濃度為20.0、45.0、105.0 mg/L的MAU參考品，各濃度相對偏差均＜20%，表明MAU試劑盒較穩定，有效期＞12月。

2.8 臨床試驗

244例臨床尿樣同時用自制試劑盒與Orion QuikRead U-ALB試劑盒測定的數值進行相關性分析，結果兩種方法所測試值有顯著相關性（圖6），線性回歸方程y=0.9813x+1.9232，Pearson相關性系數r=0.993，P＜0.01。采用Bland-Altman圖進行臨床測試結果的一致性分析，結果如圖7所示。244例配對數據差值的均數為-1.0 mg/L，95%一致性界限為-15.1-13.1 mg/L，5.32%（13/244）的點在95%一致性界限以外，在一致性界限范圍內，Orion試劑與萬孚MAU試劑相比，差值的絕對值最大為13.7 mg/L，該樣本測試均值為216.9 mg/L，這種相差的幅度在臨床上可以接受，因此可以認為兩種方法測量的結果具有較好的一致性。

3 討論

白蛋白的分子量為6.9 kD，帶負電荷，是腎小球濾過膜所能通過的最小蛋白質分子之一，經腎小球濾過的蛋白質基本全部被近曲小管主動回吸收，因此尿中只有微量白蛋白。當腎小球基底膜病變，蛋白濾過量超過腎小管重吸收，則導致尿白蛋白增高，尿微量白蛋白是指尿中白蛋白含量為30-300 mg/24 h，或隨機尿樣本中白蛋白濃度為20-200 mg/L。尿微量白蛋白不僅是評估高血壓病和糖尿病腎功能損傷的早期敏感指標，而且已被證實是心血管疾病獨立的危險因素［15，16］，也是內皮細胞功能受損的標志，能夠預報大血管病變［17］。

圖5 MAU熒光免疫層析檢測試劑特異性

表3 MAU熒光免疫層析檢測試劑穩定性

圖6 萬孚-MAU與Orion試劑相關性

圖7 萬孚-MAU與Orion試劑相關性Bland-Altman一致性分析

Omidfar等［18］研制了一種膠體金免疫層析試紙條檢測尿液中微量白蛋白，試紙條靈敏度為20 mg/L，測試時間10 min。劉芳等［19］建立一種快速檢測尿中微量白蛋白的高效液相色譜法，單個標本檢測速度約為6 min，該法在5-2 000 mg/L范圍內線性較好，檢測限2 mg/L。Qin等［20］采用時間分辨熒光共振能量轉移分析法快速、定量檢測尿液中微量白蛋白，檢測時間12 min，檢測范圍10-320 mg/L，檢測限5.5 mg/L。Choi等［21］建立一種現場即時檢驗尿微量白蛋白的熒光免疫分析法，定量檢測限4.65 mg/L，測試時間10 min。本研究所研制的尿微量白蛋白熒光免疫層析試劑檢測范圍為5-300 mg/L，檢測限2.3 mg/L，檢測時間3 min，相比其他方法檢測靈敏度高、測試時間短。

即時檢驗（Point of care testing，POCT）是體外診斷行業的子行業，是近幾年體外診斷行業重要的發展方向和增長最快的領域。本研究所建立的MAU熒光免疫層析定量檢測方法無需配備大型儀器設備，采用一步法加樣，操作簡單，靈敏度高，重復性、準確度高，特異性及穩定性較好。不足之處是由于尿液樣本個體差異大、分析結果易受化學成分的干擾，這可能造成個別樣本測試結果與臨床狀態不符，后期仍需增大臨床樣本測試數量，并針對特殊樣本進行改進，以增強試劑的抗干擾能力。

4 結論

本研究所制備MAU熒光免疫層析檢測試劑的線性范圍為5-300 mg/L，檢測限為2.3 mg/L，線性范圍廣，分析靈敏度高；批內和批間變異系數（CV）分別為6.4%-9.3%和6.5%-12.3%，平均回收率為102.3%，試劑重復性及準確度高。試劑與尿液中20種干擾物質無交叉反應，特異性較好；實時穩定性試驗表明試劑盒有效期＞12月。臨床樣本測試，與Orion QuikRead U-ALB試劑相關性較好（r＝0.993，P＜0.01），Bland-Altman分析表明兩種方法的診斷結果具有較好的一致性。

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（責任編輯 李楠）

Establishment and Performance Evaluation of a Quantitative Detection Method for Microalbuminuria Based on Fluorescence Immunochromatography

ZHANG Sai1HONG Yu-hao1LI Kai1HE Xiao-wei2LI Wen-mei1，2
（1. National & Local United Engineering Lab of Rapid Diagnostic Test，Wondfo Biotech Co.，Ltd.，Guangzhou 510663；2. College of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640）

This work aims to develop a rapid quantitative detecting method of fluorescence immunochromatographic assay（FICA）for human urinary microalbuminuria（MAU）. The fluorescence immunochromatographic strips were successfully prepared with anti-human albumin monoclonal antibody and goat anti-rabbit IgG marked by carboxyl fluorescent microspheres as the detection antibody，human albumin as the test line，and the rabbit IgG as the control line. As the results showed，the linear range of prepared kit（i.e.，fluorescence immunochromatographic strips）was in 5 mg/L-300 mg/L with a detection limit of 2.3 mg/L. The intra- and inter-assay coefficient of variation was 6.4%-9.3% and 6.5%-12.3%，respectively. The average recovery percent was 102.3%. The kit showed solid specificity as there was no cross-reactivity with 20 kinds of interfering substances. The shelf time of the kit by real-time stability test was ＞ 12 months. Test with clinical urinary samples by the kit showed high correlation（r = 0.993，P ＜ 0.01）with the control Orion QuikRead U-ALB kit，and Bland-Altman analysis showed that the diagnostic results of the two methods presented promising consistency. In conclusions，the prepared fluorescence immunochromatographic kit provides a simple，rapid and accurate quantitative detection method for microalbuminuria.

microalbuminuria；fluorescence immunochromatography；rapid detection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.029

2016-09-09

國家科技支撐計劃資助項目（2012BAI19B05），廣州市科技計劃資助項目（201503020003）

張賽，男，碩士研究生，研究方向：免疫檢測技術；E-mail：zhangsai0623@126.com

李凱，男，研究方向：免疫檢測技術；E-mail：kaili@wondfo.com.cn