miR-124靶向TNF-α促進豬皮下脂肪細胞分化

李虹儀 李家標 鄭藝林 吉盧琳 張茂 鄭恩琴

（1. 龍巖學院生命科學學院 動物營養科研創新團隊，龍巖 364012；2. 華南農業大學 廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣州 510642）

miR-124靶向TNF-α促進豬皮下脂肪細胞分化

李虹儀1李家標1鄭藝林1吉盧琳1張茂1鄭恩琴2

（1. 龍巖學院生命科學學院 動物營養科研創新團隊，龍巖 364012；2. 華南農業大學 廣東省農業動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣州 510642）

前期研究中采用雙螢光素酶報告基因驗證了miR-124與脂解因子豬TNF-α之間的靶關系，以此為基礎研究miR-124是否影響豬皮下脂肪細胞的分化。采用miR-124 模擬物mimics和抑制物inhibitor 分別轉染豬脂肪前體細胞并誘導其分化成成熟脂肪細胞，檢測細胞的聚脂情況，甘油及甘油三酯的含量變化，熒光定量檢測脂肪細胞關鍵轉錄因子PPARγ，脂肪合成和分解的主要酶FASN和HSL基因的表達變化。結果顯示，過表達miR-124 能抑制TNF-α蛋白的表達，脂肪細胞脂滴多于對照組，甘油三酯（TG）含量顯著增加（P＜0.01），甘油含量亦顯著增加（P＜0.05），PPARγ、FASNT和HSL的表達顯著上調（P＜0.01）；抑制細胞miR-124的表達脂滴則較少，TG含量顯著減少（P＜0.05），PPARγ和FASN的表達均顯著下調（P＜0.05）。miR-124可能通過抑制TNF-α調節豬脂肪細胞的分化，為后續研究miR-124調節脂肪代謝的相關機制奠定基礎。

miR-124；豬；脂肪分化；TNF-α

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）是一個多功能因子，由脂肪細胞產生并分泌，從多方面影響脂肪細胞的功能。TNF-α在脂肪組織中與多個基因相互聯系，起著抑制脂肪生成［1］、促進脂肪細胞脂解［2］等作用。miRNA（microRNA）是近年來逐漸被關注的調控分子，能通過靶mRNA的編碼區或3'非翻譯區互補結合實施轉錄后調控。研究表明miRNA調控哺乳動物至少60%的基因［3］，參與了幾乎所有細胞的活動。越來越多的研究結果顯示，miRNA對脂肪細胞的分化增殖及脂肪的沉積起至關重要的作用。如miR-130和miR-27家族均通過減少靶基因PPARγ的生物合成抑制人脂肪細胞的分化［4，5］；而miR-148則是通過靶向CREB基因非翻譯區，抑制其表達從而促進人脂肪細胞的分化［6］。

miR-124目前的研究大都與腫瘤相關，研究顯示miR-124可抑制髓母細胞瘤細胞［7］、胃癌細胞［8］、乳腺癌細胞［9］、前列腺癌細胞［10］等癌癥相關細胞的增殖。miR-124調控脂肪相關功能的研究較為少見，而豬作為沉積脂肪能力最強的動物之一，其與人類在生理生化方面有很多相似性，且存在著天然的脂肪型和瘦肉型品種，因此被認為是研究人類肥胖、糖尿病等脂肪代謝相關疾病最佳的模式動物。

在前期的研究中我們用雙螢光素酶系統檢測出miR-124與豬TNF-α有直接的靶關系，能顯著抑制豬TNF-α的表達［11］。因此，本實驗以豬皮下脂肪前體細胞為模型，研究miR-124對豬脂肪細胞分化的影響以及是否通過TNF-α起調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞培養板培養瓶購自Corning公司；DMEM/F12培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、I 型膠原酶、雙抗（青、鏈霉素）購自GIBCO公司；地塞米松（Dexmethasone）、重組牛胰島素（Insulin）、油酸（Oleic acid）和辛酸（Octanoic acid）購自SIGMA公司；油紅O（Oil Red O）、PMSF購自Amresco公司；轉染試劑Lipofectamine 2000、Trizol一步法總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；96孔定量PCR板和定量PCR膜購自Axygen；miRNA mimics、inhibitor以及陰性對照（NC）由上海吉瑪公司合成；甘油三酯檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；RIPA細胞裂解液和BCA法總蛋白測定試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬皮下脂肪前體細胞的分離培養 采用Zhou等［12］建立的分離培養方法，選取7日齡的長白仔豬，放血處死后用75%（V/V）酒精消毒，在無菌條件下分離背部皮下脂肪，眼科剪將脂肪組織剪碎后用0.1%的I型膠原酶于37℃水浴搖床消化1-2 h。消化液過篩后于800×g離心5 min，在沉淀細胞中加入10 mL紅細胞裂解液，室溫孵育10 min過篩，再用DMEM/F12洗滌細胞，800×g離心10 min后用含10%新生牛血清、100 000 U/L青霉素，100 mg/L的鏈霉素的DMEM/F12培養液重懸細胞，接種于75 cm2細胞培養瓶中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 細胞的轉染及誘導 生長良好的脂肪前體細胞消化后以1.5×105cells/cm2接種到6孔板中，細胞24 h內匯合90%時，將70 ng miR-124 mimics或inhibitor與LipofectamineTM2000進行孵育，按照說明書操作方法轉染細胞，并以NC作為陰性對照，每個處理設6個重復。轉染24 h后用含胰島素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培養基進行對細胞誘導，連續誘導8 d。

1.2.3 油紅O染色 將誘導8 d的脂肪細胞用DMEM/F12洗兩次，加入200-250 μL 4%多聚甲醛固定液固定后加入油紅O工作液染色30 min；染完用清水沖洗去掉殘留的油紅O，滴加適量甘油封孔，置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.4 甘油及甘油三酯檢測 細胞誘導過程中收集細胞培養基進行甘油檢測；誘導8 d后脂肪細胞用DMEM/F12洗兩次，加入100 μL細胞裂解液（含1 mmol/L PMSF的RIPA細胞裂解液），輕輕搖動培養板充分裂解細胞，將細胞裂解液轉移到500 μL離心管中，BCA（bicinchoninic acid）法測定每孔細胞總蛋白含量；甘油和甘油三酯測定分別根據試劑盒說明書進行檢測，檢測結果根據標準曲線計算待測樣品中甘油和甘油三酯的濃度，所得數據均用總蛋白數據進行校正。

1.2.5 Western blot 檢測 提取分化成熟脂肪細胞的總蛋白，用5%PAGE濃縮膠和10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠對總蛋白進行電泳分離，分離完全后將膠上TNF-α蛋白和β-actin分別轉到PVDF膜上，1×TBS洗滌膜10 min后用5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h。封閉后的PVDF膜加入2 mL適度稀釋的蛋白一抗，4℃冰箱旋轉孵育過夜。次日移出剩余的一抗，加入2 mL 1∶5 000稀釋的紅外二抗孵育1 h，蛋白顯像用Odyssey紅外成像儀（LI COR）掃描。

1.2.6 定量檢測 Trizol一步法抽取誘導后皮下脂肪細胞總RNA，OligodT18反轉錄成cDNA，并以此為模板進行各相關基因的熒光定量PCR檢測，所用引物如下：

PPARγ：S-CATTCGCATCTTTCAGGG，ATGGACGCCATACTTTAGGA；

FASN：S-ACCGAGTGGCTGGGTATT，A-CAAGAAGAGGTTGTTGTGGG；

HSL：S-GCCCGAGACGAGATTAG，ATGAAGGGATTCTTGACG。

檢測結果以β-actin作為內參照，根據以下公式計算出目的基因相對于內參基因的比值來反應各基因mRNA表達豐度：2-ΔCt＝2-（Ct目的基因-Ct內參基因）。

1.2.7 數據統計 組間差異采用t檢驗進行分析，以P＜0.05作為差異顯著性檢驗標準。所有數據分析均由SPSS19.0統計軟件完成。

2 結果

2.1 豬皮下脂肪前體細胞的誘導分化

豬皮下脂肪前體細胞鋪滿培養板底90%時將培養基更換為含有含胰島素、地塞米松、油酸和辛酸（各50 nmol/L）的分化培養基，隔天換液，連續誘導8 d。從顯微鏡下可以觀察到（圖1），誘導2 d后細胞開始出現黃色小脂滴，此后隨著誘導天數的增加，脂滴的數量逐漸增多，體積逐漸增大。第8天時可以清楚地觀察到細胞的形態以及脂滴在細胞中的分布，前期出現的脂滴在此時已變得飽滿明亮，周圍擠滿了后期分化的脂滴。

圖1 豬脂肪細胞分化模型

2.2 miR-124對豬脂肪細胞TNF-α表達的影響

前期研究工作中得出miR-124能通過種子序列抑制TNF-α的表達，為了進一步研究miR-124是否作用于豬脂肪細胞中TNF-α的表達，利用前體細胞的分化模型，以1.5×105cells/cm2的密度將前體細胞接種于6孔板中，待細胞鋪滿90%時，分別轉染miR-124 mimics以及陰性對照NC，轉染24 h后將培養基更換為分化培養基進行分化誘導，連續誘導8 d后收集細胞蛋白，Western blot 檢測結果（圖2）顯示，過表達miR-124會抑制豬脂肪細胞中TNF-α的表達。

圖2 miR-124抑制TNF-α蛋白表達

2.3 miR-124對豬皮下脂肪前體細胞分化的影響

為了研究miR-124對豬皮下脂肪前體細胞的調節作用，待細胞鋪滿90%時，分別轉染miR-124 mimics、miR-124 inhibitors和NC，轉染24 h后進行分化誘導，連續誘導8 d，收集細胞檢測各處理細胞的總蛋白量及TG含量。校正結果（圖3-A）顯示，轉染miR-124 mimics的細胞TG含量比對照組顯著增加（P＜0.01），轉染miR-124 inhibitor 的細胞對照組TG含量比對照組顯著降低（P＜0.01）。油紅O對脂肪細胞染色結果與TG檢測結果一致。從圖3-B和3-C可以看出，過表達miR-124時細胞脂滴增多，抑制則呈現相反的結果。同時，又對細胞的甘油含量進行了檢測（圖3-C），發現表過達miR-124的細胞甘油含量也顯著增加（P＜0.05）。

圖3 miR-124調控脂肪細胞的聚酯分化

2.4 miR-124對脂肪前體基因表達的調節

為了驗證miR-124是否通過TNF-α影響脂肪細胞的分化，收集誘導8 d的脂肪細胞進行RNA抽取并反轉錄為cDNA，熒光定量檢測與TNF-α相互調節且對脂肪細胞分化起重要作用的轉錄因子和酶的表達，結果（圖4）顯示，轉染miR-124 mimics的細胞PPARγ、FASN和HSL的表達均顯著上調（P＜0.01），而抑制miR-124表達的細胞PPARγ和FASN的表達顯著下調（P＜0.05），而HSL則同樣顯著下調（P＜0.05）。

圖4 miR-124調控脂肪細胞代謝相關基因的表達

3 討論

本研究以豬皮下脂肪前體細胞為模型進行誘導分化，分化過程中可見細胞內的脂滴隨著分化天數的增加不斷變多、變大，且能被油紅O所染色，說明豬皮下脂肪細胞培養成功，保證后續實驗的開展。在前期實驗中發現miR-124能抑制豬TNF-α的表達，而TNF-α在脂肪細胞中能夠通過NIK-TAK1/TAB1軸激活NFκB對PPARγ進行抑制［13］，從而起到一定的脂解作用。本研究中細胞過表達miR-124后表現為TNF-α蛋白含量減少，脂滴增多，甘油三酯含量顯著增加，可能為細胞分化過程中miR-124通過抑制TNF-α的表達減緩對PPARγ的抑制，使細胞表現為促進脂肪合成。定量檢測中顯示PPARγ和FASN的表達顯著上升，其中PPARγ是脂肪前體細胞分化中后期兩個最重要的轉錄調控因子之一，而FASN在脂肪酸合成中起著至關重要的作用，影響著動物脂肪的沉積。定量的結果正好印證了上述推測觀點。

過多的的脂肪將通過脂肪動員，在HSL的刺激下分解成甘油和游離的脂肪酸，但是，細胞上清甘油的含量和細胞HSL的表達并不如預測中般下降，而是上升。有研究也顯示，TNF-α能夠抑制HSL mRNA表達［14］，因此，本研究中過表達miR-124提高HSL基因表達可能是通過抑制TNF-α的表達來完成的，且對應地表現為細胞甘油含量顯著增加。豬脂肪細胞的合成與分解途徑是相互協調的［15］，因此推測實驗中過表達miR-124使脂肪細胞合成代謝加快，TG含量顯著增加，但細胞為了維持代謝平衡，提高內部分解代謝酶的表達，一定程度上促進了脂肪的分解，因此甘油含量比對照組高。即過表達miR-124同時促進了脂肪的合成代謝與分解代謝，合成代謝速度比分解代謝快使細胞表現為脂滴增多。

另外，實驗還研究了抑制miR-124的表達細胞TNF-α蛋白水平和脂滴的變化，TG和甘油含量變化以及相關基因的表達變化，結果顯示，細胞的聚酯情況，TG含量，PPARγ和FASN的表達均表現為與miR-124 mimics相反的作用，但TNF-α的蛋白水平及甘油含量均沒顯著變化，而HSL表達雖然不及mimics般顯著但同樣表現為上升，這可能為多個小RNA同時作用于相同靶基因，抑制之后其他小RNA會有一定的補償效應。

4 結論

miR-124能通過調節TNF-α的表達調控脂肪細胞的分化，過表達miR-124將促進細胞的聚酯，提高TG的含量，提高相關基因的表達，而抑制miR-124的表達則結果相反。

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（責任編輯 李楠）

miR-124 Regulates Porcine Adipocyte Differentiation Trough Targeting TNF-α

LI Hong-yi1LI Jia-biao1ZHENG Yi-lin1JI Lu-lin1ZHANG Mao1ZHENG En-qin2
（1.Animal Nutrition Scientific Research Innovation Team，College of Life Science，Longyan University，Longyan 364012；2.Guangdong Provincial Key Lab of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding， South China Agricultural University， Guangzhou 510642）

In the previous research，porcine TNF-α was found to be the target of miR-124 by dual luciferase assay. Here we verify whether miR-124 has the effect on the differentiation of porcine adipocyte. Porcine pre-adipocyte was transfected with miR-124 mimics or inhibitor to over-express or to repress miR-124，and then induced into mature adipocytes. The accumulation of lipid droplets was observed using Oil Red O staining and the amount of glycerol and triglycerides（TG）were detected by TG assay and glycerol assay. The expressions of PPARγ（proliferator-activated receptor-γ），FASN（fatty acid synthase），and HSL（hormone-sensitive lipase）were detected by real time fluorescence quantitative PCR. The result showed that overexpression of miR-124 repressed the expression of TNF-α protein，therefore，lipid droplets were more than that in the control，TG increased significantly（P ＜ 0.01），also the same for glycerol（P ＜ 0.05），and the expressions of PPARγ，FASNT，and HSL significantly up-regulated（P ＜ 0.01）. Repressing miR-124 resulted in the reduction of lipid droplets and the significant decrease of TG，and the expressions of PPARγ and FASNT significantly down-regulated（P ＜ 0.05）. In conclusion，miR-124 might regulate the differentiation of porcine adipocyte by suppressing TNF-α，laying a foundation for future studies on the mechanism of miR-124 regulating lipid metabolism.

miR-124；porcine；adipocyte differentiation；TNF-α

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.025

2016-08-02

福建省大學生創新創業訓練計劃項目（201511312055），福建省自然科學基金項目（2014J05043），龍巖學院博士啟動基金項目（LB2013012）

李虹儀，女，講師，研究方向：動物營養生理與生物化學；E-mail：politician_137@163.com

張茂，男，講師，研究方向：動物遺傳；E-mail：zm18email@163.com