一株水稻促生長內生真菌的綠色熒光蛋白基因標記與示蹤

陳楠 于飛 何艷柳 卜寧

（沈陽師范大學生命科學學院，沈陽 110034）

一株水稻促生長內生真菌的綠色熒光蛋白基因標記與示蹤

陳楠 于飛 何艷柳 卜寧

（沈陽師范大學生命科學學院，沈陽 110034）

將綠色熒光蛋白基因（gfp）轉入到堿蓬內生真菌JP4-1中并檢測菌株在水稻幼苗中的定殖情況。采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化方法將攜帶gfp基因的pCT74質粒與菌株基因組整合獲得轉化子，用轉化子侵染水稻幼苗，熒光顯微鏡下示蹤JP4-1菌株及其侵染特性。轉化子經連續傳代6次仍能發出綠色熒光且熒光強度良好，能夠穩定遺傳；經PCR驗證gfp基因已成功轉入JP4-1菌株和水稻幼苗植株內并表達。轉化可獲得穩定表達GFP的JP4-1轉化子，JP4-1菌株可定殖于水稻幼苗的根、莖、葉，定殖位置為細胞間隙，其促生作用與野生型菌株無明顯差別。

內生真菌；綠色熒光蛋白；原生質體；轉化；定殖

在植物遺傳轉化過程中，需要檢測外源基因在受體細胞、組織或完整植物體內是否表達，報告基因即應用而生［1］，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）即是其 中 一種。GFP是Douglas Prasher在1962年從發光水母（Aequorea victoria）中克隆得到的一種發光蛋白［2］。在450-490 nm藍光波長下可以發出穩定的綠色熒光［3］。GFP已大量應用于多種細菌、真菌、植物和哺乳動物細胞的研究［4］，因為其具有無毒害、易于檢測、易于構建載體和獲得突變體、適于進行活細胞檢測，以及具有良好的通用性等特點，而成為目前被廣泛應用的標記基因［5］。Cormack等［6］最先將gfp基因應用于玉米黑粉菌的標記，隨后GFP在真菌中得以廣泛應用。目前，綠色熒光蛋白基因已經被應用于真菌蛋白質及細胞器定位、致病性機理、生態學行為、細胞動力學及真菌的定殖情況進行檢測［7］。

植物內生真菌是指一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內部而不使植物患病的真菌或細菌［8］，目前已被廣泛研究的一種微生物資源［9］，通過與宿主植物的相互作用，表現豐富的生物學功能［10］。本研究選取了一株分離于盤錦紅海灘堿蓬組織的內生真菌JP4-1菌株，經鑒定其為小叢殼屬（Glomerella sp.），是一種絲狀真菌［11］。以往研究證明JP4-1菌株對水稻具有一定的促生長作用。本實驗參考肖榮鳳等［12-15］的真菌原生質體制備、再生與轉化的方法并加以改進，制備JP4-1菌株的原生質體并進行綠色熒光蛋白轉化標記，期望通過gfp基因的標記，探究菌株在水稻幼苗中的定殖情況，為內生真菌的促生作用機理研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 菌株JP4-1分離于遼寧省盤錦紅海灘堿蓬，由沈陽師范大學生命科學學院微生物學實驗室提供；pCT74質粒（保存于E. coli DH5α）由中國科學院北京微生物研究所贈送，含真菌pyrenophora ticirepentis的Tox A啟動子和潮霉素B（HmB）磷酸轉移酶基因（hygr）。

1.1.2 水稻種子 常規水稻遼星1號，由遼寧省稻作研究所提供。

1.1.3 培養基 LB培養基：酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL；馬鈴薯蔗糖培養基（PSB）：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、水1 000 mL；再生固體培養基：馬鈴薯200 g、山梨醇182 g、瓊脂20 g、水1 000 mL；再生半固體培養基：馬鈴薯200 g、山梨醇182 g、瓊脂10 g、水1 000 mL。上述培養基于120℃滅菌20 min，待用。

1.1.4 主要試劑 氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）；潮霉素B（Hygromycin，HmB）；山梨醇溶液（STC）：含1.2 mol/L山梨醇，10 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），50 mmol/L CaCl2；2×STC：含2 mol/L山梨醇，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），100 mmol/L CaCl2；0.8 mol/L NaCl、60% PEG4000；Hoagland營養液：含0.5 mol/L Ca（NO3）2、0.5 mol/L KNO3、0.25 mol/L MgSO4、0.2 mol/L KH2PO4；50 mmol/L H3BO3、0.6 mmol/L MnSO4、0.3 mmol/L CuSO4·5H2O、0.7 mmol/L ZnSO4·7H2O、0.6 mmol/L H2MoO4、0.6 mmol/L Na2MoO4、20 mmol/L Na-EDTA、20 mmol/L FeSO4·7H2O。

1.1.5 酶和引物 崩潰酶（Drislase，購自Sigma公司）；溶壁酶（Lysing Enzyme，購自廣東微生物所）；裂解液：含20 mg/mL崩潰酶和20 mg/mL溶壁酶，酶液用預冷的0.8 mol/L NaCl溶液配制，30℃，80 r/min震蕩溶解30 min，0.22 μm微孔過濾器除去雜質。GFP特異性引物［11］（P28：5'-TAGTGGACTGATTGG AATGCATGGAGGAGT-3'、P29：5'-GATAGAACCCAT GGCCTATATTCATTCAAT-3'）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株JP4-1對潮霉素B（HmB）的敏感性測定 分別在含有0、50、100、150、200、250、300、350和400 μg/mL HmB的PSA培養基上用點接法接種活化的JP4-1菌絲，25℃培養7 d，觀察菌絲的生長狀態，測量生長第7天的菌落直徑，以確定潮霉素B的最低抑菌濃度。

1.2.2 pCT74質粒的提取與驗證 接種攜帶pCT74質粒的載體E. coli DH5α菌液1 mL于50 mL含50 μg/mL Amp的LB培養基中，37℃，135 r/min震蕩培養24 h。用質粒快速抽提試劑盒提取質粒。利用GFP特異性引物P28、P29進行PCR擴增。反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，延伸 72℃ 60 s，共35個循環；延伸72℃ 10 min；4℃保存。8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提質粒，-20℃保存備用。

1.2.3 菌株 JP4-1原生質體的制備 接種JP4-1菌株于PSB培養基，120 r/min，25℃震蕩培養120 h，用移液器吸取3 mL菌液于50 mL PSB培養基，135r/min，25℃震蕩培養72 h。三層擦鏡紙過濾并收集菌絲，用0.8 mol/L預冷的NaCl溶液充分洗滌菌絲兩次。在50 mL無菌三角瓶中加入10 mL裂解液和約800 mg菌絲體，30℃，80 r/min作用2.5 h。三層擦鏡紙過濾并收集濾液于15 mL離心管，4 000 r/min離心10 min，棄上清。加入10 mL STC溶液洗滌沉淀，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀。用STC溶液調整原生質體濃度為2×107-3×107CFU/mL，立即轉化。

1.2.4 原生質體的轉化 取1 mL原生質體加入20 μg pCT74質粒，25 μL 2×STC，25 μL 60% PEG4000，室溫作用20 min，再加入1.2 mL 60% PEG4000，室溫作用5 min。加入4 mL STC溶液，3 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mL 2×STC懸浮。將所得溶液加入50 mL冷卻至50℃的含50 μg/mL Amp和200 μg/mL HmB的再生半固體培養基中，震蕩混勻，迅速倒入含有一層再生固體培養基的平板上，待凝固后25℃倒置培養，直至長出菌落。

1.2.5 轉化子菌株的熒光檢測及穩定性分析 選擇長在平板中央的第一代轉化子菌落，挑取邊緣菌絲置于熒光顯微鏡藍光波長下鏡檢。選擇具有熒光的菌落，接種于含200 μg/mL HmB和50 μg/mL Amp的PSA平板連續傳代3次，接種最后一代轉化子菌落于不含抗性的PSA平板并連續傳代3次。用熒光顯微鏡檢測每一代轉化子菌落的熒光穩定性。

1.2.6 轉化子對水稻幼苗的侵染與定殖檢測

1.2.6.1 菌株的液體培養 將具有熒光的轉化子菌株和野生型菌株分別接種于PSB培養基，130 r/min，25℃培養120 h。

1.2.6.2 水稻幼苗的培育與接種 取飽滿健康的水稻種子，加水沒過種子浸泡24 h，將種子平鋪于濕潤濾紙表面，覆蓋浸濕的六層紗布于暗處催芽48 h。取發芽的種子平鋪于覆蓋紗網并裝滿Hoagland營養液的塑料燒杯中央，于人工氣候培養箱培養。培養條件：第一階段：16 h，濕度80%，溫度28℃，光照100%；第二階段：8 h，濕度80 %，溫度26℃，光照0%。培養期間每天補充營養液。待水稻種子生根，加入上述培養轉化子菌絲球，繼續培養3-5 d。用野生型菌株處理的水稻幼苗作對照，以不加菌的水稻幼苗作空白對照。

1.2.6.3 轉化子菌株的定殖檢測 取水稻幼苗的根用1 N 鹽酸解離并壓片，同時，分別取水稻幼苗葉片和莖部，制成臨時裝片，于熒光顯微鏡下檢測菌株的定殖情況。分別取水稻幼苗的葉片、莖部和根部，進行常規石蠟切片制備，封片后，于熒光顯微鏡下檢測菌株的定殖位置。

1.2.7 轉化子和水稻幼苗中gfp基因的PCR檢測 用真菌基因組快速提取試劑盒分別提取野生型菌株基因組DNA和第6次傳代培養的轉化子基因組DNA，并標記為D-YJ和D-ZJ。分別取未被內生真菌侵染的水稻幼苗、被野生型菌株侵染的水稻幼苗和被轉化子侵染的水稻幼苗的根和葉，于液氮中研磨至勻漿狀，并用真菌基因組快速提取試劑盒提取其中的菌株DNA，分別標記為D-SD、D-WZ、D-Z-G和D-Z-Y，采用GFP特異性引物P28、P29對提取到的DNA樣品進行PCR擴增。反應條件為：預變性 95℃ 3 min；變性 95℃ 30 s，退火溫度55℃ 30 s，延伸 72℃ 60 s，共35個循環；延伸72℃ 10 min；4℃保存。8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以野生型菌株基因組作對照。

2 結果

2.1 菌株JP4-1對潮霉素B（HmB）的敏感性測定

JP4-1菌株的HmB敏感性試驗結果，見圖1。接種時的初始菌落直徑忽略不計，菌落生長第7天時，菌株JP4-1在含有150 μg/mL HmB的PSA平板上僅能微弱生長，在含有200 μg/mL HmB的PSA平板上不能生長，因此選擇該濃度為原生質體再生及轉化子菌株篩選的抗生素選擇壓。

圖1 JP4-1菌株的HmB敏感性測定

2.2 JP4-1菌株原生質體的制備與轉化

取酶解2.5 h 的菌絲觀察，可見JP4-1菌株的原生質體為大小不一的圓球形（圖2），其形成方式為頂端釋放。轉化子的菌落與野生型菌株的菌落差別不大。菌落白色，致密，如圖3所示。

圖2 JP4-1菌株的原生質體

圖3 轉化子菌株在含有200 μg/mL HmB的再生培養基的菌落形態

圖4 轉化子菌株的菌絲在熒光下的形態

2.3 轉化子的熒光穩定性分析

經觀察，轉化子的菌絲和孢子在藍光的激發下可以發出較強的綠色熒光。在含有HmB和Amp的PSA平板上連續傳代3次后，能繼續發出較強的綠色熒光。不含抗性的PSA平板上連續傳代3次仍能發出綠色熒光，發光強度保持穩定（圖4）。

2.4 轉化子對水稻幼苗的侵染與定殖檢測

取經轉化子處理培養的水稻幼苗根莖葉分別制片于熒光顯微鏡下檢測，結果（圖5）表明，在水稻幼苗的根部、莖部和葉部均可檢測到帶有綠色熒光的轉化子菌株。菌株定殖于水稻的細胞間隙。在野生型菌株處理的水稻幼苗和未加菌處理的水稻幼苗中，均未檢測到綠色熒光，水稻幼苗侵染實驗的結果（圖6）表明，轉化子和野生型菌株處理的水稻幼苗長勢均明顯優于空白對照組水稻幼苗長勢，轉化子和野生型菌株對水稻幼苗具有相似的促生長作用，證明gfp基因已成功標記菌株JP4-1并定殖于水稻幼苗組織內。

2.5 轉化子和水稻幼苗中gfp基因的PCR檢測

轉化子與水稻幼苗中的gfp基因的PCR檢測結果如圖7。通過對比野生型菌株（D-YJ）與轉化子（D-ZJ）的PCR結果可知，轉化子DNA經PCR擴增得到一條約417 bp的目的條帶，證明轉化成功。通過對比未侵染的水稻幼苗（D-SD）、野生型菌株侵染的水稻幼苗（D-WZ）和被轉化子侵染的水稻幼苗（D-Z-G、D-Z-Y）的PCR結果，未侵染水稻和用野生型菌株侵染的水稻中，均未獲得目的條帶，而被轉化子侵染的水稻幼苗（根、葉）均擴增出了約417 bp的目的片段，由此說明gfp基因已成功與菌株基因組整合表達，穩定遺傳。同時被gfp標記的轉化子侵染進入到水稻幼苗的根、莖和葉，JP4-1菌株為植物內生真菌。

3 討論

GFP具有穩定、便于觀察、不需添加外源底物就可以在活細胞中直接進行定位檢測等優點［12］，因此越來越多地被應用于真菌定殖標記。目前將gfp基因與真菌基因組整合的方法主要有原生質體轉化法、基因槍法和電激法［16-18］，與后兩種相比，原生質體轉化的方法不受昂貴實驗儀器的限制在實驗室條件下即可完成［18］。因此，本實驗選擇PEG-CaCl2介導的原生質體轉化方法。在原生質體制備的過程中，參考Souza等［19］的實驗，選擇目前比較常用的兩種酶液對菌絲體進行消化，實驗表明將不同濃度和種類的酶液混合制成裂解液處理新鮮菌絲相比于用單一酶液處理菌絲，菌株的原生質體在相同時間內得率較高，利于試驗的進一步進行。

圖5 水稻幼苗的根、莖、葉的顯微形態（40×）

圖6 轉化子菌株對水稻幼苗的促生長作用

圖7 轉化子菌株的PCR檢測

實驗結果表明，菌株在含有200 μg/mL HmB的PSA平板上基本不能生長，因此確定此HmB濃度為原生質體再生及轉化子菌株篩選的抗生素選擇壓。但是在原生質體再生的試驗過程中發現，在再生培養基中同時加入50 μg/mL的Amp作為 pCT74質粒的抗性篩選選擇壓會大大提高轉化的成功率。同時，實驗表明，在平板邊緣生長的轉化子一般未被成功轉入質粒，這與張俊［14］對芒果尖孢炭疽病原菌的綠色熒光蛋白標記的試驗結果一致。

在轉化子對水稻幼苗的侵染實驗中，經熒光顯微鏡檢測，被標記的菌株可以定殖于水稻幼苗的根部、莖部、葉部的細胞間隙。值得注意的是菌株在水稻幼苗的葉部主要定殖于氣孔及葉肉細胞。這與Souza等［20］的研究結果一致。該實驗結果進一步說明被標記的菌株具有遷移性，具備從根傳輸到莖及葉部的能力［21］。同時，實驗結果表明轉化子處理的水稻幼苗與野生型菌株對水稻幼苗的促生長作用沒有明顯差別，這說明菌株的定殖部位可能與菌株促生作用的機理有關。

4 結論

本實驗通過PEG-CaCl2介導的原生質體轉化方法，成功獲得了能夠穩定表達GFP的轉化子，通過gfp標記菌株對水稻幼苗的侵染，證明JP4-1菌株可以成功定殖于水稻組織細胞間隙。

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（責任編輯 馬鑫）

Labeling and Tracing of Green Fluorescent Protein in Fungal Endophyte with Growth-promoting Activity to Rice Seedlings

CHEN Nan YU Fei HE Yan-liu BU Ning
（College of Life Sciences，Shenyang Normal University，Shenyang 110034）

This work is to transform the gene of green fluorescent protein（gfp）into the fungal endophyte JP4-1 of Suaeda salsa，and to detect the colonization of the fungi in rice seedlings. The plasmid pCT74 with gfp was transformed into the protoplasts with PEG-CaCl2mediated method and then integrated with the strain for transformants. Further，the transformants was used to infect rice seedlings，and finally the tracer to JP4-1 and its infection characteristics were detected with fluorescence microscope. Results showed that the transformants were quite stable with promising green fluorescence intensity after six successive subcultures. PCR amplification showed that the gfp was successfully transformed into strain JP4-1 and was expressed stably in rice seedlings. In conclusion，the JP4-1 transformants with stably-expressed gfp was acquired via transformation，the JP4-1 was colonized in the roots，shoots and leaves of rice seedlings，the location of colonization was intercellular，and the growth-promoting activity showed no difference with the wild type.

fungal endophyte；green fluorescent protein；protoplasts；transformation；colonization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.015

2016-07-06

國家自然科學基金面上資助項目（31270369）

陳楠，女，碩士研究生，研究方向：資源與應用微生物；E-mail：1654613543@qq.com；于飛同為本文并列第一作者

卜寧，女，碩士生導師，研究方向：資源與應用微生物；E-mail：309226126@qq.com