2種含碘制劑《中華人民共和國藥典》（2015年版）微生物限度檢查方法的建立

劉文，張廣求，朱立剛

（1．黃岡市中心醫院藥劑科，湖北 黃岡 438000；2．黃岡市第二人民醫院藥劑科，湖北 黃岡 438000）

2種含碘制劑《中華人民共和國藥典》（2015年版）微生物限度檢查方法的建立

劉文1，張廣求1，朱立剛2

（1．黃岡市中心醫院藥劑科，湖北 黃岡 438000；2．黃岡市第二人民醫院藥劑科，湖北 黃岡 438000）

目的：建立2種含碘制劑（碘乳康口服溶液和復方碘口服溶液）的微生物限度檢查方法。方法：按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規定，以硫代硫酸鈉為中和劑，采用金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉等5種試驗菌株，進行需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法的適用性試驗，并進行控制菌大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗。結果：采用中和法，可消除抑菌成分碘的干擾，5種試驗菌株的回收比值均在0.5～2.0；控制菌大腸埃希菌可檢出。結論：建立的方法簡便可行，結果準確可靠，可用于這2種含碘制劑的微生物限度檢查。

碘乳康口服溶液；復方碘口服溶液；含碘制劑；《中華人民共和國藥典》（2015年版）；微生物限度檢查；硫代硫酸鈉

碘乳康口服溶液是黃岡市中心醫院的自制制劑，用于乳腺增生癥，安全性好，療效顯著。復方碘口服溶液調節甲狀腺功能，用于甲狀腺功能亢進的術前準備[1]。2種制劑均主要由碘、碘化鉀組成，由于碘具強有力的消毒防腐作用，能殺死細菌、霉菌[2]，文獻[3]亦證實碘注射液中的碘有抑菌作用。筆者曾采用培養基稀釋法，較好地消除了碘乳康口服溶液中抑菌成分碘的干擾[4]。文獻[5-6]采用淀粉吸附或淀粉吸附與薄膜過濾相結合的方法，分別消除聚維酮碘泡騰片、聚維酮碘溶液中碘的抑菌活性。

根據《中華人民共和國藥典》（2015年版）[7]規定，對這2種含碘制劑進行微生物限度檢查時，應先消除供試品中碘的抑菌活性，再依法進行檢查，以保證方法的適用性。本文利用硫代硫酸鈉能將碘分子還原為無抑菌作用的碘離子，消除了碘的抑菌作用，建立了2種含碘制劑有效的微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高壓蒸汽滅菌器（上海三申醫療器械有限公司）；DB-102-1型電熱干燥箱（武漢市武昌實驗儀器廠）；HHB11420電熱恒溫培養箱（湖北省黃石市醫療器械廠）；LRH-250B生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；HSGIC-2型電熱恒溫水浴箱（浙江臨海市東方儀器廠）；SZK202凈化工作臺（蚌埠凈化設備廠）；BSC-1300ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；FA1604型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；YJK015菌落計數器（江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 供試品

碘乳康口服溶液（批準文號：鄂藥制字H20110227，批號：160319，160407，160421）、復方碘口服溶液（批準文號：鄂藥制字H20110213，批號：160128，160307，160425），均為黃岡市中心醫院自制。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均為第2代冷凍保藏菌株，由湖北省食品藥品監督檢驗研究院提供。

1.4 培養基及試劑、稀釋劑

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：20150802），胰酪大豆胨液體培養基（批號：20150722），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：20150919），沙氏葡萄糖液體培養基（批號：20150226），麥康凱瓊脂培養基（批號：20150708），麥康凱液體培養基（批號：20150624），均由青島高科園海博生物技術有限公司生產。蛋白胨（北京三藥科技開發公司，批號：150320）。硫代硫酸鈉、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鈉、氯化鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液[4]取磷酸二氫鉀3.56 g、無水磷酸氫二鈉5.77 g、氯化鈉4.30 g、蛋白胨1.00 g，加純化水1 000 mL，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌，備用。

2.1.2 中和劑溶液取硫代硫酸鈉0.3 g、7 g，分別加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至1 000 mL，微溫溶解，滅菌，制成含0.03%硫代硫酸鈉的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱中和劑溶液A）、含0.7%硫代硫酸鈉的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（以下簡稱中和劑溶液B）。

2.1.3 供試品溶液取碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液各10 mL，分別加中和劑溶液A、中和劑溶液B至100 mL，搖勻，制成1∶10的碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液供試液，備用。

2.2 菌懸液的制備

按《中華人民共和國藥典》（2015年版）四部規定，取經30～35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的胰酪大豆胨液體培養物，或經20～25℃培養2～3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養物，分別用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數為3 000～10 000 cfu/mL的菌懸液，備用。

取經20～25℃培養5～7天的黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養物，加含0.05%（mL / mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液3～5 mL，將孢子洗脫，用管口帶有薄無菌脫脂棉的無菌毛細吸管，吸取孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（mL / mL）聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，制成含菌數為3 000～10 000 cfu/mL的黑曲霉孢子懸液，備用。

2.3 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法的適用性試驗

2.3.1 試驗組分別取“2.1.3”項下制備的1∶10碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液供試液9.9 mL于滅菌試管中，加“2.2”項下制備的金黃色葡萄球菌菌懸液0.1 mL，充分混勻，使每1 mL供試液中含試驗菌不大于100 cfu，同法制備每1 mL含枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉不大于100 cfu的供試液。分別取1 mL注入2個直徑90 mm無菌平皿中，立即傾注不超過45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養基，用于需氧菌總數計數。再分別取含白色念珠菌、黑曲霉的供試液1 mL注入2個直徑90 mm無菌平皿中，立即傾注不超過45℃融化的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，用于霉菌和酵母菌總數計數。輕輕搖勻，待凝固后倒置，含每株試驗菌的供試液各平行制備2個平皿。需氧菌置33℃培養3～5 d，霉菌和酵母菌置23℃培養5～7 d，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數，以平均菌落數作為計數結果。

2.3.2 供試品對照組取“2.1.3”項下制備的1∶10碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液供試液9.9 mL于滅菌試管中，分別加“2.1.2”項下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 0.1 mL，充分混勻，同試驗組操作，測定供試品中的菌落數。

2.3.3 菌液對照組取“2.1.1”項下制備的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，分別加入“2.2”項下制備的5種試驗菌菌懸液0.1 mL，充分混勻，同試驗組操作，測定菌液中的菌落數。

2.3.4 中和劑對照組取“2.1.2”項下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 9.9 mL于滅菌試管中，分別加入“2.2”項下制備的5種試驗菌菌懸液0.1 mL，充分混勻，同試驗組操作，以確認中和劑對試驗菌無毒性。

2.3.5 結果碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液的5種試驗菌株各進行3次獨立的平行試驗，計算回收比值：

試驗組的回收比值＝（試驗組平均菌落數－供試品對照組平均菌落數）/ 菌液對照組平均菌落數，

回收比值均在0.5～2[7]。

中和劑對照組的回收比值＝中和劑對照組的平均菌落數 / 菌液對照組平均菌落數，

回收比值均在0.8～1.2，見表1。

2.4 控制菌大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗

2.4.1 大腸埃希菌菌液的制備取經30～35℃培養18～24 h的大腸埃希菌的胰酪大豆胨液體培養物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌數不大于100 cfu/mL的菌懸液，備用。

2.4.2 供試品組取“2.1.3”項下制備的碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液供試液10 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養基100 mL中，作為供試品組。

2.4.3 試驗組取“2.1.3”項下制備的碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液供試液10 mL和“2.4.1”項下制備的含菌數不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液1 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養基100 mL中，作為試驗組。

2.4.4 中和劑對照組取“2.1.2”項下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 10 mL和“2.4.1”項下制備的含菌數不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌菌懸液1 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養基100 mL中，作為中和劑對照組。

2.4.5 陰性對照組取“2.1.2”項下制備的中和劑溶液A、中和劑溶液B 10 mL，分別加入到胰酪大豆胨液體培養基100 mL中，作為陰性對照組。

上述各培養物置33℃培養24 h，分別取培養物1 mL，接種至100 mL麥康凱液體培養基中，置43℃培養48 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，置33℃培養24 h，判斷是否檢出大腸埃希菌。

2.4.6 結果供試品組、陰性對照組均未見有菌生長，試驗組、中和劑對照組麥康凱液體培養基均渾濁，麥康凱瓊脂培養基平板上均有菌落生長，經分離、純化，鑒定為大腸埃希菌。

表明該方法消除了抑菌成分碘的干擾，且中和劑對試驗菌大腸埃希菌無毒性，適用于碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液的大腸埃希菌檢查見表2。

2.5 3批樣品的微生物限度和控制菌檢查

取供試品，分別按“2.1.3”項下方法制備供試液，依法檢查，2種含碘制劑的微生物限度檢查結果見表3。

表2 大腸埃希菌檢查方法的適用性試驗結果

表3 微生物限度檢查結果

3 討論

《中華人民共和國藥典》（2015年版）微生物限度檢查培養體系在培養基、培養溫度、培養時間等方面都做了較大修訂，與國際通用標準高度一致[8]，采用更優良的廣譜培養基，有利于受損微生物的修復及生長，提高了方法的靈敏度。將試驗菌加入供試液中模擬樣品污染微生物，進行方法適用性試驗，取消了稀釋劑對照組，結果判定以變化范圍進行規定，符合微生物計數規律，結果更為準確。微生物計數法中，按微生物的培養條件來區分，將細菌數及霉菌和酵母菌數，修訂為需氧菌總數及霉菌和酵母總數。需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數，包括真菌菌落數；霉菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數，包括細菌菌落數。

碘與硫代硫酸鈉在中性或弱酸性溶液中，發生氧化還原反應，生成無抑菌作用的連四硫酸鈉和碘化鈉：

I2＋2Na2S4O6＝ Na2S4O6＋2NaI。

由化學反應方程式得知，1 moL碘（I）與1 moL硫代硫酸鈉相當，即中和100 mL碘乳康口服溶液1∶10溶液，需消耗硫代硫酸鈉0.022 g；中和100 mL復方碘口服溶液1∶10溶液，需消耗硫代硫酸鈉0.623 g。試驗結果表明，在所用的中和劑溶液A、中和劑溶液B中，加入一定量的中和劑硫代硫酸鈉，能分別有效中和碘乳康口服溶液、復方碘口服溶液供試品溶液中的碘，且中和劑、中和產物對試驗菌的生長無干擾。此法作為碘乳康口服溶液和復方碘口服溶液的微生物限度檢查方法，較好地消除了碘的抑菌作用，簡化了試驗操作，提高了工作效率，保證了方法的科學性和檢查結果的準確可靠。

[1] 湖北省食品藥品監督管理局.湖北省醫療機構制劑規范(2011年版)[S].武漢:湖北科學技術出版社,2012:318-319.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知(化學藥和生物制品卷)[M].北京:人民衛生出版社,2005:859.

[3] 張廣求.碘注射液無菌檢查方法學驗證[J].中國醫院藥學雜志,2010,30(2):165-166．

[4] 張廣求,劉文,田祥學.碘乳康口服溶液微生物限度檢查方法學驗證[J].中國執業藥師,2015,12(8):10-13.

[5] 王立華,楊誼,馬靖,等.含碘藥物控制菌檢查方法的探討[J].中國藥事,2000,14(5):310-311.

[6] 徐雄利,林永麗,劉玉明,等.聚維酮碘溶液的微生物限度檢查[J].海軍醫學雜志,2007,28(4):326-327.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部) [S].北京:中國醫藥科技出版社,2015:140-151.

[8] 楊曉莉,李輝,馬英英,等.《中華人民共和國藥典》(2015年版)非無菌產品微生物限度檢查:控制菌檢查法解讀與對策[J].中國藥師,2016,19(4):748-752.

本文編輯：蘇日力嘎

Establishment of a Microbial Limit Test Method for Two Iodine Preparations in Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition)

Liu Wen1, Zhang Guang-qiu1, Zhu Li-gang2
(1. Department of Pharmacy, Huanggang Central Hospital, Hubei Huanggang 438000, China; 2.Department of Pharmacy, The Second People’s Hospital of Huanggang City, Hubei Huanggang 438000, China)

Objective：The establish a microbial limit test method for two iodine preparations (oral dianrukang solution and oral compound iodine solution).Methods：According to the requirements in Chinese Pharmacopoeia (volume Ⅳ, 2015 edition), the method for counting of total aerobic bacteria, yeast and mould as well as the test method for E. coli were verf ed for suitability with f ve test bacteria, i.e. Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans and A. niger, using sodium thiosulfate as a neutralizing agent.Results：The interference of iodine as a antibacterial component was eliminated by neutralization method. All the recovery ratios of f ve test bacterial strains were 0. 5 ～ 2. 0; E. coli as a control bacterium could be detected.Conclusion：The established method is simple, feasible, accurate and reliable, which may be used for the microbial limit test for the two iodeine preparations.

Oral Dianrukang Solution; Oral Compound Iodine Solution; Iodine Preparation; Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition); Microbial Limit Test; Sodium Thisulfate

R286.0

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.004

2016 - 08 - 22

劉文,男，副主任藥師。研究方向：醫院藥學。E-mail：liuwen.cn@163.com

張廣求,男，副主任藥師。研究方向：醫院藥學，藥物分析。E-mail：ccnpa@163.com