高效液相色譜法測定慢肝福丸中丹參酮ⅡA的含量

張秋紅，于姍姍

（1．濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102；2．濟南市食品藥品檢驗檢測中心中藥檢驗科，山東 濟南 250102）

高效液相色譜法測定慢肝福丸中丹參酮ⅡA的含量

張秋紅1，于姍姍2

（1．濟南市食品藥品檢驗檢測中心，山東 濟南 250102；2．濟南市食品藥品檢驗檢測中心中藥檢驗科，山東 濟南 250102）

目的：建立測定慢肝福丸中丹參酮ⅡA含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱為Welchrom-C18柱，流速為1.0 mL/min，以甲醇-水（80∶20，V/V）為流動相，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃，進樣量為20 μL。結果：丹參酮ⅡA進樣量在0.02～0.20 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系（r＝0.999 9）；精密度、重復性、中間精密度、穩定性試驗的相對標準色差（RSD）均小于1%，平均加樣回收率為98.60%，RSD為1.98%（n＝9）。結論：該方法結果可靠、準確，靈敏度高，操作簡單，重復性好，可用于慢肝福丸的質量控制。

慢肝福丸；丹參酮ⅡA；高效液相色譜法；含量測定

慢肝福丸是由現代中醫處方發展而來的中藥復方制劑，由丹參、龜甲、青皮等23味中藥組成。每味中藥粉碎成細粉，過100目篩，混勻，裝入專用消毒箱內，用鈷-60射線照射滅菌后，每100 g粉末加入煉蜜100～110 g，混勻后制成大蜜丸，藥用PVC包裝，即得。具有增強免疫，抑制病毒復制，抑制肝臟結締組織增生，提高血漿蛋白的功效，可用于治療慢性肝炎、肝硬化。該復方中藥制劑尚未有定量測定研究，為確保療效、保證產品質量，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法對慢肝福丸中的丹參酮ⅡA進行測定，為該制劑質量標準的制定提供依據[1-8]。

1 材料

1.1 儀器

采用戴安 UltiMate 3000高效液相色譜儀，配 UltiMate 3000 Pump，UltiMate 3000 Column Compartment，UltiMate 3000 Variable Wavelength Detector（美國戴安）；KUDOS SK250H 型超聲波清洗器（上海科導）；Sartorius BP211D 型電子分析天平（德國賽多利斯）；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式真空泵（鞏義予華儀器）。

1.2 藥品與試劑

慢肝福丸（中國人民解放軍第一五零中心醫院，批號：140620，140822，140315）；丹參酮ⅡA（批號：110766-20061）由中國食品藥品檢定研究院提供；磷酸（優級純，天津科密歐）；甲醇（色譜純、分析純，國藥集團）；純凈水（杭州娃哈哈）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適應性試驗

色譜柱：C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，Welchrom）；流動相：甲醇-水（80∶20，V/V）；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min。在此條件下，丹參酮ⅡA分離效果良好，理論板數按丹參酮ⅡA峰計算應不低于2 000，分離度不低于2.0。

分別吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μL，按上述色譜條件測定，記錄色譜峰。結果丹參酮ⅡA的保留時間在17.5 min左右，樣品峰與其他組分之間的分離度大于2.0，陰性樣品對丹參酮ⅡA檢測無干擾。見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液取丹參酮ⅡA對照品10.0 mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得對照品貯備液（0.1 mg/mL）；精密移取1 mL，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（10.0 μg/mL）。

2.2.2 供試品溶液取本品約9.0 g，剪碎，精密稱重，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1.5 h，放冷，加甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液按處方比例法配制除丹參以外的陰性樣品，按“2.2.1”的方法制備丹參陰性樣品溶液。

2.3 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”中的對照品溶液（10.0 μg/mL）1 mL，2 mL，4 mL，6 mL，8 mL，10 mL，置10 mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，進樣20 μL，注入色譜儀，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得丹參酮ⅡA的回歸方程為：

Y＝101.1X＋0.743 1，

r＝0.999 9（n＝6）。

結果表明，在0.02～0.20 μg范圍內，丹參酮ⅡA的進樣量與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

精密吸取丹參酮ⅡA對照品溶液（10.0 μg/mL），于測定條件下重復進樣6次，每次進樣20 μL。以丹參酮ⅡA峰面積計算其RSD，計算結果為1.0%，結果表明儀器的精密度良好。

圖1 丹參酮ⅡA的含量測定HPLC色譜圖

2.5 重復性試驗

精密稱取慢肝福丸（批號：140620）共6份，按“2.2.2”的方法制備平行供試品溶液6份，分別取供試品溶液20 μL，按“2.1”的色譜條件測定，按外標法計算樣品含量。結果測得樣品中丹參酮ⅡA的平均含量為0.327 7 mg/丸，RSD為0.6%。表明本方法重現性符合要求。

2.6 中間精密度試驗

取慢肝福丸（批號：140620）9份，每份1丸，由不同人員按“2.2.2”方法分別制備供試品溶液，每人3份，9份供試品溶液分別進樣20 μL，測定峰面積，并計算樣品中的丹參酮ⅡA含量之間的RSD值。結果樣品中測得丹參酮ⅡA含量之間的RSD為0.8%，表明本方法中間精密度良好。

2.7 穩定性試驗

精密稱取慢肝福丸（批號：140620），分別按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，10，24 h進樣20 μL，記錄峰面積。結果丹參酮ⅡA峰面積的RSD為0.8%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的慢肝福丸9份（批號：140620，丹參酮ⅡA含量為0.327 7 mg/丸），按表1分別精密加入丹參酮ⅡA對照品貯備液（0.1 mg/mL），按“2.2.2”的方法制備供試品溶液，并在規定的色譜條件下測定，并計算加樣回收率。見表1。

2.9 樣品測定

取3批慢肝福丸，分別按“2.2.2”方法處理樣品及測定，每一批進樣量為20 μL，進樣6次，求平均含量。見表2。

表1 丹參酮ⅡA加樣回收率試驗 （n＝9）

表2 3批慢肝福丸中丹參酮ⅡA的含量

由表2可見，三批樣品測得的丹參酮ⅡA含量分別為0.327 7，0.322 2，0.323 4 mg/丸，其均值0.324 4 mg/丸，取其80%作為本標準的含量下限，即每丸中含丹參以丹參酮ⅡA（C19H18O3）計算，不得少于259.5 μg。

3 討論

3.1 流動相及提取溶劑種類的選擇

根據文獻[9-16]將其流動相確定為甲醇-水（80∶20，V/V），選擇甲醇為溶劑進行提取。

3.2 提取方法的考察

加熱回流提取法：取本品約9.0 g（批號：140620），剪碎，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，加甲醇補足缺失的質量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

超聲提取法：取本品約9.0 g（批號：140620），剪碎，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取（功率300 W，頻率50 Hz）1 h，放冷，加甲醇補足缺失的質量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

對上述兩種方法所制得的供試品溶液，按“2.1”的色譜條件測定，結果表明，加熱回流提取法提取丹參酮ⅡA所得的含量明顯高于超聲提取法，故選回流提取法作為供試品溶液的制備方法。

3.3 提取時間的考察

取本品約9.0 g（批號：140620），剪碎，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流0.5，1.0，1.5 h，放冷，加甲醇補足缺失的質量，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。按“2.1”的色譜條件測定，結果1.5 h提取丹參酮ⅡA的含量明顯高于0.5 h，1.0 h，但與2.0 h相差不大，故選擇1.5 h作為供試品的提取時間。

綜上所述，該HPLC測定丹參酮ⅡA的方法操作簡單，靈敏度高，重復性好，結果可靠、準確，可用于慢肝福丸的質量控制。

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本文編輯：張鈺

Determination of TanshinoneⅡAContent in Manganfu Pills by HPLC

Zhang Qiu-hong1, Yu Shan-shan
(1. Jinan Food and Drug Inspection Center, Shandong Jinan 250102, China; 2. Department of Clinical Laboratory of Chinese Medicine, Jinan Food and Drug Inspection Center, Shandong Jinan 250102, China）

Manganfu Pills; TanshinoneⅡA; HPLC; Content Determination

R286.0

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.006

2016 - 09 - 20

張秋紅，女，碩士，副主任藥師。研究方向：中藥質量控制與資源研究。通訊作者E-mail：zhangqh9886@163.com

于姍姍，女，碩士，主管藥師。研究方向：中藥質量控制。E-mail：yssyb@126.com

【Abstranct】Objective：To develop a method for determination of tanshinoneⅡAcontent in manganfu pills.Methods：HPLC method was adopted on a Welchrom-C18column at a f ow rate of 1. 0 mL/min using methanol-water (80︰20, V/V) as mobile phase. The detection wavelength was 270 nm, while the column temperature was 30℃, and the sample load was 20 μL.Results：The linear range of tanshinone ⅡAwas 0.02～0.20 μg (r＝0.999 9). All the RSDs of precision, reproducibility, intermediate precision and stability test results were less than 1%. The average recovery of samples was 98.60%, with a RSD of 1.98% (n＝9).Conclusion：The method is reliable, accurate, sensitive, simple, and reproducible, which may be used for the quality control of manganfu pills.