單針藻的化學成分及其體外抗菌、抗氧化活性研究Δ

趙震宇，羅寧，陳晨，李昂，馬莎莎，劉積光，王孟，劉平懷（海南大學材料與化工學院/海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室，?？?570228）

·實驗研究·

單針藻的化學成分及其體外抗菌、抗氧化活性研究Δ

趙震宇＊，羅寧，陳晨，李昂，馬莎莎，劉積光，王孟，劉平懷#（海南大學材料與化工學院/海南大學熱帶作物種質資源保護與開發利用教育部重點實驗室，?？?570228）

目的：研究單針藻的化學成分，并對其中分離出的化合物進行體外抗菌、抗氧化活性考察。方法：對單針藻乙醇提取物經石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，利用硅膠柱色譜、高效液相色譜、氣相色譜-質譜法對單針藻乙酸乙酯部位萃取物進行分離和化學成分分析，并根據理化性質和核磁共振譜等分析鑒定化合物的結構；對分離出的4種化合物分別采用刃天青法測定其對銅綠假單胞菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌的最低抑菌濃度（MIC），1，1-二苯基-2-苦基-肼基（DPPH）法測定自由基清除率[以半數清除濃度（IC50）計]、亞鐵還原能力法（以FRAP值計）測定總還原能力。結果：從單針藻乙酸乙酯萃取部位的E4、E5段分離得到化合物1～6，分別被鑒定為豆甾醇、鄰苯二甲酸二丙酯、3-吲哚甲酸、黑麥草素、黑麥草內脂、5-羥基-3，4-二甲基-5-戊基-2（5H）-呋喃酮；化合物3～6的MIC在10～500μg/mL內，IC50在22.02～71.01μg/mL內，FRAP值在（62.04±5.36）～（281.22±8.3）μmol/L內。結論：單針藻含有多種脂類和烷酸類物質，具有一定的體外抗菌、抗氧化活性。

單針藻；乙酸乙酯部位；萃取物；化學成分；鑒定；抗菌；抗氧化

單針藻（Monoraphidium dybowskii）屬于綠藻門單針藻屬。單針藻具有生長速度快、生物量高、油脂含量高等優點，文獻表明其藻粉中含有豐富的油脂、粗纖維、蛋白質、多糖和色素，并含有較高含量的鎂、鈣、鋅、鐵等礦物質元素[1]。

目前對單針藻的研究主要集中在培養及采收方面[2]，而對其化學成分、活性等研究尚未見文獻報道。故筆者以單針藻（C29）為研究對象，較系統性地分析單針藻乙酸乙酯部位的化學成分并考察其抗菌、抗氧化活性，為單針藻在醫藥領域的開發與利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

P230高效液相色譜儀（遼寧省大連依利特公司）；xMark酶標儀（美國Bio-Rad公司）；RV10旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；Hp6890/5973MSD氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）儀（美國惠普公司）；Varian Unity600核磁共振（NMR）儀（美國Varian公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

樣品采集自海南省儋州市寶島新村，由海南大學材料與化工學院生物工程實驗室經細胞形態學及分子生物學鑒定為單針藻Monoraphidium dybowskii，經培養、絮凝采收、冷凍干燥處理后制成藻粉，放入－40℃冰箱備用；頭孢他啶注射液（山東羅欣藥業集團股份有限公司，批號：H20080170，純度：95%）；1，1-二苯基-苦基-肼基（DPPH，英國Johnason Matthey公司，批號：MFCD-00007231，純度：96%）；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT，廣州化學試劑廠，批號：MCFD00026300，純度：98%）；維生素C[VC，阿拉丁（上海）有限公司，批號：MFCD-00064328，純度：98%]；其他試劑均為國產分析純。

1.3 菌株

銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）、白色念珠菌（M.albican）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、大腸埃希菌（E.coli）均來自海南大學材料與化工學院生物工程實驗室。

2 方法與結果

2.1 單針藻浸膏提取

稱取單針藻粉3 kg，用5倍體積無水乙醇連續浸泡5次，每次5 d，每天攪拌浸泡液3～5次，浸提液經減壓濃縮得無醇味乙醇提取物。將干燥后的乙醇提取物305 g分散于去離子水中成懸浮液，再采用極性由小到大的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，得石油醚萃取物（PE）200 g、乙酸乙酯萃取物（EA）110 g、正丁醇萃取物（NA）11 g和水相萃取物（WH）18 g。

2.2 乙酸乙酯部位浸膏的分離與鑒定

2.2.1 分離、鑒定方法 選取抗菌及抗氧化活性較強的EA裝入硅膠層析柱中，以石油醚-乙酸乙酯（100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、30∶70、0∶100）進行梯度洗脫，獲得E1～E10共10個流分，其中E1為黃色油狀物，E2為淡黃色固體，E3為棕黃色油狀物。對其進行GC-MS分析。洗脫部分通過硅膠柱色譜、高效液相色譜等手段，對E4和E5再次進行分離，用石油醚-乙酸乙酯進行洗脫。采用薄層色譜法對所得流分進行合并，由于E6～E10含量過少，難以進行化合物分離，所以本文將不對這5個流分進行進一步分析。通過半制備高效液相色譜儀，從E4中分離出化合物1（4.7 mg）、化合物2（4.5 mg）[條件：甲醇-水（70∶30），流速為3.0 mL/ min]；從E5中分離出化合物3（14.5 mg）、化合物4（31.7mg）、化合物5（29.3 mg）和化合物6（18.0 mg）[條件：甲醇-水（85∶15），流速為3.0 mL/min]。脂溶性成分采用GC-MS進行分析，經面積歸一法測得各組分的相對含量，并對其成分采用MS、1H-NMR、13C-NMR等進行鑒定。GC條件：石英毛細管柱HP-FFAP（0.25 mm×30 m，0.25μm）；程序升溫從160開始，以6℃/min升至250℃，保持5 min；載氣為He，柱流量為1.0 mL/min；進樣口溫度為250℃，分流比為50∶1。MS條件：電子轟擊離子源，電離電壓70 eV，電子源溫度230℃，掃描范圍10～500 aum，進樣量1.0μL。

2.2.2 乙酸乙酯部位脂溶性成分E1～E3的GC-MS分析 從單針藻乙酸乙酯部位共獲得3份脂溶性成分E1～E3，經GC-MS分析后顯示，E1和E2成分基本相同，主要成分為酯類，其次是烷烴類、硅氧烷類和烯烴類；酯類中主要以十六碳和十八碳脂肪酸為主，適合作生物柴油的原料；硅氧烷類可以用于防火劑和潤滑劑等。由于E1與E2在醫藥方面應用不大，故本文只對E3進行分析。E3分析結果見表1。

表1 單針藻乙酸乙酯部位脂溶性E3成分分析結果Tab 1 Analysis result of fat-soluble component E3 in ethyl acetate extract from M.dybowwskii

由表1結果看出，從E3中共分離鑒定出9種化合物，占總含量的99.78%，其主要成分為烷酸類（97.08%）、酯類（2.28%），還含有少量的膽固醇（0.20%）和豆甾醇（0.22%）。

2.2.3 E4～E5分離出的化合物鑒定 對E4～E5分離出的6個化合物通過MS、NMR等方法鑒定其結構，結果分別為豆甾醇（化合物1，4.7 mg）、鄰苯二甲酸二丙酯（化合物2，4.5 mg）、3-吲哚甲酸（化合物3，14.5 mg）、黑麥草素（化合物4，31.7 mg）、黑麥草內酯（化合物5，29.3 mg）和5-羥基-3，4-二甲基-5-戊基-2（5H）-呋喃酮（化合物6，18.0 mg）。

化合物1：白色針狀結晶，易溶于甲醇；EI-MS：412.4（M+），351.3，300.2，255.2，207.0，133.1，97.1，55.2；1HNMR（C6D6，600 MHz）δ：5.45（1H，m，H-6），5.31（1H，dd，J＝16.14，7.03 Hz，H-22），5.15（1H，dd，J＝15.75，5.87 Hz，H-23），3.55（1H，m，H-3），1.25，1.15，1.12，1.03，1.01，0.96（6個CH3）。化合物1的數據與文獻[3]報道一致，故鑒定化合物1為豆甾醇。

化合物2：無色油狀物，易溶于甲醇；1H-NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.72（2H，dd，J＝8.7，3.0 Hz，H-2，H-5），7.53（2H，m，H-3，H-4），4.30（2H，m，H-1′，H-1″），1.72（4H，s，H-2′，H-2″），0.97（6H，s，H-3′，H-3″）；13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：167.9（C-7，C-8），132.5（C-1，C-6），131.1（C-2，C-5），129.1（C-3，C-4），65.7（C-1′，1″），29.9（C-2′，C-2″），13.9（C-3′，C-3″）?；衔?的數據與文獻[4]報道一致，故鑒定化合物2為鄰苯二甲酸二丙酯。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇；1H-NMR（DMSO-d6，800 MHz）δH：10.92（1H，s，3-COOH），8.47（1H，brs，NH），7.60（1H，d，J＝7.7 Hz，H-4），7.33（1H，d，J＝8.0 Hz，H-7），7.17（1H，s，H-2），7.06（1H，t，J＝7.4 Hz，H-5），6.98（1H，t，J＝7.3 Hz，H-6）；13C-NMR（DMSO-d6，200 MHz）δC：167.5（s，3-COOH），136.1（s，C-7a），127.1（s，C-3a），124.0（d，C-2），121.0（d，C-6），118.5（d，C-5），118.3（d，C-4），111.4（d，C-7），109.2（s，C-3）?；衔?的數據與文獻[5]報道一致，故鑒定化合物3為3-吲哚甲酸。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇；1H-NMR（CD3OD，800 MHz）δH：5.77（1H，s，H-3），4.09（1H，m，H-6），2.46（1H，ddd，J＝11.7，3.9，2.2 Hz，H-7a），2.00（1H，ddd，J＝13.0，4.2，2.2 Hz，H-5a），1.58（3H，s，H-8），1.41（1H，t，J＝11.7 Hz，H-7b），1.30（3H，s，H-9），1.28（3H，s，H-10），1.28（1H，overlap，H-5b）；13C-NMR（CD3OD-d6，200 MHz）δC：184.5（s，C-3a），174.5（s，C-2），114.2（d，C-3），89.1（s，C-7a），65.7（d，C-6），51.2（t，C-5），49.8（t，C-7），36.6（s，C-4），30.8（q，C-8），26.3（q，C-9），25.8（q，C-10）?；衔?的數據與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物4為黑麥草素。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇；1H-NMR（CD3OD，800 MHz）δH：5.75（1H，s，H-3），4.22（1H，m，H-6），2.43（1H，dt，J＝13.8，2.6 Hz，H-5a），2.00（1H，dt，J＝14.3，2.6 Hz，H-7a），1.76（3H，s，H-10），1.75（1H，dd，J＝13.8，3.9 Hz，H-5b），1.53（1H，dd，J＝14.3，3.6 Hz，H-7b），1.46（3H，s，H-8），1.27（3H，s，H-9）；13C-NMR（CD3OD-d6，200 MHz）δC：186.3（s，C-3a），175.0（s，C-2），113.8（d，C-3），89.5（s，C-7a），67.7（d，C-6），48.4（t，C-5），46.9（t，C-7），37.7（s，C-4），31.5（q，C-8），27.9（q，C-9），27.5（q，C-10）?；衔?的數據與文獻[6]報道一致，故鑒定化合物5為黑麥草內酯。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇；1H-NMR（CD3OD，800 MHz）δH：1.92（3H，d，J＝1.0 Hz，H-11），1.78（3H，d，J＝8.4 Hz，H-12），1.84（2H，m，H-6），1.29（4H，overlap，H-8/9），1.18（2H，m，H-7），0.88（3H，t，J＝7.2 Hz，H-10）；13C-NMR（CD3OD-d6，200 MHz）δC：175.1（s，C-2），160.9（s，C-4），126.2（s，C-3），109.7（s，C-5），37.4（t，C-6），33.2（t，C-7），24.3（t，C-8），24.0（t，C-9），14.8（q，C-10），11.3（q，C-11），8.7（q，C-12）?；衔?的數據與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物6為5-羥基-3，4-二甲基-5-戊基-2（5H）-呋喃酮。

2.3 體外抗菌、抗氧化活性測定

2.3.1 測定方法 以頭孢他啶為陽性對照，根據文獻[8]的方法，采用刃天青法對4種含量較高的化合物（化合物3、4、5、6）進行抗菌（銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌）活性測定，計算最低抑菌濃度（MIC）。將樣品稀釋成500、250、175、100、50、25、10、5、1μg/mL，并連同刃天青溶液加入至96孔板中培養的菌液中進行試驗。

以BHT、VC為陽性對照，根據文獻[9]的方法，采用DPPH法測定自由基清除率，將樣品稀釋成200、150、100、75、50、20、10、2μg/mL系列質量濃度，并根據公式：清除率（%）＝（A0－A樣品）/A0×100%（A0為空白對照吸光度，A樣品為樣品的吸光度），計算化合物3、4、5、6對自由基的清除率、半數清除濃度（IC50）；參照文獻[10]的方法，采用亞鐵還原能力法[以FRAP（Ferric reducing antioxidant potential assay）值計]測定總還原能力，化合物3、4、5、6用甲醇溶解并制備成1 mg/mL，按下式計算總還原能力：A＝0.001 46T+0.119 42（R2＝0.993 55）（A為吸光度，T為FRAP值）。

2.3.2 4種化合物的體外抗菌活性測定結果 各樣品對4株菌的MIC結果見表2。

表2 各樣品對4株菌的MIC結果（μg/mL）Tab 2 MIC of samples on 4 strains（μg/mL）

由表2可見，對枯草芽孢桿菌和白色念球菌的抑制作用以化合物3最強，MIC分別為10μg/mL和175μg/mL；對銅綠假單胞菌的抑制作用以化合物4最強，MIC為25 μg/mL；對大腸埃希菌的抑制作用以化合物6最強，MIC為100μg/mL。

2.3.3 4種化合物的體外抗氧化活性測定結果 （1）自由基清除率。各樣品的DPPH清除率、IC50測定結果見表3。

由表3可見，各樣品對DPPH自由基清除能力的強弱以IC50判斷從大到小為VC＞BHT＞化合物3＞化合物5＞化合物4＞化合物6。其中化合物3的IC50在4種化合物中最低，表明其對DPPH自由基的清除能力最強；化合物3和5次之，化合物6對DPPH自由基的清除能力最弱。

表3 各樣品的DPPH清除率、IC50、FRAP值Tab 3 DPPH clearance rate，IC50and FRAPof sample

（2）總還原能力。各樣品的FRAP值測定結果見表3。

由表3可見，陽性對照VC和BHT均具有很強的還原能力，4種化合物也均表現出一定的還原能力；4種化合物中以化合物3的還原能力最強，化合物6的還原能力最弱，二者FRAP值分別為（281.22±8.3）、（62.04± 5.36）μmol/L。6種樣品的FRAP值從高到低排序為VC＞BHT＞化合物3＞化合物5＞化合物4＞化合物6。

3 討論

通過對單針藻的化學成分進行分析，表明單針藻富含多種脂類、烷酸類物質，且具有較強的體外抗菌和抗氧化活性，提示單針藻可作為天然抗菌抗氧化劑的來源，并將在醫藥領域具有廣闊的研究前景。

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Study on Chemical Compounds and in vitro Antibacterial and Antioxidant Activities of Monoraphidium dybowskii

ZHAO Zhenyu，LUO Ning，CHEN Chen，LI Ang，MA Shasha，LIU Jiguang，WANG Meng，LIU Pinghuai（College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University/Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，Ministry of Education，Haikou 570228，China）

OBJECTIVE：To study chemical compounds ofMonoraphidium dybowskii，and to investigate thein vitroantibacterial and antioxidant activities of isolated compounds.METHODS：The ethanol extract ofM.dybowskiiwere extracted with aether petrolei，ethyl acetate and n-butyl alcohol.The ethyl acetate extract was separated fromM.dybowskiiand chemical components were analyzed by sillica gel column chromatogram，HPLC and GC-MS.Their structures were identified according to physicochemical properties and NMR.MIC of 4 isolated compounds toPseudomonas aeruginosa，Candida albicans，Bacillus subtilisandEscherichia coliwere determined by resazurin disc test.Free radical scavenging rate（concluated by IC50）and reducing capacity were measured by 1，1-diphenyl-2-picryl-diazanyl（DPPH）and ferric reducing antioxidant power（FRAP）assay.RESULTS：Compounds 1-6 were obtained from E4 and E5 segments of ethyl acetate extract ofM.dybowskii，and their structures were identified as stigmasterol，diisonoyladipate，indole-3-carboxylic acid，（+）-epiloliolide，（-）-loliolide，5-hydroxy-3，4-dimethy-5-pentyl-2（5H）-furanone. MIC of compounds 3-6 were 10-500μg/mL，and IC50ranged 22.02-71.01μg/mL；FRAP ranged（62.04±5.36）-（281.22±8.3）μmol/L.CONCLUSIONS：M.dybowskiicontains multiple lipid and alkanoic acid，and possesses certainin vitroantibacterial and antioxidant activities.

Monoraphidium dybowskii；Ethyl acetate；Extract；Chemical components；Identification；Antibacterial；Antioxidant

R284.2

A

1001-0408（2017）04-0465-04

2016-06-18

2016-07-16）

（編輯：劉萍）

國家科技支撐計劃項目（No.2011BAD14B01）；國家科技型中小企業技術創新基金項目（No.13C26244604892）；海南省中藥現代化科技專項（No.ZY201327）；海南省產學研一體化項目（No. CXY20150034）

＊碩士研究生。研究方向：天然產物化學、天然藥物、微藻資源開發與利用。電話：0898-66291892。E-mail：1006905863@qq.com

#通信作者：教授，研究員，碩士。研究方向：天然產物化學、天然藥物、微藻資源開發與利用。電話：0898-66291892。E-mail：pinghuailiu@aliyun.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.09