補腎活血化痰湯對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢血供及形態的影響Δ

王瑞杰，李暉，邱方，王自闖（.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 45000；.河南中醫藥大學第二附屬醫院生殖醫學科，鄭州 45000）

補腎活血化痰湯對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢血供及形態的影響Δ

王瑞杰1＊，李暉2，邱方2，王自闖1（1.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450002；2.河南中醫藥大學第二附屬醫院生殖醫學科，鄭州 450002）

目的：探討補腎活血化痰湯對多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠卵巢血供及形態的影響。方法：取SD大鼠（♀）50只隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組[羅格列酮，3 mg/（kg·d）]和補腎活血化痰湯低、高劑量組[5.0、7.5 g/（kg·d）]，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用Poresky法復制PCOS模型。成模后，各給藥組大鼠ig相應藥物，正常對照組和模型組大鼠ig生理鹽水[10 mL/（kg·d）]，每天1次，連續22 d。給藥結束后處死大鼠，記錄微血管密度（MVD），檢測大鼠卵巢組織血管內皮生長因子（VEGF）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1）和2型受體（AT2）以及G蛋白偶聯受體MAS mRNA的表達，并觀察卵巢形態變化。結果：與正常對照組比較，模型組和各給藥組大鼠MVD均升高，AT1、AT2、MAS mRNA表達均下調（P＜0.05）；模型組大鼠卵巢組織可見囊性竇卵泡、顆粒細胞層減少，卵母細胞消失，黃體組織數量減少等明顯病理變化。與模型組比較，各給藥組上述指標均得到顯著改善，且補腎活血化痰湯低、高劑量組作用均強于陽性對照組（P＜0.05）；各給藥組大鼠的卵巢組織病理變化均得到一定改善。結論：補腎活血化痰湯可增加PCOS模型大鼠卵巢組織血供，促進血管生成，促排卵，有助于改善卵巢形態。

補腎活血化痰湯；多囊卵巢綜合征；卵巢形態；卵巢血供；大鼠

多囊卵巢綜合征（PCOS）為育齡期婦女常見內分泌疾病，是引起不孕的重要原因。據報道，PCOS的發生與腎素-血管緊張素系統有明顯關聯[1]。PCOS患者多存在腎素-血管緊張素-雄激素級聯亢進表現，筆者推測這可能與血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、促黃體生成素（LH）水平上調有關。同時，PCOS患者還伴有卵巢及子宮供血障礙，大部分可見卵巢血管內皮生長因子（VEGF）表達增強。

補腎活血化痰湯為河南中醫藥大學第二附屬醫院褚玉霞教授總結臨床經驗而得的驗方，由菟絲子、丹參、熟地黃、仙靈脾、茯苓等11味中藥材組成，具有化痰祛濕、溫腎健脾、調經助孕之效[2]。該方已被證實可改善PCOS患者卵巢局部纖溶狀態、雙向調節女性性腺軸、促進卵泡發育，同時還可促進卵巢組織修復及再生[3]，但其對卵巢血供和形態的影響及其具體作用機制尚未明確。基于此，本研究擬建立PCOS大鼠模型，并給予補腎活血化痰湯進行干預，采用熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測AngⅡ1型受體（AT1）、2型受體（AT2）及G蛋白偶聯受體MAS mRNA在PCOS模型大鼠卵巢組織的表達情況，采用原位雜交法測定PCOS模型大鼠卵巢VEGF mRNA表達，鏡下觀察大鼠卵巢微血管密度（MVD）及形態變化，旨在明確其對PCOS模型大鼠卵巢血管生成、血供及形態的影響及其相關機制。

1 材料

1.1 儀器

Uniwersal 32R型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；DVM5000 HD型高分辨顯微鏡（德國Leica公司）；CX23型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；熒光定量PCR儀（美國應用生物系統公司）。

1.2 藥品與試劑

補腎活血化痰湯（河南中醫藥大學第二臨床醫學院制劑室自制，批號：002345，規格：每1 mL含生藥1 g）；羅格列酮片（成都恒瑞制藥有限公司，批號：030569，規格：4 mg/片）；VEGF原位雜交試劑盒、鏈霉親和素-生物素復合物（SABC）試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：MK1142、SA1053）；引物由上海生工生物工程有限公司提供；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級SD大鼠50只，♀，鼠齡54～60 d，體質量170～210 g，由河南省實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SCKX（豫）2010-0002]。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

實驗前先將大鼠適應性喂養1周，飼養環境溫度為（22±1）℃、濕度為（60±5）%、每小時通風換氣20～22次、壓力梯度設定為20～50 kPa，期間自由飲水，喂顆粒飼料。1周后，將50只大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、陽性對照組[羅格列酮，3 mg（/kg·d）[4]]和補腎活血化痰湯低、高劑量組[5.0、7.5 g（/kg·d），根據體表面積法換算分別為人臨床用量的10、15倍劑量]。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用Poresky法[5]復制PCOS模型，若發現大鼠血胰島素、睪酮（T）水平增加且陰道涂片檢查持續出現角化細胞、失去動情周期，則視為造模成功[6]；造模期間正常對照組大鼠同時ig生理鹽水[10 mL（/kg·d）]。造模后，各給藥組大鼠ig相應藥物溶液，正常對照組和模型組大鼠ig等體積生理鹽水，每天1次，連續22 d。

2.2 卵巢形態觀察及MVD測定

末次給藥后，觀察大鼠陰道涂片結果，動情間期內（參照宮頸黏液結晶法[7]判斷動情周期）禁食不禁水12 h，稱質量，25%烏拉坦麻醉，斷頭處死，游離卵巢。卵巢以4%多聚甲醛固定15 min，常規石蠟包埋，制備10 μm切片，脫蠟、梯度乙醇脫水，蘇木精染色5 min，自來水沖洗，乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液內2 min，脫水透明后封片。光鏡下觀察卵巢形態特點，并選取切片組織5個微血管密集區，鏡下觀察微血管數目，取其均值表示MVD。

2.3 卵巢組織中VEGF mRNA水平測定

采用原位雜交法[8]。配制雜交用液，清洗載玻片。取材，冰凍切片，4%多聚甲醛室溫固定0.5～1.0 h，蒸餾水洗滌，無水甲醇、雙氧水（H2O2）混合，暴露mRNA核酸片段，胃蛋白酶消化，固定、洗滌、預雜交后雜交。VEGF引物序列：上游為5′-GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCA-3′，下游為5′-GCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGC-3′，每張切片加20 μL預雜交液，恒溫箱40℃預雜交3 h；吸棄多余液體，每張切片加20 μL VEGF寡核苷酸探針雜交液，恒溫箱40℃交過夜；洗滌，滴加封閉液，然后依次滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察，VEGF mRNA細胞漿著色呈棕黃色為陽性，無棕黃色反應為陰性，低倍鏡下定位陽性細胞位置，高倍觀察細胞形態、分布。圖像采用BST-20-M全自動圖像分析系統進行處理，以灰度值表示各組VEGF mRNA陽性信號強弱，灰度值越高，表明表達強度越高。

2.4 卵巢組織中AT1、AT2及MAS mRNA水平測定

采用熒光定量PCR法。提取樣本總RNA，進行反轉錄，以反轉錄合成的cDNA為模板，嚴格參照試劑使用說明書操作進行PCR擴增。AT1引物序列：上游為5′-AGTGTGCGCGTTTCATTATGAGTCT-3′，下游為5′-TTAGCTGGTGAGAATGATAAGGAAAGG-3′，產物長度為112 bp；AT2引物序列：上游為5′-GGATGCTCTGACCTGGATGGG-3′，下游為5′-GGAGCCAAGTAATGGGAACTCTAAAC-3′，產物長度為188 bp；MAS引物序列：上游為5′-CTGTCGGGCGGTCATCATCTT-3′，下游為5′-TGTTCTTCCGTATCTTCACCACCAA-3′，產物長度為104 bp；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列：上游為5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，下游為5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3′，產物長度為135 bp。反應體系：REALSYBR Minxture 10μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板2μL。熱循環參數：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、20 s，72℃、27 s，40個循環；72℃、5 min。收集熒光信號，通過各基因與GAPDH相比計算分析最終獲取RQ值（RQ＝2－ΔΔc）t。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠卵巢形態觀察結果

正常對照組大鼠卵巢卵泡結構清晰，可見黃體及不同發育卵泡，卵泡壁可見形態完整、排列緊密的多層顆粒細胞，卵泡膜呈梭形，膜-間質無增生。模型組大鼠卵巢可見囊性竇卵泡，竇腔擴大，顆粒細胞層減少、排列稀松，卵母細胞消失，黃體組織數量減少，伴黃素化，膜細胞增生明顯。陽性對照組大鼠卵巢可見囊性竇卵泡，黃體數量多于模型組，顆粒細胞層增多、形態完整，但排列紊亂。補腎活血化痰湯低劑量組大鼠卵巢組織可見少量囊性竇卵泡，竇腔縮小，黃體組織數量增多，顆粒細胞層增加、細胞形態完整，但排列有些許紊亂。補腎活血化痰湯高劑量組大鼠卵巢組織可見少量囊性竇卵泡，竇腔小，黃體數量少于正常對照組，顆粒細胞層增厚、形態完整、排列緊密。各組大鼠卵巢組織切片圖見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織切片圖（HE染色，×100）Fig 1 Sections of ovarian tissue of rats in each group（HE staining，×100）

3.2 各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測定結果

與正常對照組比較，模型組及各給藥組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達均顯著增強、MVD均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達均顯著減弱，MVD均顯著降低；其中，補腎活血化痰湯低、高劑量組作用優于陽性對照組（P＜0.05），補腎活血化痰湯高劑量組作用略高于低劑量組（P＞0.05）。各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測定結果見表1。

表1 各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測定結果（±s，n＝10）Tab 1 mRNA level of VEGF and MVD in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA水平及MVD測定結果（±s，n＝10）Tab 1 mRNA level of VEGF and MVD in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05

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3.3 各組大鼠卵巢組織中AT1、AT2及MAS mRNA水平測定結果

與正常對照組比較，模型組和各給藥組大鼠卵巢組織AT1、AT2、MAS mRNA表達均顯著減弱（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠上述指標表達均顯著增強；其中，補腎活血化痰湯高、低劑量組作用優于陽性對照組（P＜0.05），補腎活血化痰湯高劑量組作用略高于低劑量組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。各組大鼠卵巢組織AT1、AT2及MAS mRNA水平測定結果見表2。

表2 各組大鼠卵巢組織AT1、AT2及MAS mRNA水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 mRNA level of AT1，AT2 and MAS in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠卵巢組織AT1、AT2及MAS mRNA水平測定結果（±s，n＝10）Tab 2 mRNA level of AT1，AT2 and MAS in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05

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4 討論

近年來，血管生成、供血等在卵巢周期調節中的作用引起了相關研究者的關注。血管生成為正常周期性卵巢的重要功能，卵巢生長、黃體形成均依賴于毛細血管增生，而黃體細胞對膽固醇合成孕酮有關鍵作用，且卵巢優勢卵泡選擇同樣與血管生成密切關聯。卵巢組織血管生成因子不僅調控血管生成，而且還具有內分泌功能，其釋放及合成的自身激素可與細胞受體結合，促進卵泡發育。

唐智華等[9]認為，囊泡及間質血管生成增多是引起PCOS患者排卵障礙或無排卵的重要原因，而VEGF與血管增殖、生成密切相關。VEGF為血管通透因子，有高滲透作用，可促進雄性激素分泌，導致卵巢間質增生。正常育齡期女性黃體、卵泡細胞內均有VEGF表達。卵巢發育過程中，竇狀卵泡、原始卵泡均無獨立毛細血管網，其營養提供來源于附近間質血管，VEGF可通過血供建立、毛細血管生成、毛細血管通透性等方面影響及參與卵泡發育、成熟及排卵過程。研究發現，排卵前VEGF mRNA轉錄增加，同時可與前列腺素發揮協同作用，從而提高微血管通透性，促進膠原酶、纖維原激活物活化，引起排卵過程中卵泡壁破裂，最終導致PCOS的發生[10]。目前，已有報道指出，VEGF可通過自分泌或旁分泌等途徑調控卵巢血管生成過程，且PCOS患者血清、卵巢組織中VEGF mRNA表達均高于正常育齡婦女[11]。本研究發現，PCOS模型大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達也增強，與上述報道相符；而給藥后，各給藥組大鼠卵巢組織中VEGF mRNA表達均減弱。

RAS為激素調節系統，血管緊張素轉化酶-AngⅡ-血管緊張素受體則為RAS系統代謝的關鍵途徑，其中AT1參與血管平滑肌增殖、血管形成、血管收縮調節，AT2受體參與細胞凋亡與生長。前者表達于卵巢間質細胞，后者則主要存在于閉鎖卵泡顆粒細胞。排卵前卵泡顆粒細胞中AT2水平較高，且隨卵泡直徑、質量的上升而增高。AT2存在于各階段卵泡顆粒細胞，調控雌激素合成[12]。MAS則定位于膜細胞、粒細胞內，隨月經周期的變化其表達水平發生改變，在性激素合成、卵母細胞成熟等方面有重要作用。本研究結果顯示，PCOS模型大鼠卵巢組織AT1、AT2、MAS mRNA表達均減弱；給藥后，PCOS模型大鼠卵巢組織AT1、AT2、MAS mRNA基因表達均增強，表明中藥補腎活血化痰湯對卵巢血供具有一定的調節作用。

羅格列酮可通過直接或間接作用于垂體胰島素受體，促排卵、減少卵巢顆粒細胞凋亡、改善卵巢組織形態及血供[13]，故本文選其為陽性對照藥物。本研究發現，羅格列酮雖可改善PCOS大鼠卵巢組織血供及血管生成，有一定的促排卵作用，但藥效不及補腎活血化痰湯顯著。可見，補腎活血化痰湯可改善PCOS大鼠卵巢組織血管生成情況，促進排卵，有助于改善卵巢形態。

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Effects of Bushen Huoxue Huatan Decoction on Ovarian Blood Supply and Form in Polycystic Ovarian Syndrome Model Rats

WANG Ruijie1，LI Hui2，QIU Fang2，WANG Zichuang1（1.Second Clinical College，Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China；2.Dept.of Reproductive Medicine，the Second Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Zhengzhou 450002，China）

OBJECTIVE：To explore the effects of Bushen huoxue huatan decoction on ovarian blood supply and form in model rats with polycystic ovarian syndrome（PCOS）.METHODS：50 SD female rats were randomized into normal control group，model group，positive control group[rosiglitazone，3 mg/（kg·d）]，Bushen huoxue huatan decoction low-dose and high-dose groups[5.0，7.5 g/（kg·d）]，with 10 rats in each group.Except for normal control group，PCOS model was induced in the other groups by Poresky method.After modeling，treatment groups were given relevant medicine intragastrically.The normal control group and model group were given normal saline[10 mL/（kg·d）]intragastrically，once a day，for 22 days.After the end of administration，the rats were sacrificed.The microvessel density（MVD）was recorded.mRNA expression of vascular endothelial growth factor（VEGF），ovarian angiotensinⅡreceptor（AngⅡ）type 1（AT1）and type 2（AT2），G-protein coupled receptor MAS were all detected in ovarian tissue of rats.The ovarian form was observed.RESULTS：Compared with normal control group，MVD of model group and treatment groups were all increased，while mRNA expression of AT1，AT2 and MAS were down-regulated（P＜0.05）；cystic sinus sollicle，the decrease of granular cell layer，egg mother cells disappearance，the decrease of luteal tissue and other obvious pathological changes could be found in ovarian tissue of rats in model group.Compared with model group，above indexes of treatment groups were improved significantly，and the effects of Bushen huoxue huatan decoction low-dose and high-dose groups were better than that of positive control group（P＜0.05）.The pathological changes of ovarian tissue in treatment groups were all improved to certain extent.CONCLUSIONS：Bushen huoxue huatan decoction can improve ovarian blood supply，angiogenesis and ovulation in PCOS rats.It is beneficial to improve ovarian form.

Bushen huoxue huatan decoction；Polycystic ovarian syndrome；Ovarian form；Ovarian blood supply；Rats

R285.5

A

1001-0408（2017）04-0479-04

2016-05-04

2016-12-09）

（編輯：林靜）

河南省教育廳科學技術研究重點項目（No. 13A360579）；全國名老中醫藥專家傳承工作室建設項目（No.〔2014〕-20號）；河南中醫學院博士啟動基金（No.BSJJ2012-21）

＊講師，博士。研究方向：生殖內分泌、不孕不育。電話：0371-60908726。E-mail：wangruijie021@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.13