雙氯芬酸鈉微乳的家兔皮膚刺激性及體外透皮吸收性能評價Δ

魏玉，蘇成福（河南中醫學院藥學院，鄭州 450008）

雙氯芬酸鈉微乳的家兔皮膚刺激性及體外透皮吸收性能評價Δ

魏玉＊，蘇成福（河南中醫學院藥學院，鄭州 450008）

目的：對雙氯芬酸鈉微乳（DS-ME）的性質、皮膚刺激性及體外透皮吸收進行考察，探討其局部外用給藥的可行性。方法：采用紫外分光光度法測定DS-ME中DS的含量；采用激光粒度儀測定DS-ME的粒徑分布；家兔皮膚刺激性實驗考察DS-ME和空白ME對單次給藥正常皮膚、多次給藥正常皮膚和單次給藥破損皮膚的影響；Franz擴散池法比較DS-ME與市售DS凝膠經小鼠離體皮膚的透皮參數。結果：所制DS-ME為O/W型微乳，粒徑為（30.140±9.020）nm；與空白ME比較，DS-ME對家兔皮膚的刺激評分無明顯差異；DS-ME與市售DS凝膠的穩態滲透速率分別為34.16、18.62μg/（cm2·h），滲透系數分別為1.029、0.561 cm/h，滯后時間分別為0.124 2、0.367 2 h。結論：DS-ME的粒徑小，無皮膚刺激性，可提高DS的透皮吸收速率。

雙氯芬酸鈉；微乳；皮膚刺激性；透皮吸收

雙氯芬酸鈉（Diclofenac sodium，DS）為苯乙酸類衍生物，在臨床上主要用于治療各類關節炎癥，但其水溶性較差，對胃腸道有很強的刺激性，患者耐受性差，致使藥物療效降低，限制了該藥在治療骨關節腫痛方面的廣泛使用[1-2]。因此，利用現代制劑技術，可將該藥制成微乳（Microemulsion，ME）劑型進行局部外用給藥，以減少胃腸道刺激，達到避免峰谷效應和提高生物利用度的目的。ME是由水相、油相和雙親性化合物按照一定比例制成的透明或半透明的熱力學穩定的體系。該體系具有穩定性好、粒徑小，可增加難溶性藥物溶解性等優點[3-6]。通過筆者前期研究[7-8]，確定了DS-ME的處方和制備方法，在此基礎上，本文對DS-ME的性質、皮膚刺激性及其離體小鼠透皮吸收性能進行研究，以探討DS-ME局部外用給藥的可行性。

1 材料

1.1 儀器

Mastersize-2000型激光粒度測定儀（英國馬爾文公司）；RYJ-6A Franz型藥物透皮擴散實驗儀（上海黃海藥檢儀器廠）；WFZ UV-2000型紫外-可見分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；FA-1004型電子分析天平（上海恒樂科學儀器有限公司）；HH.SY21-Ni型電熱恒溫水浴箱（北京市長風儀器儀表公司）。

1.2 藥品與試劑

DS對照品（上海化學試劑有限公司，批號：100334-200302，純度：99%）；DS原料藥（河南東泰制藥有限公司，批號：H20055353，純度：99%）；雙氯芬酸二乙胺凝膠（市售DS凝膠，黃石衛生材料藥業有限公司，批號：H20040301，規格：每1 g基質含DS 0.01 g）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，上海運宏化工制劑輔料有限公司，批號：201309）；聚山梨酯80（T80，天津市歐博凱化工有限公司，批號：20120922）；單硬酸甘油酯（天津市四通化工廠，批號：20100423）；十八醇（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：20110808）；丙三醇（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號：20121008）；花生油（河南省星河油脂有限公司）。

1.3 動物

昆明種小鼠，♂，體質量20～25 g；健康成年家兔，♂，體質量2.5～3.0 kg。動物均購于河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2005-0001。

2 方法與結果

2.1 DS-ME處方與制備方法

[7-8]方法制備DS-ME。DS-ME的處方為油相[花生油-單硬脂酸甘油酯-十八醇（8∶2∶1）]占12.14%，乳化劑[T80-RH40（2∶8）]占72.86%，助乳化劑（丙三醇）占15%，載藥量為每1 g基質含DS 0.05 g。按處方比例稱取藥物和輔料于蒸發皿中，置于80水浴上，先將藥物溶解于助乳化劑丙三醇中，再將同條件下加熱混合均勻的油相與乳化劑加入溶解好的藥物中，混合均勻后，在室溫下以300 r/min恒速攪拌，再將水緩慢加到含藥相中至澄清透明，即得DS-ME溶液。

2.2 DS含量的測定

2.2.1 檢測波長的確定 分別取DS對照品溶液、DSME溶液及空白ME溶液適量，于200～600 nm波長范圍內掃描。結果，對照品和DS-ME溶液均在276 nm波長處有最大吸收，空白ME對DS測定無干擾。因此確定276 nm波長為最適檢測波長。

2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取DS對照品50.6 mg，加無水乙醇定容至25 mL量瓶中，搖勻，得2.024 μg/mL DS貯備液。精密量取3 mL貯備液，置于25 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到242.88 μg/mL DS對照品溶液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL DS對照品溶液，置于10 mL量瓶中，用0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）稀釋至刻度，搖勻。以生理鹽水作為參比溶液，采用紫外分光光度法在276 nm波長處測定吸光度。以DS的質量濃度（x）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝0.025x－0.002 9（r＝0.999 8，n＝5）。結果表明，DS檢測質量濃度線性范圍為2.428 8～19.430 4 μg/mL。

2.2.3 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品適量，共6份，按“2.1”項下方法加入一定質量的DS對照品，依法制備成溶液，進樣測定，計算樣品含量和加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of sample recovery test（n＝6）

2.2.4 精密度試驗 取“2.2.2”項下DS對照品溶液適量，連續進樣測定6次，記錄吸光度。結果，DS吸光度的RSD＝1.02%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3 DS-ME的類型鑒定與粒徑檢測

2.3.1 DS-ME的類型鑒定 用染色法鑒定DS-ME的類型[9]。根據紅色的油溶性染料蘇丹紅和藍色的水溶性染料亞甲基藍在所制備的DS-ME中的擴散速度的快慢，判定ME類型。結果顯示，DS-ME中藍色擴散速度快于紅色，表明所制備的DS-ME為O/W（水包油）型。

2.3.2 粒徑檢測 粒徑的分布是判斷所制備的ME是否穩定的重要指標之一[10]。采用激光粒度測定儀對制備的DS-ME進行粒徑檢查。結果顯示，DS-ME的粒徑范圍為（30.140±9.020）nm，粒徑分布見圖1。

圖1 DS-ME的粒徑分布Fig 1 Particle size distribution of DS-ME

2.4 家兔皮膚刺激性實驗

根據文獻[11-13]方法進行家兔皮膚刺激性實驗。

2.4.1 單次給藥正常皮膚刺激實驗 取家兔6只，于給藥前24 h背部去毛（先用電動剃毛剪剪凈，再用脫毛膏脫毛而不損傷皮膚），脫毛面積為2.5 cm×2.5 cm。以空白ME為對照，采用同體積側身對比法，每只家兔脫毛區共6塊，每側各3塊。受試皮膚給予DS-ME，對照組給予空白ME，給藥劑量為每只家兔0.5 g（相當于DS 25 mg，人等效劑量）。觀察給藥后72 h內給藥部位出現紅斑和水腫的情況。

2.4.2 多次給藥正常皮膚刺激實驗 家兔處理與給藥同“2.4.1”項，每天給藥0.5 g，分4次給藥，每次間隔6 h，連續給藥7 d。觀察停藥后72 h內給藥部位出現紅斑和水腫的情況。

2.4.3 單次給藥破損皮膚刺激實驗 家兔處理與給藥同“2.4.1”項，但在給藥前用消毒針頭在脫毛后的皮膚上劃出“#”形擦痕，直徑2 cm，以刺激表皮、有輕度滲血為度。觀察給藥后72 h內給藥部位出現紅斑和水腫的情況。

2.4.4 皮膚刺激強度的判定 對給藥部位有無紅斑和水腫等情況按《皮膚刺激性反應評分標準》[14]進行評分。根據皮膚刺激強度判定公式計算平均積分值，并進行刺激強度評價。皮膚刺激強度判定公式：每只動物平均積分＝紅斑和水腫積分/觀察次數。平均積分在0～0.49時為無刺激，0.5～1.99時為輕度刺激，2.0～5.99時為中度刺激，大于6時為對皮膚有強烈刺激。

2.4.5 結果 單次給藥12 h時內正常皮膚及破損皮膚均微可見紅斑，各時段均無水腫現象，正常皮膚和破損皮膚在各時段的平均積分均為0.4，提示DS-ME及空白ME對正常皮膚及破損皮膚均無刺激性。多次給藥停藥后正常皮膚未出現紅斑、水腫，僅有輕微色素沉著，且48 h后消失，皮膚情況未見異常，提示DS-ME長期使用對皮膚無刺激性。

2.5 體外透皮吸收研究

2.5.1 離體小鼠皮的制備 小鼠脫頸處死后，小心剪去腹部粗毛，涂上脫毛膏，等待5 min左右，刮去脫毛膏及腹部毛，用濕紗布將其擦凈，然后剝取小鼠腹部皮膚，去除皮下脂肪組織，即得離體小鼠皮。用蒸餾水和生理鹽水反復沖洗小鼠皮，直至無渾濁為止。用濾紙吸干水分，鋁箔包裹后置于－20℃冰箱中保存備用。臨用前解凍恢復至室溫，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液漂洗至洗液澄清，用濾紙吸干后備用。

2.5.3 數據處理與結果 DS-ME及市售DS凝膠經小鼠離體皮膚的透皮曲線見圖2。

從圖2可知，DS-ME及市售DS凝膠的Q隨著時間的延長而逐漸增加，呈良好的線性關系。

以Q對透皮時間（t）進行回歸分析，計算穩態滲透速率（Js）、滲透系數（Ps）、滯后時間（Tlag）。DS-ME及市售DS凝膠經小鼠離體皮膚的透皮參數測定結果見表1。

從表1可知，DS-ME的Js為34.16 μg（/cm2·h），是市售DS-ME的1.8倍。此外，將DS制成DS-ME后，每1 g基質載藥量由市售DS凝膠劑型的0.01 g提高到0.05 g，由此表明，將DS制成ME體系后載藥量有較大的提高，這可能是由于ME中的雙親性化合物增加了DS的表觀油水分配系數，使DS的的平衡溶解度增加。

圖2 DS-ME及市售DS凝膠經小鼠離體皮膚的透皮曲線Fig 2 Permeation curves between DS-ME and commercially available DS gel through isolated skin of mice

表1 DS-ME及市售DS凝膠經小鼠離體皮膚的透皮參數測定結果Tab 1 Results of permeation parameters between DSME and commercially available DS gel through isolated skin of mice

3 討論

在ME的形成過程中，隨著水相的加入，ME體系發生轉相，即從開始透明的W/O型ME，然后經歷透明黏稠的液晶區，最后形成透明的O/W型ME[15]。染色法證明了DS-ME所形成的ME類型為O/W型。對DS-ME進行單次正常皮膚、多次正常皮膚及單次破損皮膚刺激性實驗，均未見明顯刺激反應，說明DS-ME外用無明顯的皮膚刺激性。而DS-ME的載藥量較市售DS凝膠有較大提高，說明ME體系可以增加難溶性藥物的溶解度。在體外經皮滲透試驗中，制備的DS-ME累積透皮量較市售DS凝膠增加、Js增快，這可能與ME的表面活性劑和助表面活性劑作為透皮吸收促進劑可減輕角質層的屏障作用、形成高濃度梯度，從而促進擴散的進行、提高了Js有關[16]。綜上所述，本研究為制備刺激性小、載藥量大、生物利用度高的DS新劑型提供了一定的依據。

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Evaluation of Rabbit Skin Irritation and in vitro Transdermal Absorption of Diclofenac Sodium Microemulsion

WEI Yu，SU Chengfu（College of Pharmacy，Henan University of TCM，Zhengzhou 450008，China）

OBJECTIVE：To investigate the property，skin irritation and in vitro transdermal absorption of Diclofenac sodium microemulsion（DS-ME），and to explore the feasibility of local external use of it.METHODS：The content of DS in DS-ME was determined by ultraviolet spectrophotometry.The distribution of particle size was determined by laser particle size analyzer.The effects of DS-ME and blank micro-emulsion on normal skin of single administration，normal skin of multiple administration and damaged skin of single administration were investigated by rabbit skin irritation test.The transdermal parameters of DS-ME and commercially available DS gel through isolated skin of mice were compared by Franz diffusion cell.RESULTS：The prepared DS-ME was O/W microemulsion with particle size of（30.140±9.020）nm.Compared with blank ME，DS-ME had no significant difference in rabbit skin irritation score.Steady permeation rates of DS-ME and commercially available DS gel were 34.16 and 18.62μg/（cm2·h），respectively；the permeation coefficient of them were 1.029 and 0.561 cm/h；the delay time were 0.124 2 and 0.367 2 h.CONCLUSIONS：The particle size of DS-ME is small and not irritant to skin，and can improve transdermal absorption rate of DS.

Diclofenac sodium；Microemulsion；Skin irritation；Transdermal absorption

R943

A

1001-0408（2017）04-0490-04

2016-03-29

2016-05-19）

（編輯：鄒麗娟）

河南省科技攻關項目（No.162102310449）；河南中醫學院“科研苗圃工程”項目（No.MP2015-12）

＊實驗師，碩士。研究方向：中藥活性成分及其制劑。電話：0371-65962746。E-mail：lyixcz@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.16