抗腫瘤藥H6聚合物膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究

潘超，劉會麗，許俊鵬，唐俏欣，萬麗#（.成都中醫藥大學藥學院，成都 637；.四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 6004）

抗腫瘤藥H6聚合物膠束的制備及體外抗腫瘤作用研究

潘超1，2＊，劉會麗2，許俊鵬1，唐俏欣1，萬麗1#（1.成都中醫藥大學藥學院，成都 611137；2.四川大學生物治療國家重點實驗室，成都 610041）

目的：制備抗腫瘤藥H6（內酯類化合物）聚合物膠束，考察其體外抗腫瘤作用。方法：以甲氧基聚乙二醇-聚（ε-己內酯）（mPEG2000-PCL4000）為載藥材料，制備H6/mPEG2000-PCL4000膠束。以粒徑、多分散系數（PDI）和48 h是否產生沉淀為指標篩選處方投料比、H6質量濃度、有機溶劑體積比，檢測所制膠束的包封率和載藥量。采用MTT法檢測所制膠束與H6溶液對人非小細胞肺癌細胞A549、人肺癌細胞H460的毒性。結果：確定處方為投料比為1∶25、H6質量濃度為2 mg/mL、乙醇-氯仿為1∶1（V/V）；所制備的H6/mPEG2000-PCL4000膠束的粒徑為（40.74±0.116 3）nm，PDI為0.101±0.006，包封率為（94.87±0.016 3）%，載藥量為（7.07± 0.001 5）%（n＝3）。膠束和H6溶液對A549細胞的IC50分別為15.62、12.57 nmol/L，對H460細胞的IC50分別為27.68、15.19 nmol/L。結論：成功制得H6/mPEG2000-PCL4000膠束，其具有體外抗腫瘤作用。

抗腫瘤藥H6；mPEG2000-PCL4000；膠束；抗腫瘤作用

H6為四川大學生物治療國家重點實驗室合成的小分子抗腫瘤藥物，分子內含有酰胺及內酯，與其結構相似的化合物有CA4、MPC-6827、香豆素等。前期研究表明H6對多種腫瘤細胞具有抑制作用，且H6具有良好的肺靶向性和低心臟毒性，尤其能劑量依賴性地抑制卵巢腫瘤和乳腺腫瘤的生長，是一個很有前景的抗有絲分裂治療癌癥的化合物[1]。但是由于H6在水中幾乎不溶并且在給藥過程中不穩定，極大地限制了其臨床應用。

聚合物膠束為一種新型的藥物給藥傳遞系統，能夠改善原型藥物的溶解性、降低藥物毒性，而且膠束的疏水性內核為難溶性藥物提供了一個天然載藥環境，使藥物更加穩定[2]。膠束作為藥物載體，具有提高藥物溶解度和安全性、降低毒副作用、增強藥物療效等優點[3-5]。甲氧基聚乙二醇-聚（ε-己內酯）[Monomethoxyl poly（ethyleneglycol）-b-poly（ε-caprolactone），mPEG-PCL]由于具有兩親性且易于合成而成為理想的候選載體，在制備聚合物膠束中被廣泛應用。本文以mPEG2000-PCL4000為載藥材料、H6為原型藥物制備了一種新型的載藥膠束傳遞系統（H6/mPEG2000-PCL4000膠束），并對其進行物理表征和體外抗腫瘤作用研究。H6的化學結構式見圖1。

圖1 H6的化學結構式Fig 1 Chemical structural formula of H6

1 材料

1.1 儀器

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Thermo Heraeus Fresco 17低溫冷凍離心機（美國Thermo Scientific公司）；Waters Alliance高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Malvern ZEN3600激光粒度儀（美國Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

H6原料藥（四川大學生物治療國家重點實驗室自制，批號：20160609，純度：＞98%）；mPEG2000-PCL4000（濟南岱罡生物工程有限公司，批號：Fl121002）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；MTT細胞增殖及細胞毒性測試盒（北京索萊寶科技公司）；DMEM細胞培養基、1640細胞培養基、Tyrpsin胰酶、胎牛血清（美國HyClone公司）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人非小細胞肺癌細胞株A549、人肺癌細胞株H460均購自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），由四川大學華西生物治療國家重點實驗室細胞庫培養保種。

2 方法

2.1 H6/mPEG2000-PCL4000膠束的制備

按投料比稱取H6原料藥和相應質量的mPEG2000-PCL4000于茄形瓶中，加入氯仿-乙醇，室溫下超聲完全溶解，在50℃水浴加熱條件下減壓旋轉蒸發30 min除去有機溶劑成膜，將上述聚合物薄膜置于真空干燥箱中干燥過夜以除去殘留的有機溶劑，加入預熱至55℃的超純水中，55℃水浴中振搖水化成膠束。膠束溶液趁熱過0.22 μm注射式微孔濾膜以除去未包封的藥物，加入15%蔗糖與6%甘露醇作為凍干保護劑，4℃下避光密封保存。

2.2 處方篩選

以粒徑、多分散系數（PDI）和48 h是否產生沉淀（肉眼觀察）為指標，采用單因素試驗對H6/mPEG2000-PCL4000膠束的處方進行篩選。

2.2.1 投料比 按“2.1”項下方法制備膠束，H6用量為5 mg，超純水體積為5 mL，氯仿-乙醇為1∶1（V/V），考察投料比（H6∶mPEG2000-PCL4000，m/m）分別為1∶20、1∶25、1∶30時對膠束的影響。

2.2.2 H6質量濃度 按“2.1”項下方法制備膠束，H6用量為20 mg，投料比為1∶25，氯仿-乙醇為1∶1（V/V），考察超純水體積分別為5、10、20 mL時（H6質量濃度分別為1、2、4 mg/mL）對膠束的影響。

2.2.3 有機溶劑體積比 按“2.1”項下方法制備膠束，H6用量為5 mg，投料比為1∶25，超純水體積為5 mL，考察氯仿-乙醇（V/V）分別為1∶1、1∶2時對膠束的影響。

2.3 質量控制指標測定方法

2.3.1 含量測定 精密量取H6/mPEG2000-PCL4000膠束溶液100 μL，加入900 μL甲醇，超聲，13 000 r/min（離心半徑8.6 cm）離心3 min，取上清液，采用高效液相色譜法按預試驗得出的色譜條件進樣測定，計算H6含量。色譜柱：Sunfire（150 mm×4.6 mm，5μm）;流動相：甲醇-水（70∶30），流速：1 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10 μL；檢測波長：310 nm。按方法學考察本方法的回歸方程、線性范圍、回收率、精密度。

2.3.2 包封率（EE）與載藥量（DL）測定 參考文獻[6-7]方法，采用過濾法分離所制H6/mPEG2000-PCL4000膠束和游離的H6。取過濾后的H6/mPEG2000-PCL4000膠束溶液50 μL，加入950 μL乙腈稀釋，超聲1 min使包封的H6釋放出來，13 000 r/min（離心半徑8.6 cm）離心3 min，取上清液測定H6含量，平行測定3次。按公式EE（%）＝膠束中包載的H6含量/H6的投料量×100%，DL（%）＝膠束中包載的H6含量（/H6的投藥量+mPEG2000-PCL4000的投藥量）×100%計算EE和DL。

2.3.3 粒徑測定 將所制H6/mPEG2000-PCL4000膠束稀釋10倍，設置測定溫度為25℃，采用Malvern激光粒度儀測定粒徑和PDI，測定3次取平均值。

2.4 體外抗腫瘤試驗

2.4.1 細胞培養 取A549和H460細胞分別置于含10%胎牛血清、10 u/mL青霉素、10 μg/mL鏈霉素和10%非必需氨基酸的1640培養基中，于飽和濕度、3℃的5%CO2恒溫培養箱培養。

2.4.2 溶液的制備 以DMSO為溶劑，分別配制質量濃度為1 mg/mL的H6/mPEG2000-PCL4000膠束溶液和質量濃度為10 mg/mL的H6溶液（均以H6計）。

2.4.3 體外抗腫瘤試驗 采用MTT法[8-9]評價H6/ mPEG2000-PCL4000膠束對A549、H460細胞的毒性，以H6溶液為對照。分別收集對數生長期的A549、H460細胞，用培養基稀釋成約3×103個/mL的細胞懸液，每孔100 μL接種到96孔板中，待細胞生長24 h后，每孔加入100 μL含不同濃度（1、10、50、200、500 nmol/L）H6的培養基溶液，每個濃度3個復孔；同時設不加藥物的陰性對照。放入恒溫培養箱中培養48 h，取出，在避光條件下每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養3 h。取出，吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振搖10 min，待藍色結晶充分溶解后，用酶標儀在570 nm波長處測定光密度（OD）[10]。計算細胞抑制率（%）＝（1－加藥孔的測定值/陰性對照孔的測定值）×100%，以及半數抑制濃度（IC50）。

2.5 統計學方法

3 結果

制得H6/mPEG2000-PCL4000膠束為帶黃色乳光的澄清透明溶液。

3.1 處方篩選結果

3.1.1 投料比 投料比為1∶20、1∶25、1∶30時，膠束粒徑分別為40.08、42.58、44.61 nm，PDI分別為0.199、0.121、0.318；除投料比為1∶20時膠束放置24 h未見沉淀、48 h后有顆粒狀沉淀外，其余膠束放置48 h均未見沉淀。這提示隨著投料比增加，膠束更加穩定，但粒徑也略有增大。綜合考慮穩定性好的同時粒徑要小，選擇投料比為1∶25。

3.1.2 H6質量濃度篩選結果 當H6質量濃度為1、2、4 mg/mL時，膠束粒徑分別為42.09、40.74、45.13 nm，PDI分別為0.130、0.101、0.113，放置48 h均未見沉淀。這提示H6質量濃度間的粒徑和PDI差異并不明顯，綜合考慮選擇膠束濃度為2 mg/mL。

3.1.3 有機溶劑體積比篩選結果 當氯仿-乙醇分別為1∶1、1∶2時，膠束粒徑分別為40.74、40.25 nm，PDI分別為0.101、0.236，放置48 h均未見沉淀。這提示隨著乙醇的增加，膠束粒徑和穩定性無明顯變化，但考慮到乙醇含量較高時，在旋蒸過程中消耗的時間會延長，H6易氧化且見光分解，最終選擇乙醇-氯仿為1∶1（V/V）。

3.2 質量控制指標測定結果

3.2.1 方法學考察結果 以峰面積（y）與H6質量濃度（x）進行回歸得回歸方程為y＝23 306x+66 404（r2＝0.999 7），H6檢測質量濃度的線性范圍為0.2～1 000 μg/mL，平均回收率為99.7%（RSD＝0.41%，n＝9），日內RSD＝0.12%（n＝6），日間RSD＝0.27%（n＝6）。

3.2.2 粒徑、包封率及載藥量測定結果 所制H6/ mPEG2000-PCL4000膠束的平均粒徑為（40.74±0.116 3）nm，PDI為0.101±0.157，包封率為（94.87±0.016 3）%，載藥量為（7.07±0.001 5）%（n＝3）。

3.3 體外抗腫瘤活性測定結果

結果顯示，H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對A549、H460細胞均表現出細胞抑制作用，且呈劑量依賴性，隨著H6濃度增加，細胞抑制率增加，其中對A549細胞的抑制作用較強。H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對A549的IC50分別為15.62、12.57 nmol/L，對H460細胞的IC50分別為27.68、15.19 nmol/L。H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對A549、H460細胞抑制率的影響見圖2。

圖2 H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對A549、H460細胞抑制率的影響（n＝3）Fig 2 Inhibition ratio of H6/mPEG2000-PCL4000micelles and H6 solution toA549 cell and H460 cell（n＝3）

4 討論

本實驗成功制備了H6/mPEG2000-PCL4000膠束，并對其理化性質進行了一系列的表征；體外抗腫瘤活性表明，H6/mPEG2000-PCL4000膠束與H6溶液具有相同活性。

本研究發現，H6/mPEG2000-PCL4000膠束的包封率和載藥量不是很高，提示mPEG2000-PCL4000材料對H6的包合效果不是很理想，筆者后期會嘗試其他類型的聚合物載體；另外，本文中有機溶劑用到了氯仿，雖然已通過長時間真空干燥來除去，但是氯仿毒性較強，后期會嘗試采用二氯甲烷來代替氯仿。

H6/mPEG2000-PCL4000膠束和H6溶液對A549、H460細胞均有抑制作用。H460細胞中，H6/mPEG2000-PCL4000膠束的IC50相比H6溶液略大，可能是由于膠束溶液具有一定的緩釋效應，降低了藥物在細胞周圍的濃度，從而降低了藥物對細胞的抑制作用。對于A549細胞，H6/ mPEG2000-PCL4000膠束的IC50與H6溶液相差不大。綜上所述，H6/mPEG2000-PCL4000膠束很好地保持了H6的抗腫瘤活性。

下一步，筆者還需對H6/mPEG2000-PCL4000膠束的體內藥動學進行研究，考察其在體內的吸收代謝情況；而且要對其組織分布進行研究，驗證H6/mPEG2000-PCL4000膠束載藥系統在體內的靶向分布情況。

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（編輯：鄒麗娟）

Study on Preparation of Anti-tumor Drug H6 Polymeric Micelles and Their in vitro Anti-tumor Effects

PAN Chao1，2，LIU Huili2，XU Junpeng1，TANG Qiaoxin1，WAN Li1（1.School of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China；2.State Key Lab of Biotherapy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

OBJECTIVE：To prepare anti-tumor drug H6（lactone compound）polymeric micelles，and to investigate itsin vitroanti-tumor effects.METHODS：Using mPEG2000-PCL4000as carrier，H6/mPEG2000-PCL4000micelles were prepared.Using particle size，PDI and 48 h whether to produce precipitation as indexes，feeding ratio，H6 concentration，volume ratio of organic solvent were screened.The encapsulation efficiency and drug-loading amount of micelle were all detected.MTT assay was used to detect the tox-icity of micelles and H6 solution to human non-small cell lung cancer cell A549 and human lung cancer cell H460.RESULTS：The screened formulation was as follows as feeding ratio of 1∶25，H6 concentration of 2 mg/mL，the ratio of ethanol to chloroform of 1∶1（V/V）.The parameters of prepared H6/mPEG2000-PCL4000micelles were as follows as particle size of（40.74±0.116 3）nm，PDI of（0.101±0.006），encapsulation efficiency of（94.87±0.016 3）%，drug-loading amount of（7.07±0.001 5）%（n＝3）.IC50of micelles and H6 solution to A549 cell were 15.62 and 12.57 nmol/L；IC50of micelles and H6 solution to H460 cell were 27.68 and 15.19 nmol/L.CONCLUSIONS：H6/mPEG2000-PCL4000micelles are prepared successfully and show in vitro anti-tumor effects.

Anti-tumor drug H6；mPEG2000-PCL4000；Micelles；Anti-tumor effect

R943

A

1001-0408（2017）04-0533-04

2016-08-22

2016-11-11）

＊碩士研究生。研究方向：中藥有效成分分析。電話：028-61800231。E-mail：1335126865@qq.com

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：藥物分析、中藥有效成分及質量標準研究。電話：028-61800231。E-mail：wanli8801@163. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.04.28