過氧化物酶體增殖物激活受體2及其磷酸化形式在脂肪干細胞脂向分化過程中的表達

周 煒 張 駿 凡 進 殷國勇

(南京醫科大學第一附屬醫院骨科，江蘇 南京 210029)

過氧化物酶體增殖物激活受體2及其磷酸化形式在脂肪干細胞脂向分化過程中的表達

周 煒 張 駿1凡 進 殷國勇

(南京醫科大學第一附屬醫院骨科，江蘇 南京 210029)

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)2及其磷酸化形式在脂肪干細胞脂向分化過程中的表達。方法 采用組織塊貼壁法培養脂肪干細胞，對第3代細胞進行脂向分化誘導，應用Western印跡檢測誘導不同時間的PPARγ2非磷酸化及其磷酸化形式表達，RT-PCR檢測誘導不同時間的PPARγ2 mRNA表達。結果 隨著脂向分化誘導時間的增長，PPARγ2的非磷酸化與磷酸化形式的相對表達量明顯增加，PPARγ2 mRNA相對表達量呈逐漸遞增的趨勢(P<0.05)，其中第7、9天達到峰值差異比較無統計學意義(P>0.05)。結論 PPARγ2在脂肪干細胞脂向分化過程中起著重要作用，作用機制可能是通過自身的磷酸化來促進脂向分化。

脂肪干細胞；過氧化物酶體增殖物激活受體2

現階段軟組織缺損是臨床亟需解決的難題，而脂肪組織工程為軟組織的修復重建開辟了新的思路，已成為目前臨床研究的重要方向。脂肪組織工程需要有合適的種子細胞，而脂肪干細胞來源豐富且具有多項分化能力和較強的增殖能力，已成為脂肪組織工程的理想種子細胞〔1〕。但是目前脂肪干細胞的成脂分子機制尚不明確，進而使組織工程化脂肪的構建受阻。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)2是體外及體內形成脂肪的必須轉錄因子，在脂肪酸代謝及脂肪細胞發育過程中的作用顯著〔2〕。有研究發現通過成體干細胞模型進行脂向分化實驗將研究結果轉變為臨床研究的效果較好〔3〕。本研究旨在探討PPARγ2及其磷酸化形式在脂肪干細胞脂向分化過程中的表達意義。

1 材料與方法

1.1 材料 8只14 d的綠色熒光蛋白轉基因小鼠由中科院上海藥物研究所提供；胎牛血清(FBS)購于美國Hyclone公司；0.25%乙二胺四乙酸(ETDA)及二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量測定試劑盒購于美國Gibco公司；胰島素、地塞米松磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購于美國Sigma公司；2×Pfu PCR Master Mix、One Step RNA PCR Kit及柱式小量RNA抽提試劑盒購于日本TaKaPa公司；PCR儀購于美國GE公司；小鼠Anti-PPARγ2單克隆抗體及小鼠Anti-PPARγ2 phosphoSer112單克隆抗體均購于美國Pierce公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG及TRITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購于北京中衫金橋公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂肪干細胞提取和培養 小鼠頸椎脫臼后75%酒精浸泡5 min，分離腹股溝脂肪組織并剪碎，貼于培養皿(6 cm)中，組織基本貼壁后加入含10%FBS、改良型α-MEM及100 U/ml的鏈霉素及青霉素的培養基，置于5% CO2，37℃的培養箱中培養，每3天更換1次培養基。當貼壁細胞融合至80%時使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，1×105/ml細胞數目接種繼續培養。

1.2.2 脂肪干細胞脂向分化誘導 待細胞融合至80%左右時對第3代干細胞給予脂向誘導分化，培養基主要含有10%FBS、改良型α-MEM、0.5 mmol/L的1，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10-5mol/L胰島素、10-6mol/L地塞米松磷酸鈉、0.2 mmol/L吲哚嘌呤，并將未誘導分化的干細胞作對照組。分別于誘導后第3、6天給予半量換液。所有樣本量均3個復孔，于顯微鏡下觀察細胞質脂滴形成情況和細胞形態，并于誘導5 d后行油紅O染色，鑒定脂向誘導情況。

1.2.3 Western印跡檢測 分別提取誘導0、1、3、5、7、9 d的細胞蛋白，BCA蛋白含量試劑盒對總蛋白含量進行測定。對30 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，小鼠抗-PPARγ2單克隆抗體及小鼠抗-PPARγ2 phosphoSer112單克隆抗體為一抗，HRP標記山羊抗小鼠IgG為二抗，使用化學發光法對免疫復合物及美國Gel Doc XR系統拍攝結果。利用Quantity-One 4.6.2軟件分析PPARγ2及其磷酸化形成的蛋白表達情況及其條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.4 RT-PCR半定量檢測 分別對0、1、3、5、7、9 d的脂肪干細胞RNA進行提取誘導。依據反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄為cDNA，具體RT條件：30 min 50℃，5 min 95℃，10 min 4℃。以1 μl cDNA為模板添加1 μl上、下游引物、10 μl 2×Pfu PCR Master Mix，補齊ddH2O至20 μl后行PCR反應，具體條件：3 min 94℃；30 s 94℃，65℃30 s(每2個循環降低1℃)，1 min 72℃，20個循環；30 s 94℃，30 s 55℃，1 min 72℃，20個循環；5 min 72℃；5 min 4℃。對5 μl Marker及6 μl PCR產物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V進行30 min，結束后采用凝膠成像系統拍攝電泳結果，并分析PPARγ2的表達水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件進行方差分析、LSD檢驗。

2 結 果

2.1 脂肪干細胞形態學觀察 油紅O可觀察到，在條件誘導培養基下，隨著誘導時間的增長，脂滴逐漸融合變大，脂滴呈橙紅色，見圖1。

圖1 油紅O染色觀察(×100)

2.2 半定量RT-PCR結果 隨著脂向分化誘導時間的增長，PPARγ2 mRNA相對表達量呈逐漸遞增的趨勢(P<0.05)，0 d：0.102±0.002，1 d：0.124±0.006,3 d:0.201±0.005,5 d:0.301±0.022,7 d:0.368±0.012,9 d:0.387±0.011,其中第7天和第9天差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 誘導不同時間PPARγ2 mRNA表達

2.3 Western印跡結果 隨著脂向分化誘導時間的增長，PPARγ2的非磷酸化與磷酸化形式的相對表達量明顯增加(P<0.05)，見表1，圖3。

時間非磷酸化PPARγ2PPARγ20d0.562±0.0640.212±0.0411d0.682±0.0321)0.401±0.0211)3d0.832±0.1021)0.703±0.0741)5d1.211±0.1041)1.031±0.2211)7d1.403±0.1201)1.134±0.1501)9d1.603±0.1351)1.230±0.1511)F/P值7.302/<0.056.891/<0.05

與0 d比較：1)P<0.05

圖3 PPARγ2的磷酸化與非磷酸化形式的Western印跡檢驗

3 討 論

肥胖的產生因素較多，脂肪細胞增大是重要原因。此外，脂肪細胞數目的增加也是導致肥胖的重要因素，而存在于脂肪組織內多潛能干細胞的脂向分化是脂肪細胞數目增多的重要來源，并且于相關因素的刺激下，骨髓間充質干細胞等其他器官的干細胞也可募集到脂肪組織分化為脂肪細胞〔4，5〕。脂肪細胞的分化可分為多能干細胞、前脂肪細胞及脂肪細胞3個階段〔6〕。現階段對于脂肪細胞分化的研究主要集中于小鼠前脂肪細胞到成熟脂肪細胞階段，脂肪細胞的調節機制也是目前研究的重要方向。

PPARγ2被認為是脂肪分化的重要轉錄調節因子。脂肪細胞中最具有代表性的PPAR目的基因是脂肪酸結合蛋白基因，其含有一個典型的PPAR/視黃醇X受體結合位點〔7〕。PPAR可通過此結合位點與配體直接結合、調節磷酸化狀態及熱休克蛋白結合配體方式激活，進而與RXR形成異二聚體，復合物中RXR能與目的基因的PPAR反應元件相互作用，進行目的基因的轉錄及表達相關研究〔8～10〕發現PPARγ2的異常表達可使成肌細胞、前脂肪細胞及成纖維細胞進行脂向分化，增強子CCAAT結合蛋白α于PPARγ2缺失的條件下無法誘導脂向分化，但PPARγ2可在增強子CCAAT結合蛋白α缺失的條件下誘導脂向分化，還可誘導多種脂肪細胞特異基因的表達。本研究結果充分說明PPARγ2為脂肪分化的重要轉錄因子，在脂肪分化的過程中地位顯著。

本研究發現未分化的脂肪干細胞的PPARγ2及其磷酸化形式存在弱表達，與Lynch等〔11〕的研究相符。項芬芬等〔12〕的研究發現，未分化的骨髓充質干細胞也存在PPARγ2及其磷酸化形式存在弱表達。PPARγ含磷蛋白質，與其他細胞核受體相似，其轉錄活性與磷酸酶及激酶的交互作用影響較大，但PPARγ通過磷酸化調節的活性較復雜并存在爭議。PPARγ2及其磷酸化蛋白與脂肪干細胞脂向分化關系主要有以下兩點〔13，14〕：(1)PPARγ的磷酸化可被MAPK家族中的JNK、ERK同時作用，通過激活MAPK通路磷酸化PPARγ，并降低其轉錄活性進而抑制脂向分化；(2)112位絲氨酸無法被磷酸化的突變體中，PPARγ可幫助細胞抵抗有絲分裂源誘發的脂向分化抑制。但是，不是所有的磷酸化均可抑制脂肪分化。高濃度血清可增加PPARγ及其磷酸化形式的表達，進而促進脂向分化。

此外，胰島素處理可促進PPARγ及其磷酸化形式的表達，并增加配體依賴性的PPARγ轉錄活性和增強TZD誘導的PPARγ轉錄激活功能。本研究結果提示PPARγ可能是通過自身磷酸化而加強脂向分化。

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3 李冬梅，史 勇，楚洪波，等.低劑量硝酸鑭對糖尿病大鼠脂肪組織中過氧化物酶體增殖物激活受體-γ和葡萄糖轉運蛋白4表達的影響〔J〕.環境與健康雜志，2014；31(2)：104-6.

4 徐 凱，王效京，劉 宏，等.過氧化物酶體增殖物激活受體α在豬肝臟組織中發育性表達研究〔J〕.中國畜牧獸醫，2014；41(10)：178-82.

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12 項芬芬，張學梅，馬 艷，等.作用于過氧化物酶體增殖物激活受體藥物的研究進展〔J〕.生命科學研究，2015；19(4)：372-6.

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14 章 琳，楊渭臨.過氧化物酶體增殖物激活受體在肺纖維化中的作用〔J〕.國際呼吸雜志，2014；34(4)：310-4.

〔2016-10-09修回〕

(編輯 滕欣航)

國家自然科學基金(No.81401800)

殷國勇(1965-)，男，博士，主任醫師，主要從事骨科及脊柱臨床與基礎研究。

周 煒(1982-)，男，博士在讀，副主任醫師，主要從事骨科、脊柱外科臨床與基礎研究。

R3

A

1005-9202(2017)06-1304-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.002

1 浙江省人民醫院骨科